iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

このマウント全体は、その一方でのハイブリダイゼーションで、WISHは従来の方法と比較して高解像度と低いバックグラウンド結果を提供します。また、Uスライドプレートは、マウス胚、ショウジョウバエ胚および他の組織に適用できる願い物を少なくすることで同じ焦点距離で焦点を改善する。チューブ形成アッセイは、幹細胞分化アンドロゲン細胞に適用することができる。

WISHは、変異補正の機能的意味を理解しやすくします。この手順をデモンストレーションする人は、私の研究室の研究助手であるヨン・ワンです。顕微鏡下で作業するフェムトジェットシステムを使用して、モルフォリノスのナノグラム2個とMRNA 500ピコグラムを1細胞胚に注入します。

モルフォリノスのマイクロインジェクションを何度も練習し、細胞に正常に注入し、卵の完全性を保つことができます。彼らがデコリオネートされ、意図した実験に対応する開発の状態に達するまで、接合者をインキュベートします。原稿の表1に記載されているように。

次に、プラスチックピペットを使用して、20〜40個の胚を1.5ミリリットルチューブに移します。室温で作りたての4%PFA溶液を1ミリリットル加えます。原稿に記載されているように胚を固定、洗浄、脱水した後、下部にナイロンメッシュを付けたふるいに胚を入れる。

胚を75%50%および25%メタノールでそれぞれ5分間順次洗浄して水和する。PBSTで胚を洗浄した後、胚とチューブに50マイクロリットルのプロテイナーゼKを加える。消化後、プロテナーゼKを取り出し、毎回5分間PBSTで胚を3回洗浄します。

胚を含む各チューブに50~100マイクロリットルの混合ターゲットプローブを加えます。胚を摂氏40度で一晩インキュベートする。原稿に記載されているように胚を洗浄した後、4%パラホルムアルデヒドを使用して、胚を室温で30分間固定する。

その後、2倍のSSCT溶液で胚を室温で15分間3回洗浄します。SSCT溶液を取り外し、Amp 1の50マイクロリットルに交換してください。その後、40°Cで胚をインキュベートします。

30分後、胚を室温で15分間、2倍のSSCT溶液で3回洗浄する。SSCT溶液を取り外し、Amp 2を50マイクロリットル加えます。15分間インキュベートし、先に行ったように胚を洗浄した後、50マイクロリットルのアンプ3を加え、チューブを軽くタップします。

胚を摂氏40度でインキュベートする。30分後に先述のように胚を洗浄する。その後、Amp 4ドロップワイズの50マイクロリットルを追加し、慎重にチューブをタップします。

その後、胚を摂氏40度で15分間インキュベートし、SSCTで3回洗浄します。原稿に記載されているようにイメージング用の胚を調製した後、DABペルオキシダーゼ基材キットを使用して標本を染色する。1ミリリットルの蒸留水に各色試薬A、B、Cを50マイクロリットル加えます。

そして完全なDAB作動液を得るためによく混ぜる。試料に流体を加え、10分間覆います。検体を十分に洗浄した後、光学顕微鏡で画像を作成します。

HHT iPSCの培養と制御を開始するには、ウェルの底部を覆う6つのウェル細胞培養プレートに基底膜マトリックスを追加します。プレートを摂氏37度で1時間インキュベートします。次に、使用した基膜マトリックス溶液をウェルから取り出し、各ウェルに2ミリリットルのmTeSR 1培地を加える。

その後、最後の通路から収穫したiPSCを1回あたり約10倍から6個の細胞にプレートします。iPSCを約4日間培養した後、細胞培養培地を添加したBEL培地と交換する。中皮細胞を生成するために3日間細胞を成長させます。

血管内皮細胞を拡大するには、培地を4日間補充されたBEL培地に置き換える。そして、同じ培地と培養物を含む細胞を、さらに3〜4日間治療します。キットの指示に従ってCD31ダイナビーズを使用して成熟した血管内皮細胞を精製します。

次いで、溶出緩衝液によりCD31陽性細胞を収集する。VEGF165、bFGFおよびFBSを含むEC-SFM培地中の精製内皮細胞を維持および拡大する。内皮細胞をプレートするには、血管新生プレートにウェルあたり10マイクロリットルの基基膜マトリックスを加える。

37°Cで30分間プレートをインキュベートします。内皮細胞を収穫し、繰り返しピペット処理することにより、内皮増殖培地2に再懸濁する。この細胞懸濁液の50マイクロリットルを各ウェルの固化マトリックスに加え、37°Cで細胞をインキュベートします。

3~5時間のインキュベーションの後、高分解能顕微鏡を使用して内皮管形成を評価します。各グループに対して少なくとも10のエリアの画像をキャプチャします。チューブ全体の長さ、チューブ番号、分岐点を確認します。

CISHおよびWISHは、受精後24時間の胚におけるエンドリンの発現を決定するために行われた。血液形成性内皮マーカーと内皮前駆体マーカーを用いて、エンドグリンサイレンの効果を調べた。赤い矢印は、これらのマーカー、aplnrnaおよびnpr1aの発現が有意に減少した領域を示す。

内皮管形成アッセイを、エンドグリン変異体およびコントロールiPSC由来内皮細胞に対して行った。チューブ形成を評価し、3時間後に撮影した。チューブの長さ、チューブ番号および分岐は、ImageJソフトウェアを用いて定量化した。

変異型内皮細胞は、コントロール内皮細胞よりも少ない枝を形成した。そして、血管内皮増殖因子による刺激後に変異内皮細胞の枝が有意に増加した。また、この方法は末梢血からのiPS生成にも使用できます。

そして、この方法により、インビトロおよびインビボにおける血管形成における内分泌の役割を明らかにする。突然変異を矯正すると血管新生に違いが生じる可能性があることを知って、潜在的な幹細胞療法のために患者に細胞を移植することが可能である。