酵素結合免疫吸着アッセイ用エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォーム
February 23rd, 2020
エレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体は、マイクロリットル体積液滴の見かけの接触角の電圧駆動変化を利用して、その操作を容易にする技術です。これを機能化された磁気ビーズと組み合わせることで、酵素結合免疫測定アッセイ(ELISA)を用いた複数の実験ユニット操作を組み合わせて、サンプル調製と病原体の同定を可能にします。
個々の液滴の活性化を自動化することで、実験室単位操作の複雑なシーケンスを1チップに持ち込めます。当社のデジタルマイクロ流体プラットフォームは、ウイルス病原体の迅速な特異的なインフィールド検出に取り組んでいます。この方法は、EWODベースのデジタルマイクロ流体を磁気免疫沈降と組み合わせて使用した特異的抗原の定量的検出に基づいています。
この寄与において、この方法は、細菌、胞子、ウイルス、およびタンパク質の様々な濃度を含むサンプルに対して評価される。このプロセスは、完全に自動化され、順次に、スケーラブルで、多目的です。滴容積の順序およびは特定の議定書の条件に合うように変更することができる。
抗体ベースのセンシングを完全に踏み外し、デジタルマイクロ流体プラットフォームは、磁気ビーズがヌクレオチド配列の捕捉および検出のための特定のアプタマーを運ぶアプタマーバイオセンシングに基づいて潜在的なアプリケーションに構築することができます。この技術を初めて試す際には、界面活性剤の種類と、それが生化学と疎水性ポリマーコーティングの選択とどのように相互作用するかを考慮することが重要です。まず、デジタルマイクロ流体またはDMFプラットフォームから磁石を取り外し、ベンチに置きます。
回転ステージにクリーンな作動プレートを置き、クロムを上向きにして、プレートを凹んだステージの左上隅に合わせます。47個のコンタクトピンを使用して上から作動プレートをクランプすると、プレートが所定の位置に固定され、接触ピンとの位置合わせが容易になります。その後、0.5ミリメートルシムと2ミリメートルPMMAセパレータを回転ステージにプレートし、作動プレートとカバープレートの間に制御されたギャップを提供します。
提案されたローディングパッドに液滴をロードするために、ランニングバッファからB、A、R、およびEの上に4つの2.5マイクロリットルの液滴を、パッドあたり1滴を使用して示されたパッドにアリコートする。次に、E表記のパッド上に2.5マイクロリットルのルミノール過酸化水素溶液をアリコートした。次に、ニュートラビジンのアリコート2.5マイクロリットルがHRPに共役し、F、G、およびIにそれぞれパッドを示した。
最後に、未知のサンプルのアリコート2.5マイクロリットルをC表記パッドに取り付ける。カバープレートを丸い凹部の横のリグの表面に置き、それを休憩部と作動プレートの上に横方向にスライドさせます。永久磁石をカバープレートの上に置き、2つのラッチをスライドさせて固定し、ステージを180度回転させて視覚的に検査し、ロードされた液滴がまだ所定の位置に残っていることを確認します。
各液滴の荷重位置が、ソフトウェアのプログラムされた作動シーケンスと一致することを確認します。スクリーニングされた光検出器缶を回転ステージのスロットに配置し、ケーブルを接続します。DMFプラットフォーム上に蓋を置き、ソフトウェアインターフェイスを使用してプログラムシーケンスを開始します。
ドロップレットの位置は容量性センシングによって記録され、ユーザーインターフェイスで観察することができる。プログラムシーケンスは、ルミノール液滴が抽出された磁気ビーズを収集する準備ができているか、検出液滴が検出部位に移動する準備ができていることをオペレータに知らせるために、インターフェイスに表示されるメッセージをプロンプトします。どちらの場合も、オペレータからの確認を続行する必要があります。
化学発光反応によって生成される光強度は、光検出器によって読み取られ、リアルタイムで記録されます。プロトコルの最適化のためにビジュアルモードで動作するには、ソフトウェアインターフェイスを使用してプログラムシーケンスを開始します。自動液滴作動は、ビーズの磁気抽出、ビーズの再懸濁液および混合など、重要なアッセイステップのそれぞれについてチップ上で視覚化することができます。
プロンプトが表示されたら、スクリーニングされた光検出器缶を回転ステージのスリットに取り付けます。ソケットにピンを挿入して、スクリーニング缶の光検出器のケーブルを接続します。DMFプラットフォームの上に蓋を置き、アッセイを再開します。
液滴は容量性センシングによって監視され、ユーザーインターフェイスで観察することができる。装置をクリーニングするには、DMF プラットフォームの蓋を開けて、ステージを 180 度回転させます。磁石ケースを外し、回転段階から磁石を取り外します。
ピンセットでシリコンウエハースをスリップから取り出し、蒸留水ですすります。その後、圧縮空気でそれを乾燥させ、ウエハーを保存し、再利用することができるペトリ皿に置きます。マイクロピペットを使用して、表面に触れることなくパッドから液体廃棄物を除去し、吸収性紙を使用して作動板から液体を吸着させることで表面をきれいにします。
作動電圧衝撃を調べるため、バッファからの液滴を様々な作動電圧で駆動し、その動きを記録しました。Vrmsと平均速度の相関が実証され、あるVrms値の後に速度高原が観察された。Vrmsの高い値を使用すると、作動プレートの寿命が短縮されました。
抽出検査室のユニット操作の場合、懸濁ビーズを含む液滴を混合ゾーンの中央の分離部位に駆動した。その後、磁石はチップに近づき、ビーズに焦点を合わせるために自動的に活性化されました。次に、液滴を廃棄物パッドに向かって移動させ、ビーズを残した。
EWODチップ上での抽出および混合実験室ユニットの操作により、6~10分で病原体を連続的に検出した、迅速かつ再現可能なサンプル処理が容易となった。インキュベーション時間およびコンジュゲート濃度を変化させてアッセイに最適な条件を見つけた。160秒のインキュベーション時間と1ミリリットル当たり2マイクログラムの共役濃度が、最高のシグナル対雑音比を達成したことがわかった。
プロトコルのバリエーションは、オートメーションの所望のレベルを達成するために導入することができます。8段階のELISAを用いて、バチルス・アトロファエウス胞子およびMS2バクテリオファージなどの異なる抗原を検出した。一方、10段階のプロトコルを使用して大腸菌を定量化した。
印加された電圧、検体および試薬の濃度が、液滴の活性化およびチップ上の磁気分離の成功に最適であることを確認することが重要です。正確な測定を達成するためには、ビーズ結合能力を考慮し、検体の連続希釈が必要となる可能性があります。抗体の種類を交換することで、結果セクションで報告されたものとは異なる病原体を検出することができます。
この方法は、例えばバイオマーカー検出やケアポイント診断にも適用できます。既に提示されたアプリケーションに加えて、システムは、心の中で空気中病原体のフィールド内検出を開発されています。DMFは、液滴の容積が最近開発した他のサンプラーの出力と一致するため、このアプリケーションにとって理想的なプラットフォームです。
概要
この研究は、ウイルス性病原体の迅速な検出のためのエレクトロウェッティングベースのデジタルマイクロ流体プラットフォームを提示します。この方法は、磁性免疫沈降と自動化された液滴操作を統合し、効率的なサンプル処理を可能にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- マイクロ流体工学
- 病原体検出
- 自動化された実験室プロセス
背景
- 誘電体上エレクトロウェッティング（EWOD）技術は、正確な液滴制御を可能にします。
- 磁性ビーズは検出方法の感度を高めることができます。
- 酵素結合免疫吸着法（ELISA）は、病原体同定の一般的な技術です。
- マイクロ流体工学の自動化は、実験室のワークフローを効率化できます。
研究目的
- 病原体検出のための完全に自動化されたデジタルマイクロ流体プラットフォームを開発すること。
- 様々な病原体に対するプラットフォームの性能を評価すること。
- 検出感度の向上のためにアッセイ条件を最適化すること。
使用された方法
- EWOD技術を使用した自動化された液滴操作。
- サンプル調製のための磁性免疫沈降。
- 液滴の動きとアッセイの進行のリアルタイムモニタリング。
- インキュベーション時間と試薬濃度の最適化。
主な結果
- プラットフォームは、様々な濃度の病原体を成功裏に検出しました。
- 最適な条件は、160秒のインキュベーション時間と2 µg/mLの結合体濃度であることが分かりました。
- 自動化されたプロセスにより、アッセイ時間は6-10分に短縮されました。
- 容量性センシングを通じて、液滴操作の視覚的モニタリングが達成されました。
結論
- デジタルマイクロ流体プラットフォームは、迅速な病原体検出に効果的です。
- 自動化は、実験室アッセイの再現性と効率性を向上させます。
- 将来の応用には、アプタマーベースのバイオセンシング技術が含まれる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This electrowetting-based digital microfluidic platform enables rapid, automated ELISA for pathogen detection, reducing assay time to 6-10 minutes with minimal reagent volumes. The integration of magnetic immunoprecipitation and real-time monitoring supports high-throughput screening and reproducible results, addressing bottlenecks in early-stage target validation and assay development. Its scalability and adaptability to various antigens enhance predictive confidence in lead identification and preclinical triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative antigen detection across bacteria, spores, viruses, and proteins.
- Operational Value: Supports biological de-risking by providing reproducible, miniaturized sample processing with consecutive detection steps.
- Predictive Value: Optimized conditions (160-second incubation, 2 µg/mL conjugate) improve signal-to-noise ratio, aiding portfolio decisions based on robust functional data.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems via magnetic bead-based antigen capture, enabling downstream screening applications.
- Operational Value: Ensures assay standardization through automated droplet actuation and capacitive sensing, enhancing reproducibility across runs.
- Scalability: Microfluidic design allows reagent conservation and platform reuse, supporting scalable compound evaluation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery to preclinical validation through consistent, quantitative pathogen detection in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target engagement by isolating antigen-antibody interactions on a controlled microfluidic interface.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions via rapid, multiplexed pathogen quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The platform integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical work, supporting hypothesis testing and assay readiness.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification via quantitative detection of specific antigens using EWOD and magnetic immunoprecipitation.
- Screening: Delivers assay readiness through automated, sequential droplet manipulation and real-time monitoring of critical steps like bead extraction and mixing.
- Analytics: Provides quantitative chemiluminescent readouts via photodetector, enabling comparison of antigen concentrations and assay conditions.
- Translational Research: Supports preclinical continuity by generating reproducible pathogen detection data adaptable to biomarker applications.
- Enterprise Reuse: Designed as a modular, scalable platform for repeated use across multiple targets and pathogen types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through precise, quantitative antigen detection.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via automated droplet control and minimal reagent consumption.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced biological risk in early development.
- Portfolio Impact: Risk-based prioritization enabled by rapid, multiplexed pathogen profiling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics, immunassay design, and surface chemistry optimization.
- Needs EWOD actuation hardware, magnetic actuation system, photodetector for chemiluminescence, and software for sequence control.
- Demands cross-team standardization of droplet volumes, surfactant compatibility, and hydrophobic coating selection.
- Requires adaptation considerations when switching antibody types or applying to aptamer-based biosensing.
- Practical limitations include voltage-dependent actuation longevity and the need for optimal surfactant-biochemistry-polymer interactions.
