Name: iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ全山ハイブリダイゼーションとiPSC由来内皮細胞のチューブ形成アッセイにより、エンドグリンが血管形成における重要な役割を果たすことを明らかにする方法です。

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この研究は、中国幹細胞の国家主要研究開発プログラムと翻訳研究[助成番号2016YFA0102300(Jun Yangまで)];中国自然科学財団[助成番号81870051、81670054(6月まで))の助成金によって支えられました。CAMS医療イノベーション基金(CIFMS)[助成金番号2016-I2M-4-003(ヤンジュンへ)]。PUMC青年発見と中央大学のための基礎研究資金[助成番号2017310013(牙周へ)]。

記載されているすべての動物実験は、浙江大学医学部の研究倫理委員会によって承認されました。
1. その一時ハイブリダイゼーションにおける全マウント
<ol><li>ゼブラフィッシュラインの夫と繁殖<ol>
<li>1日14時間光/10時間の暗循環を伴う再循環養殖システムで、すべての成体ゼブラフィッシュを26-28°Cで飼育して飼育します。次の手順では、AB (野生型) ゼブラフィッシュラインを使用します。</li>
		<li>卵の避難所として繁殖箱の底に小石の層を入れてください。ペアレンタルフィッシュは、各ボックスに2:1(すなわち、2匹の女性と1人の男性)の比率で。メスの魚を1日産ませます。産卵の終わりに、卵を食べないように親魚をすぐに取り除きます。</li>
		<li>顕微鏡下でフェムトジェット注入システムを使用して、モルフォリノの2ngとmRNAの500 pgを1細胞段階胚に注入する(endoglin-MO配列:5'-GATGAACTCAACTCGTGTCTCTGAT-3';5-ミスペア対照MO配列:5'-AAACACCATCCCCtCTCTCTCTCTCTCCCCCCC-3')。</li>
		<li>27°Cの酸性海水中で約48時間、ジゴテをインキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>ゼブラフィッシュ胚の採取と固定<ol>
<li>プラスチックトランスファーピペットを使用して、1.5 mLチューブの循環系水(pH = 5.0)から20〜40個のゼブラフィッシュ胚を集め、特定の開発期間に達します。室温(RT)で、作りたての4%PFA溶液を1mL加えます。 注:選択された胚が実験の目的に基づく期間である。表1は、異なる胚期に必要な固定時間を示す。</li>
		<li>固定溶液を取り除き、Tween-20でリン酸緩衝溶液で胚を洗浄する(PBST、1mLのTweenを1000 mLのPBS溶液に希釈する)RTでそれぞれ5分間3倍。</li>
		<li>一連の25%、50%、75%のメタノール(PBSTで希釈)を5分間インキュベーションして胚を脱水する。胚を100%メタノールに5分間移し、フレッシュメタノールに交換します。胚を-20°Cで一晩以上保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>水和と消化<ol>
<li>底部にナイロンメッシュを入れた篩を用いて100%メタノールに保存された水素化胚を、12枚のウェルプレートのウェルで胚を連続して75%、50%、25%メタノール(PBSTで希釈)をそれぞれ5分間連続して洗浄した。胚をPBST 3xでRTでそれぞれ5分間洗います。</li>
		<li>50 μL のプロテイナーゼ K (10 mg/mL) を胚を含むチューブに加え、RT の表 2の消化時間に従います。</li>
		<li>プロテイナーゼKを取り出し、PBST 3xで胚をRTでそれぞれ5分間洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>プローブハイブリダイゼーションと後固定<ol>
<li>各遺伝子のmRNA配列に従って設計されたプローブを40°Cハイブリダイズン系に入れて沈殿が溶解するまで、 これは〜10分かかるはずです。例えば(XM_007116.7)の標的プローブと、初期の中皮前駆体形成(ここでは、aplnr[NM_001075105.1]およびnrp1a[NM_001040326.1])に関与aplnrする2つの重要な遺伝子を50:1:1比で混合する。</li>
		<li>混合ターゲットプローブ50~100μLを胚で各チューブに加え、40°Cで一晩インキュベートします。 注:プレミックスプローブは40°Cに予温し、使用前にRTに冷却する必要があります。</li>
		<li>Tween-20(SSCT)で0.2x生理塩水ナトリウムクエン酸溶液を調製する(SSCT):175.3gのNaClと88gのクエン酸ナトリウムを1LのdH2Oに溶解し、20倍のSSC溶液を得る。次いで、溶液をdH2Oで1:100希釈し、0.2 x SSCT溶液を得た。0.2x SSCT溶液でTween-20 1:1000を希釈。</li>
		<li>リサイクルされたプローブを新しいチューブに移します。0.2倍のSSCT溶液3xで胚をRTでそれぞれ15分間洗浄します。リサイクルされたプローブは、5x-10xを再利用できます。</li>
		<li>4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して、RTで30分間胚を固定し、0.2x SSCT溶液3xで胚をRTでそれぞれ15分間洗浄します。 注:グロス・テービングらの仕事は、10分14の後固定期間を示唆しているが、実際の量はそれに応じて調整されなければならない。ここでは、10分の後固定3xを試験し、DABの死の感度が大きく影響を受けた。調査の後、0.5-1.0 hの固定が最適な条件であることを確認してください(固定期間が短いほどターゲットRNAから明確な信号が生成されず、固定時間の適切な延長は信号を強化し、バックグラウンドノイズを低減するのに役立ちます)。</li>
	</ol></li>
	<li>シーケンシャルアンプとラベルプローブハイブリダイゼーション<ol>
<li>SSCTソリューションを取り外し、Amp 1の50 μLに交換します。胚をアンプ1に40°Cで30分間落ち着かせる。次いで、0.2x SSCT溶液3xで胚をRTでそれぞれ15分間洗浄する。</li>
		<li>SSCTソリューションを取り外し、Amp 2を50μL追加します。胚を40°Cで15分間落ち着かせる。次いで、0.2x SSCT溶液3xで胚をRTでそれぞれ15分間洗浄する。</li>
		<li>SSCT溶液を取り外し、Amp 3を50μL加え、チューブを軽くタップします。次に、40°Cで30分間胚をインキュベートし、0.2x SSCT溶液3xで、RTでそれぞれ15分間洗浄します。</li>
		<li>SSCT溶液を取り外し、Amp 4ドロップワイズの50 μLを加え、チューブを慎重にタップします。次に、40°Cで胚を15分間インキュベートし、胚を0.2x SSCT 3xでそれぞれRTで15分間洗浄します。</li>
	</ol></li>
	<li>対抗染色と顕微鏡<ol>
<li>SSCT溶液を取り外し、各チューブに50μLのDAPIを追加します。胚を4°Cで一晩インキュベートする。</li>
		<li>PBSTで胚を洗浄し、PBSTを充填したペトリ皿に1%低融点アガロース(LMP)溶液(1gのLMPをdH2Oの100 mLに溶解)を用いて画像化のためにそれらを準備する。</li>
		<li>試料を染色するためにDABペルオキシダーゼ基材キットを使用してください。1 mLの蒸留水にカラー試薬A、B、C(それぞれ50μL)を加え、よく混ぜて完全なDAB作動液を得る。試料に液体を加え、10分間カバーします。</li>
		<li>染色後、PBSTで十分に洗浄してください。</li>
		<li>サンプルを撮像するための写真機能を備えた光学顕微鏡を使用してください。 注:後で画像を撮る場合、チューブは、アルミニウム箔で包み、4°Cで保存する必要があります。</li>
	</ol></li>
</ol>2. チューブ形成アッセイ
注:eng変異型および野生型のECs(制御)はHHT患者から導かれるiPSCと区別された(ここでは、 22歳以降の再発性エピスタキシスを有する62歳の女性患者、胃腸出血、肺動静脈奇形、エキソン2の位置c.88T>Cのミスセンス・エン突然変異を運ぶ)と健康なドナー (eng変異なし)は、北京ユニオン医科大学病院が大学研究倫理委員会の承認を得て提供した。
<ol><li>コントロールおよび HHT iPSC 細胞培養<ol>
<li>ウェルの底部を覆う6ウェル細胞培養プレートに基底膜マトリックス(例えばマトリゲル)の特定の容積を加え、37°Cで1時間プレートをインキュベートする。 注:-20°Cで保存された基膜マトリックスを最初に使用する場合は、氷の上で、または解凍されるまで霜のない4°C冷蔵庫でインキュベートします。次に、DMEM/F12で1:100で希釈し、希釈液をそれぞれ100μLを含む200μLチューブに分配します。チューブを-20°Cに保管し、凍結と解凍を繰り返さないようにしてください。希釈した基質膜マトリックスを添加する場合、気泡を作らないでください。希釈した基底膜マトリックスを加えた後、6ウェルプレートを手で軽く振り、底部を均等に覆います。</li>
		<li>プレートをコーティングした後、使用した基質膜マトリックス溶液をウェルから取り除きます。その後、各ウェルに2mLのmTeSR1培地を加え、最後の通路から収穫したiPSCをウェルあたり約1 x 106でプレートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>iPSCからのICの生成と拡大<ol>
<li>iPSC培養の約4日後、培養培地を、アクチビンA(25ng/mL)、BMP4(30 ng/mL)、VEGF165(50 ng/mL)、およびCHIR99021(1.5μM)で添加したBEL培地と交換する。中皮細胞を生成するために3日間細胞を成長させます。</li>
		<li>ステップ 2.2.1 で説明した培地を、VEGF (50 ng/mL) と SB431542 (10 μM) を補充した BEL 培地に 4 日間交換して血管の ECs を拡張します。同じ培地と培養物を含む細胞を3~4日間処理します。</li>
		<li>成熟した血管ECsを精製するためにCD31-dynabeadsを使用する:ヒトCD31抗体と磁気ビーズを結び付けてECs上で発現したCD31分子を結合し、溶出バッファーによってCD31陽性細胞を収集するCD31-dynabeadsキットの手順を参照してください。VEGF165(30 ng/mL)、bFGF(30 ng/mL)、FBS(1%)を含むEC-SFM培地で精製されたECを維持および拡大します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マトリゲルコーティングプレートおよび顕微鏡検査上の内皮細胞のめっき<ol>
<li>1ウェルあたり10μLの基質膜マトリックスを加えて血管新生プレート(材料表を参照)をコーティングし、37°Cで30分でインキュベートします。</li>
		<li>内皮マーカーCD31およびVEカドヘリンを免疫蛍光染色で確認した後に内皮細胞を収穫し、繰り返しピペット処理することにより内皮増殖培地2で再懸濁する。固化したマトリックスにウェルあたり50μLの細胞懸濁液(2 x 105細胞/mL)を加え、37°Cで3〜5時間培養します。 注:チューブ形成実験の前に、内皮マーカーは、機能的な内皮細胞の適切な表現型を確認するためにチェックする必要があります。1 x 104細胞のウェルは管形成のための理想的な数である。あまりにも多くのまたは少なすぎる細胞は、チューブ形成に役立たない。皿の側面から細胞を加え、基質膜マトリックスに触れないでください。細胞をチェックし、写真を撮るために、高倍率フィールドで光顕微鏡を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>チューブ形成の定量的結果<ol>
<li>結果を高解像度の顕微鏡で観察し、各グループに少なくとも10の領域を撮影して、信頼性の高いデータ統計を得ます。</li>
		<li>内皮管形成を調べる:管の全長、管数、分岐点を調べることによりチューブ形成の程度を推定する。ImageJ ソフトウェアを使用して、ブランチの数と長さを評価してカウントします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、HHT患者由来のiPSC-IC上でゼブラフィッシュおよびチューブ形成アッセイ用の、その場RNA解析プラットフォームにおける改良型の全実装を適用した。従来のISH法では、実験の余分なステップを伴う実験サイクルが長く必要です。プロトコルは、いくつかの重要な改善、独立した二重ZプローブとIPSCの使用は、それぞれWISHアッセイとチューブ形成に適用されたHHT患者に由来する。これらの改良は、従来のISHで観察されるものと比較して検出感度を高めるために重要です。ユニークに設計されたプローブと標的シグナル増幅は、まれに発現する転写物の検出を可能にする(aplnraは24hpf胚において不十分に発現した遺伝子である)。1つの変更は、プローブハイブリダイゼーション後の追加固定です。余分な固定は、プローブとトランスクリプトの組み合わせを強化することができます。DAB染色は蛍光染色ではなく適用され、ある種の低存在遺伝子において蛍光染色を行うことが困難であったからである。その後、iPSCを血管新生アッセイに使用し、この研究の意義と臨床関連性を高めた。iPSC の生成には、厳密なカルチャ条件が必要であり、プロトコルの制限を...

HHT患者では、ENG(CD105)の単一の突然変異が報告されている。この突然変異は、EC増殖の増加と流動媒介EC伸長の減少を招く11,2である。また、ENG欠乏症はゼブラフィッシュ3の内皮マーカー発現(すなわち、kdrl、cdh5、hey2)を低下hey2させることも以前に報告されている。 kdrl cdh5エンドグリンは、主に内皮細胞に発現し、膜貫通糖タンパク質であり、成長因子β(TGF-β)ファミリーメンバーを変換するための共レセプターとして機能する。これは、BMP9結合を細胞表面に指示して、Id1発現を含む下流遺伝子を調節し、幹細胞分化をECs4に誘導する。従って、eng遺伝子は血管形成およびヒト血管疾患55,66において重要な役割を果たす。我々は、ゼブラフィッシュ胚における血管形成に対するエンドグリンノックダウンの影響を検討し、続いて、ENG突然変異を有するHHT患者から取得したiPSC由来のICの分析を行った7。このプロトコルは、EN欠乏が内皮前駆細胞マーカー発現および管形成に及ぼす影響を示し、これはインビトロ血管新生を測定するための定量化可能な方法である。
空間的および時間的発現を研究するために、WISHは、生体内8において遺伝子発現を検出するために採用される。インサイチュハイブリダイゼーション(ISH)では、標的核酸(DNAまたはmRNA)の補数配列を有する標識プローブを用いて、固定検体中の標的核酸ハイブリッドを検出および可視化する方法である。このプロセスは、生体内の遺伝子発現シグナルを増幅し、顕微鏡による遺伝子の発現を検出するために使用されます。WISHは、特にゼブラフィッシュ9で、様々なモデル動物で広く使用されています。また、次のデータを取得するために使用されます: 1) 遺伝子の空間/時間発現パターン, 遺伝子機能と分類に関する情報を提供します;2)高スループット薬物または変異体スクリーニング10に使用される遺伝子マーカーを特異的に発現させる。
染色原性プローブは、従来の染色体を用いてそのシチュハイブリダイゼーション(CISH)で容易に分解され、高いバックグラウンドノイズと非特異的信号11,12,12を生じる。WISH法は、RNA配列を標的とするようにハイブリダイズするように設計された2つの独立した二重Zプローブを使用します。各プローブには、標的RNAと相補的な18~25個の配列と14個のベーステール配列(Zとして概念化)が含まれています。ターゲットプローブはペア(ダブルZ)で使用されます。2つのテールシーケンスは、アンプ用の20の結合部位を含むプリアンプ用の28ベースのハイブリダイゼーションサイトを形成します。このアンプは、標識プローブ用の20個の結合部位を含み、理論的には各ターゲットRNA配列に対して最大8,000個のラベルを生成できます。
この高度な技術は、組織形態13を維持しながら、単一分子可視化を達成するために同時に信号増幅とバックグラウンド抑制を促進する。WISH法のさらなる修飾は、以前の研究14に基づいており、追加の固定およびDAB染色を含む。ここで提供される改良されたWISHプロトコルは、標的RNAが部分的に減少または分解された場合でも動作することができる。利点はRNase自由条件なしで24時間で完了することができることである。複数のターゲットからの複数のチャネルを通じて同時に信号を検出することができ、結果は一貫しており、異なる高スループットの自動化プラットフォームの結果と互換性があります。
動物モデルの結果は、ヒトで起こるのと同じ現象を反映する必要はない。ENGには、孤児の領域で二硫化橋を形成するC30-C207とC53-C182の2組の保存されたシステインが含まれています。HHT患者におけるengの役割をさらに研究するために、HHT患者由来のiPSCを用いたチューブ形成アッセイは、eng変異を伴わない/またはeng変異を伴わない細胞で行われている(Cys30Arg,C30R)15。Kubotaらが最初にチューブ形成実験16を報告した後、アッセイはいくつかの方法で開発された。血管新生または抗血管新生因子を同定し、血管新生におけるシグナル伝達経路を定義し、血管新生17を調節する遺伝子を同定するために用いられている。
患者由来のiPSC-ICが利用できる前に、研究者は主に培養されたECを使用して血管新生16を研究した。しかし、内皮細胞の場合、ECが受けることができる通過数が限られているため、ウイルスを持つ外因性遺伝子をトランスデュースすることは技術的な課題です。これは、手術または一致した承認されたドナーのいずれかから人間の血管から収集されるのに十分な細胞材料がほとんどないためです。山中信也によるiPSC生成技術の発明により、iPSCに由来するヒトICは、前に報告された18のインビトロ実験で確実に使用することができる。
数と通過が限られたウイルス伝達されたICを使用すると、シグナル伝達研究には十分かもしれませんが、機能研究のためには、変異型多能性幹細胞株(iPSCまたはCRISPER/Cas9標的hESCのいずれか)を生成し、チューブ形成アッセイ19を使用する血管新生研究のためにそれらをECsに区別する方が良い。チューブ形成は、突然変異を有する内皮細胞の機能を評価するために使用することができる。このプロトコルは、簡単で費用対効果が高く、再現可能な方法であるμ-Slide血管新生プレート上のチューブ形成についても説明します。
以下のプロトコルは、血管形成における特定の遺伝子の役割を研究するための信頼性の高い全身的な方法と、生体内発現パターンおよびヒト疾患をモデル化するためのインビトロ機能定量の詳細を提供する。

<table><tbody><tr><td>&micro;-スライド血管新生</td><td>同上</td><td>81506</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>アンプ 1-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320852 <td>シグナル増幅</td></tr><tr><td>アンプ 2-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320853 <td>シグナル増幅</td></tr><tr><td>アンプ 3-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320854 <td>シグナル増幅</td></tr><tr><td>アンプ 4 Alt B-FL</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 320856 <td>シグナル増幅</td></tr><tr><td>コーニング マトリゲルマトリックス</td><td>コーニング</td><td>354234</td><td>成長因子減少型マトリゲル</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>シグマ</td><td>D5758</td><td>RNAaseフリー水</td></tr><tr><td>ヒト内皮SFM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11111044</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>30525-89-4</td><td>固定胚</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>30525-89-4</td><td>固定細胞</td></tr><tr><td>プロテアーゼK</td><td>ACD</td><td>SDS</td> 322337 <td>消化組織</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>6132-04-3</td><td>SSCT 溶液:ウォッシュバッファー</td></tr><tr><td>VEGF-165</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>78073</td><td>成長因子</td></tr></tbody></table>

ipsc-icにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

血管の発達は、特定の遺伝子の逐次的発現によって決定され、異なる発達段階でゼブラフィッシュにおけるその際のハイブリダイゼーションアッセイを行うことで研究することができる。遺伝性出血性血管拡張症(HHT)の発達中の血管形成におけるエンドグリン(eng)の役割を調べるには、ゼブラフィッシュにおけるモルフォリノ媒介型の標的型のトノックダウンを用いて、その時間的発現および関連する機能を研究する。ここで、ゼブラフィッシュ胚におけるengおよびその下流遺伝子の解析には、その領域におけるRNAハイブリダイゼーション(WISH)の全実装が採用されている。また、チューブ形成アッセイは、HHT患者由来の誘導多能性幹細胞分化内皮細胞(iPSC-EC;eng変異を有する)においてeng行われる。イン・シグナ・ハイブリダイゼーションの全量を使用する特定の信号増幅システム – WISHは従来の方法と比較して、より高い解像度と低い背景結果を提供します。より良い信号を得るために、後の固定時間は、プローブハイブリダイゼーション後30分に調整される。蛍光染色はゼブラフィッシュ胚では感受性がないので、ここでジアミノベジジン(DAB)染色に置き換えられます。このプロトコルでは、ENG変異を含むHHT患者由来のiPSCラインが内皮細胞に分化される。37°Cで30分間膜マトリックスをプレートにコーティングした後、iPSC-ICを単層としてウェルに播種し、37°Cで3時間保ちます。次に、管長および分岐数を顕微鏡画像を用いて計算する。従って、この改善されたWISHプロトコルにより、トウゲン発現の低下がゼブラフィッシュ胚における内皮前駆体形成に影響を及ぼすことが示される。これは、HHT患者由来のiPSC-ICを用いたチューブ形成アッセイによってさらに確認される。これらのアッセイは、初期血管発達におけるengの役割を確認する。

インザチュハイブリダイゼーションにおける全体のマウントは、蛍光共鳴エネルギー伝達に類似した原理に基づいている。ゼブラフィッシュのISHの感度と特異性を向上させるとともに、バックグラウンド信号に影響を与えることなくターゲット固有の信号を増幅するように設計されています。
24hpfゼブラフィッシュ胚において、エンドグリンは後枢静脈(PCV)、セグメント間血管(ISV)、および血液島3において高発現している。従来の染色体の染色時間を制御するのは難しく、その場合の染色法は、その際のハイブリダイゼーション(CISH)で、黄身嚢などの一部の領域で非正のシグナルが発生する(図1A)。初期血管の発達におけるengの役割を調べるために、血液形成性内皮マーカー(aplnra)と別...

ここで提示されるゼブラフィッシュおよび管形成アッセイにおけるその際の全実装RNAハイブリダイゼーション分析のためのプロトコルは、血管形成におけるエンドグリンの役割を研究する患者由来の誘導多能性幹細胞由来の内皮細胞におけるアッセイである。

iPSC-ICにおけるゼブラフィッシュ胚の全山ハイブリダイゼーションとチューブ形成アッセイは血管開発におけるエンドリンの役割を研究する

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

このマウント全体は、その一方でのハイブリダイゼーションで、WISHは従来の方法と比較して高解像度と低いバックグラウンド結果を提供します。また、Uスライドプレートは、マウス胚、ショウジョウバエ胚および他の組織に適用できる願い物を少なくすることで同じ焦点距離で焦点を改善する。チューブ形成アッセイは、幹細胞分化アンドロゲン細胞に適用することができる。WISHは、変異補正の機能的意味を理解しやすくします。この手順をデモンストレーションする人は、私の研究室の研究助手であるヨン・ワンです。顕微鏡下で作業するフェムトジェットシステムを使用して、モルフォリノスのナノグラム2個とMRNA 500ピコグラムを1細胞胚に注入します。モルフォリノスのマイクロインジェクションを何度も練習し、細胞に正常に注入し、卵の完全性を保つことができます。彼らがデコリオネートされ、意図した実験に対応する開発の状態に達するまで、接合者をインキュベートします。原稿の表1に記載されているように。次に、プラスチックピペットを使用して、20〜40個の胚を1.5ミリリットルチューブに移します。室温で作りたての4%PFA溶液を1ミリリットル加えます。原稿に記載されているように胚を固定、洗浄、脱水した後、下部にナイロンメッシュを付けたふるいに胚を入れる。胚を75%50%および25%メタノールでそれぞれ5分間順次洗浄して水和する。PBSTで胚を洗浄した後、胚とチューブに50マイクロリットルのプロテイナーゼKを加える。消化後、プロテナーゼKを取り出し、毎回5分間PBSTで胚を3回洗浄します。胚を含む各チューブに50~100マイクロリットルの混合ターゲットプローブを加えます。胚を摂氏40度で一晩インキュベートする。原稿に記載されているように胚を洗浄した後、4%パラホルムアルデヒドを使用して、胚を室温で30分間固定する。その後、2倍のSSCT溶液で胚を室温で15分間3回洗浄します。SSCT溶液を取り外し、Amp 1の50マイクロリットルに交換してください。その後、40°Cで胚をインキュベートします。30分後、胚を室温で15分間、2倍のSSCT溶液で3回洗浄する。SSCT溶液を取り外し、Amp 2を50マイクロリットル加えます。15分間インキュベートし、先に行ったように胚を洗浄した後、50マイクロリットルのアンプ3を加え、チューブを軽くタップします。胚を摂氏40度でインキュベートする。30分後に先述のように胚を洗浄する。その後、Amp 4ドロップワイズの50マイクロリットルを追加し、慎重にチューブをタップします。その後、胚を摂氏40度で15分間インキュベートし、SSCTで3回洗浄します。原稿に記載されているようにイメージング用の胚を調製した後、DABペルオキシダーゼ基材キットを使用して標本を染色する。1ミリリットルの蒸留水

whole-mount-situ-hybridization-zebrafish-embryos-tube-formation-assay

Research

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