酵素結合免疫吸着アッセイ用エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォーム

個々の液滴の活性化を自動化することで、実験室単位操作の複雑なシーケンスを1チップに持ち込めます。当社のデジタルマイクロ流体プラットフォームは、ウイルス病原体の迅速な特異的なインフィールド検出に取り組んでいます。この方法は、EWODベースのデジタルマイクロ流体を磁気免疫沈降と組み合わせて使用した特異的抗原の定量的検出に基づいています。

この寄与において、この方法は、細菌、胞子、ウイルス、およびタンパク質の様々な濃度を含むサンプルに対して評価される。このプロセスは、完全に自動化され、順次に、スケーラブルで、多目的です。滴容積の順序およびは特定の議定書の条件に合うように変更することができる。

抗体ベースのセンシングを完全に踏み外し、デジタルマイクロ流体プラットフォームは、磁気ビーズがヌクレオチド配列の捕捉および検出のための特定のアプタマーを運ぶアプタマーバイオセンシングに基づいて潜在的なアプリケーションに構築することができます。この技術を初めて試す際には、界面活性剤の種類と、それが生化学と疎水性ポリマーコーティングの選択とどのように相互作用するかを考慮することが重要です。まず、デジタルマイクロ流体またはDMFプラットフォームから磁石を取り外し、ベンチに置きます。

回転ステージにクリーンな作動プレートを置き、クロムを上向きにして、プレートを凹んだステージの左上隅に合わせます。47個のコンタクトピンを使用して上から作動プレートをクランプすると、プレートが所定の位置に固定され、接触ピンとの位置合わせが容易になります。その後、0.5ミリメートルシムと2ミリメートルPMMAセパレータを回転ステージにプレートし、作動プレートとカバープレートの間に制御されたギャップを提供します。

提案されたローディングパッドに液滴をロードするために、ランニングバッファからB、A、R、およびEの上に4つの2.5マイクロリットルの液滴を、パッドあたり1滴を使用して示されたパッドにアリコートする。次に、E表記のパッド上に2.5マイクロリットルのルミノール過酸化水素溶液をアリコートした。次に、ニュートラビジンのアリコート2.5マイクロリットルがHRPに共役し、F、G、およびIにそれぞれパッドを示した。

最後に、未知のサンプルのアリコート2.5マイクロリットルをC表記パッドに取り付ける。カバープレートを丸い凹部の横のリグの表面に置き、それを休憩部と作動プレートの上に横方向にスライドさせます。永久磁石をカバープレートの上に置き、2つのラッチをスライドさせて固定し、ステージを180度回転させて視覚的に検査し、ロードされた液滴がまだ所定の位置に残っていることを確認します。

各液滴の荷重位置が、ソフトウェアのプログラムされた作動シーケンスと一致することを確認します。スクリーニングされた光検出器缶を回転ステージのスロットに配置し、ケーブルを接続します。DMFプラットフォーム上に蓋を置き、ソフトウェアインターフェイスを使用してプログラムシーケンスを開始します。

ドロップレットの位置は容量性センシングによって記録され、ユーザーインターフェイスで観察することができる。プログラムシーケンスは、ルミノール液滴が抽出された磁気ビーズを収集する準備ができているか、検出液滴が検出部位に移動する準備ができていることをオペレータに知らせるために、インターフェイスに表示されるメッセージをプロンプトします。どちらの場合も、オペレータからの確認を続行する必要があります。

化学発光反応によって生成される光強度は、光検出器によって読み取られ、リアルタイムで記録されます。プロトコルの最適化のためにビジュアルモードで動作するには、ソフトウェアインターフェイスを使用してプログラムシーケンスを開始します。自動液滴作動は、ビーズの磁気抽出、ビーズの再懸濁液および混合など、重要なアッセイステップのそれぞれについてチップ上で視覚化することができます。

プロンプトが表示されたら、スクリーニングされた光検出器缶を回転ステージのスリットに取り付けます。ソケットにピンを挿入して、スクリーニング缶の光検出器のケーブルを接続します。DMFプラットフォームの上に蓋を置き、アッセイを再開します。

液滴は容量性センシングによって監視され、ユーザーインターフェイスで観察することができる。装置をクリーニングするには、DMF プラットフォームの蓋を開けて、ステージを 180 度回転させます。磁石ケースを外し、回転段階から磁石を取り外します。

ピンセットでシリコンウエハースをスリップから取り出し、蒸留水ですすります。その後、圧縮空気でそれを乾燥させ、ウエハーを保存し、再利用することができるペトリ皿に置きます。マイクロピペットを使用して、表面に触れることなくパッドから液体廃棄物を除去し、吸収性紙を使用して作動板から液体を吸着させることで表面をきれいにします。

作動電圧衝撃を調べるため、バッファからの液滴を様々な作動電圧で駆動し、その動きを記録しました。Vrmsと平均速度の相関が実証され、あるVrms値の後に速度高原が観察された。Vrmsの高い値を使用すると、作動プレートの寿命が短縮されました。

抽出検査室のユニット操作の場合、懸濁ビーズを含む液滴を混合ゾーンの中央の分離部位に駆動した。その後、磁石はチップに近づき、ビーズに焦点を合わせるために自動的に活性化されました。次に、液滴を廃棄物パッドに向かって移動させ、ビーズを残した。

EWODチップ上での抽出および混合実験室ユニットの操作により、6~10分で病原体を連続的に検出した、迅速かつ再現可能なサンプル処理が容易となった。インキュベーション時間およびコンジュゲート濃度を変化させてアッセイに最適な条件を見つけた。160秒のインキュベーション時間と1ミリリットル当たり2マイクログラムの共役濃度が、最高のシグナル対雑音比を達成したことがわかった。

プロトコルのバリエーションは、オートメーションの所望のレベルを達成するために導入することができます。8段階のELISAを用いて、バチルス・アトロファエウス胞子およびMS2バクテリオファージなどの異なる抗原を検出した。一方、10段階のプロトコルを使用して大腸菌を定量化した。

印加された電圧、検体および試薬の濃度が、液滴の活性化およびチップ上の磁気分離の成功に最適であることを確認することが重要です。正確な測定を達成するためには、ビーズ結合能力を考慮し、検体の連続希釈が必要となる可能性があります。抗体の種類を交換することで、結果セクションで報告されたものとは異なる病原体を検出することができます。

この方法は、例えばバイオマーカー検出やケアポイント診断にも適用できます。既に提示されたアプリケーションに加えて、システムは、心の中で空気中病原体のフィールド内検出を開発されています。DMFは、液滴の容積が最近開発した他のサンプラーの出力と一致するため、このアプリケーションにとって理想的なプラットフォームです。