Name: 腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: 学ぶ腸内細胞増殖と死細胞の定量化法。マウス回腸由来エンテロイドを培養し、フローサイトメトリーで薬剤や炎症性サイトカインの影響を評価する。炎症性腸疾患治療研究に応用可能です。

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この研究は、中国国立自然科学財団(31971062、31900326、31600322)、江蘇省自然科学財団(BK20190043、BK20180838)、医薬品バイオテクノロジーの国家主要研究所の研究基金、中国の国家自然科学財団によって支援されています。南京大学(KF-GN-202004)。中国江蘇高等教育機関の自然科学財団(19KJB320003)、蘇州市の生計と技術プログラム(SYS2019030)、江蘇省大学卒業生研究イノベーションプログラム(KYCX19-1981).この作品は、スーチョウ大学の唐学者によってもサポートされています。

このプロトコルは、ケンブリッジ・スーダゲノムリソースセンター(CAM-SU)の動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 腸内オルガノイドの分離と文化
<ol><li>腸管の分離と腸内の文化<ol>
<li>CO2吸入で8週齢の野生型マウスを安楽死させる。約8cmの回腸を解剖するために、ティッシュ鉗子と細かい虹彩ハサミを使用してください。</li>
		<li>氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)の約40mLを持つガベージ給餌針を持つ注射器を使用して洗い流し、ハサミで縦に切断し、回腸を開きます。</li>
		<li>回腸を小さく(0.5-1.0 cm)切ります。15 mLの円錐形チューブに5mLの無菌氷冷DPBSを入れ、氷の上で5分間ロックします。</li>
		<li>ピペットコントローラを使用してDPBSを吸引し、10 mLのコールドバッファ1(DPBSで2 mM EDTA)に交換します。氷の上で30分間ロックします。</li>
		<li>ピペットコントローラを使用してバッファ1を吸引し、10 mLのコールドバッファ2(DPBSで54.9mM D-ソルビトール、43.4 mMスクロース)に置き換えます。手で2-3分(約80シェイク/分)を振ります。</li>
		<li>振盪後20μLのバッファー2内容物を取り、顕微鏡で検査します。</li>
		<li>70 μmの無菌細胞ストレーナーでバッファ2内容をフィルターし、50 mL円錐形チューブで濾過したバッファーを集める。</li>
		<li>ピペット20 μLの切り出しをスライドにろ過して納骨堂を数えます。ステップ 1.1.7 から十分なバッファー 2 を転送して、~ 500 クリプト/ウェルがあることを確認します。</li>
		<li>4 °Cで10分間150×gでスピンダウンします。回転が終わったら、慎重に上清を吸引します。</li>
		<li>500個のクリプトあたり50μLの基細胞膜マトリックス(例えば、マトリゲル)でクリプトを懸濁し、ピペットを上下に(気泡を避けるように注意してください)、24ウェルプレートの1つの井戸の中央に50μLの基質膜マトリックス/クリプトミックスを置きます。37°Cで30分間インキュベートし、基細胞膜マトリックスを重合します。</li>
		<li>重合の30分後、慎重にミニ腸培地の600 μLを追加します(高度なダルベッコの修飾イーグル培地[DMEM]/F12、2 mM L-アラニン-L-グルタミン、ペン/ストレップ[100単位/mL]、 10 mMヘペス、N2サプリメント[1:100]、B27サプリメント[1:50]表皮成長因子[EGF;50 ng/mL]、ノギン[100 ng/mL]、R-スポンディン[500 ng/mL]、およびY27632[10μM])を各々C.4°Cに戻します。毎日顕微鏡で観察し、2-3日ごとにメディアを交換してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>腸イド通過 注: 長い文化の場合、エンテロイドは毎週に分割する必要があります。<ol>
<li>腸イドを通過するには、組織培養プレートを氷の上に置きます。メディアを吸引し、各ウェルに冷たいDPBSの1 mLを追加します。P1000 チップを使用して、固体基質膜マトリックスチャンクが残らないまでピペットを上下に使用します。</li>
		<li>1 mLインスリンシリンジ(27G)を通って1回上下に15mLの円錐形チューブに入ります。4 °Cで150 x gで5分間スピンダウンします。</li>
		<li>DPBS を削除するには、ピペットを使用します。基調膜マトリックス/ウェルの50 μLで再サスペンド。</li>
		<li>プレートを37°Cのインキュベーターに30分間入れ、基細胞マトリックスを重合させます。ENR培地(ミニガット培地、50ng/mL EGF、100 ng/mLノギン、500 ng/mL R-スポンディン)を各ウェルに重ね合わせ、プレートをインキュベーターに戻します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 腸内のEdU陽性細胞のフローサイトメトリー解析
注:図 1は、エンターイド中の EdU 陽性細胞のフローサイトメトリー解析のワークフローを示しています。
<ol><li>EdUを使用した腸内ロイドのインキュベーション<ol>
<li>5-7日間のステップ1.2.4から腸内ロイドを成長させる。通路は1:2の分割比で新しい24ウェルプレートにエンテロイド。各ウェルに600μLのENR培地を加えます。37 °Cインキュベーターで4-5日間腸イドをインキュベートする。</li>
		<li>コントロール群(未処理のエンテロイド)および実験群(5 ng/mLインターロイキン22[IL-22]で処理された腸イド)を設定する。各グループに対して少なくとも 3 つのレプリケートを準備します。</li>
		<li>ENR培地にEdUを加え、50μMの濃度でEdU培地を調製した。各ウェルに600μLのEdU培地を加え、37°Cのインキュベーターで2時間インキュベートします。背景減算の負のコントロールとして EdU 処理を行わないエンタロイドの 1 つの井戸を設定します。</li>
	</ol></li>
	<li>基状膜マトリックスからの腸ロイドの収穫<ol>
<li>ピペットコントローラーを使用してEdU培地を吸引し、DPBSで1xを洗浄します。DPBS の 1 mL を追加します。</li>
		<li>P1000ピペットチップとピペットを上下に使用し、固体基質膜マトリックスチャンクが残らないまで使用します。15 mLのチューブに移し、300 x gで5分間スピンダウンします。</li>
		<li>500 μLの細胞解離酵素(材料表)を加え、37°Cで15分間インキュベートします。P200ピペットチップとピペットを上下に使用して、イチオイドを単一の細胞に分解します。</li>
		<li>10%のウシ血清(FBS)を含むDMEM培地を3 mL加え、P1000ピペットチップを繰り返しピペットに加える。</li>
		<li>300 x gで5分間スピンダウンし、上清培地を吸引します。1 mLのDPBSで細胞を再サスペンドする。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞の固定と透過<ol>
<li>細胞懸濁液を1.5 mLのチューブに移し、300 x gで5分間スピンダウンし、上清を捨てます。</li>
		<li>1 mL 4% パラホルムアルデヒド (PFA) で細胞を再サスペンドし、室温 (RT) で 15 分間固定し、300 x gで 5 分間スピンダウンします。</li>
		<li>1 mL の非イオン性界面活性剤を使用して細胞を再懸濁します。RTで10分間インキュベートします。</li>
		<li>300 x gで5分間スピンダウンし、上清を吸引します。DPBSで1xを洗い、スピンダウンして上清を取り除きます。</li>
	</ol></li>
	<li>EdU の検出<ol>
<li>各成分のストック液を事前に用意する:1)Alexa Fluorアジドの作動液、2)1x EdU反応バッファーの作動溶液、および3)10xのEdUバッファー添加剤のストック溶液。</li>
		<li>10x溶液1:10を脱イオン水で希釈して1x EdU緩衝液添加剤を調製する。このソリューションを新鮮に準備します。</li>
		<li>表1に従って反応カクテルを準備する。 注: 表に示されている順序で、成分を追加します。準備から15分以内に反応カクテルを使用してください。</li>
		<li>1.5 mLのチューブに100μLの反応カクテルを加えます。細胞を再懸濁し、光から保護し、RTで30分間インキュベートする。</li>
		<li>300 x gで5分間遠心分離し、ピペットチップで反応液を軽く吸引します。</li>
		<li>各チューブに0.5%の非イオン界面活性剤浸透剤を加え、RT.遠心分離機で300xgで5分間洗い、ピペットチップで上清を穏やかに吸引し、DPBSの1 mLで細胞を再懸濁させる。</li>
	</ol></li>
	<li>フローサイトメトリーによる細胞の解析<ol>
<li>40 μm のストレーナーで再懸濁した細胞をフィルター処理し、15 mL 円錐形のチューブでフィルター処理されたセルを集めます。FACS オンマシン検出をできるだけ早く実行します。 注:条件が限られている場合、細胞染色されたサンプルは、4°Cで暗闇の中に保存し、3日以内にフローテストする必要があります。</li>
		<li>フローサイトメトリー分析に適したチャネル(EdUキットのAlexa Fluor azideの種類に応じて、ここでは赤チャネル)と電圧(ここでは〜150~350V)を選択します。</li>
		<li>ガティング戦略<ol>
<li>FSC-A (x 軸)とSSC-A (y 軸) の疑似カラー プロットを描画し、ほとんどのセルを、電圧を調整して、ドット マップの可視範囲に分配します。セルの母集団(R1)を選択し、左下隅にある細胞の破片を除外します。</li>
			<li>R1 セルの母集団から、FSC-A (x 軸)対を確立します。FSC-H(y軸)疑似カラープロットを、単一のセル(R2)を選択してセルの束を除外するようにゲートを設定します。</li>
			<li>R2細胞集団から、蛍光強度(x軸)対.セル番号(y軸)プロットを作成し、負の制御を使用してゲートを設定します。蛍光シグナルの領域は、正の細胞領域(R3)である。実験群と対照群との間のEdU陽性細胞(R3)の比率を比較する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. 腸内のPI陽性細胞のフローサイトメトリー解析
注:図 2は、腸内の PI 陽性細胞のフロー サイトメトリー解析のワークフローを示しています。
<ol><li>PIを使用したエンチド細胞のインキュベーション<ol>
<li>5-7日間のステップ1.2.4から腸内ロイドを成長させる。通路は1:2の分割比で新しい24ウェルプレートにエンテロイド。各ウェルに600μLのENR培地を加えます。37 °Cインキュベーターで4-5日間腸イドをインキュベートする。</li>
		<li>コントロール群(未処理)および実験群(IL-22処理)を設定し、各群に対して少なくとも3回の反復を用いた。</li>
		<li>ENR培地にPIを加え、3μMの濃度でPI培地を調製します。</li>
		<li>各ウェルに600μLのPI培地を加え、37°Cのインキュベーターで30分間インキュベートします。背景減算の負のコントロールとして PI 処理を行わないエンタロイドの 1 つの井戸を設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.2.1-2.2.5 のステップに従って、基質膜マトリックスからエンチドエントイドを収穫します。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる細胞の解析<ol>
<li>40 μmのストレーナーで再懸濁した細胞をろ過し、15 mL円錐形のチューブで濾過した細胞を集めます。</li>
		<li>FACS オンマシン検出をできるだけ早く実行します。 注:条件が限られている場合、細胞染色されたサンプルは、4°Cで暗闇の中に保存し、3日以内にフローテストする必要があります。</li>
		<li>フローサイトメトリー分析に適したチャンネル(ここでは赤チャネル)と電圧(~150~350V)を選択します。</li>
		<li>セクション 2.5.3 で説明した同じ gating 戦略を使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Odenwald, M. A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelial+barrier%3A+a+therapeutic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelial barrier: a therapeutic target.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (1), 9-21 (2017).</li>
<li>Buckley, A., Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Biology+of+Tight+Junction+Barrier+Regulation+and+Mucosal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Biology of Tight Junction Barrier Regulation and Mucosal Disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (1), (2018).</li>
<li>Gehart, H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tales+from+the+crypt%3A+new+insights+into+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tales from the crypt: new insights into intestinal stem cells.</a> Nature reviews. Gastroenterology & Hepatology. 16 (1), 19-34 (2019).</li>
<li>Vancamelbeke, M., Vermeire, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+barrier%3A+a+fundamental+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">The intestinal barrier: a fundamental role in health and disease.</a> Expert Review of Gastroenterology & Hepatology. 11 (9), 821-834 (2017).</li>
<li>Garcia-Carbonell, R., Yao, S. J., Das, S., Guma, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Intestinal+Epithelial+Cell+RIPK+Pathways+Promotes+Chronic+Inflammation+in+the+IBD+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Intestinal Epithelial Cell RIPK Pathways Promotes Chronic Inflammation in the IBD Gut.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1094(2019).</li>
<li>Li, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+and+In+Vivo+Approaches+to+Determine+Intestinal+Epithelial+Cell+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57032(2018).</li>
<li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (11), 799-809 (2009).</li>
<li>Graham, W. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+MLCK1+diversion+reverses+barrier+loss+to+restore+mucosal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intracellular MLCK1 diversion reverses barrier loss to restore mucosal homeostasis.</a> Nature Medicine. 25 (4), 690-700 (2019).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li>
<li>Friedrich, M., Pohin, M., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+Networks+in+the+Pathophysiology+of+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cytokine Networks in the Pathophysiology of Inflammatory Bowel Disease.</a> Immunity. 50 (4), 992-1006 (2019).</li>
<li>Zha, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+22+Expands+Transit-Amplifying+Cells+While+Depleting+Lgr5+Stem+Cells+via+Inhibition+of+Wnt+and+Notch+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Interleukin 22 Expands Transit-Amplifying Cells While Depleting Lgr5 Stem Cells via Inhibition of Wnt and Notch Signaling.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 7 (2), 255-274 (2019).</li>
</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

このプロトコルは、インビトロで腸内の腸イトの培養に必要なステップを詳述し、腸内のEdU-およびPI陽性細胞をフローサイトメトリーで定量する。この戦略には、いくつかの利点があります。まず、EdU ラベリングは、腸内の増殖細胞を検出するために使用されます。従来のBrdUアッセイと比較して、EdUラベリング法はより速く、より敏感で、より正確である。EdUはチミン(T)と非常によく似ており、細胞分裂中にDNA合成でチミンを置き換えます。また、BrdU抗体と比較して、細胞内への拡散が容易で、EdUの検出にはDNA変性や抗原抗体反応は不要です。第二に、フローサイトメトリー分析は、腸内の増殖(EdU+)および死んだ(PI+)細胞を迅速かつ正確に定量することができる。
手順全体を正常に実行するには、考慮する必要がある重要な側面があります。まず、十分な条件下でエンテロイドを培養することが重要である。よく成長した腸内ロイドは、増殖細胞を含む芽をたくさん持っている必要があります。第二に、腸内ロイドを適時に分割することが重要です。内腔に蓄積された破片には死細胞が...

腸管上皮細胞の基本的な機能は、病原性細菌および毒素1、2などの発光内容物の侵入を保護することです。このような機能を果たすために、腸幹細胞は、腸球細胞や分泌細胞を含む様々な上皮細胞に増殖し、かつ分化し、密閉結合を形成して障壁を形成する3。腸管上皮細胞の急速な再生は、細胞増殖、細胞分化、および細胞死4、5の厳密な調整を必要とする。細胞増殖の減少または過剰な細胞死は、上皮損傷および障壁機能1、6の侵害につながる。腸内バリアの機能不全は炎症性腸疾患7,8に関連付けられている。
腸管の納骨堂を培養する方法が以前に開発されている。この技術を用いて、単離されたマウスの陰窩は腸オルガノイド(腸内ロイド)に成長し、構造のような陰窩を有し、全ての腸上皮細胞系統9、10を含有する。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)は、細胞増殖中に複製を受けているDNA中のチミン(T)を置換することができるチミジンアナログである。増殖性細胞は、EdU染色により迅速かつ正確に標識することができる。ヨウ化プロピジウム(PI)は、二本鎖DNAへの挿入時に赤色蛍光を放出する臭化エチジウムの類似体である。PIは、損傷した細胞膜を通過するだけなので、特に死細胞を検出する。
このプロトコルでは、まず、マウス小腸から被検査を分離し、それを腸内で腸状として培養する方法を説明する。次に、EdUおよびPIの組み込みおよびフローサイトメトリーによる腸内の増殖細胞および死細胞の分析方法を説明する。

<table><tbody><tr><td>15 mL 遠心分離管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 G 強制針</td><td>VWR</td><td>20068-608</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルプレート</td><td>Nunc</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 mm 滅菌セルストレーナー</td><td>BD</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心分離チューブ</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70 mm 滅菌セルストレーナー</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT Acoustic Focusing Cytometer</td><td>Invitrogen</td><td>A24863</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement</td><td>GIBCO</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Buffer 1</td><td></td><td></td><td>2 mM EDTA in DPBS</td></tr><tr><td>Buffer 2</td><td></td><td></td><td>54.9 mM D-sorbitol, 43.4 mM sucrose in DPBS</td></tr><tr><td>C57/B6</td> <td>マウス南京大学</td><td></td><td></td>南京生物医学研究所</tr><tr><td>細胞解離酵素(TrypLE)</td><td>Life technologies</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>機 <td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 594 イメージングキット</td><td>寿命技術</td><td>C10639</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>パナソニック</td><td>MCO-18AC</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO</td><td></td><td></td></tr> 14190144 <tr><td>D-ソルビトール</td><td>BBI</td><td>SB0491</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>BBI</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>ENR メディア</td><td></td><td></td><td>ミニガット培地、50 ng/ml EGF、100 ng/ml ノギン、500 ng/ml R-スポンジン</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>ファインアイリスハサミ</td><td>Tansoole</td><td>2037454</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX サプリメント</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 血清</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 16210-064</td><td></td></tr><tr><td>HDMEM</td><td>ハイクロン</td><td>SH30243.01B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Minigut 培地</td><td></td><td></td><td>Advanced DMEM/F12, 2 mM Glutamax, Penn/Strep (100 units/ml), 10 mM Hepes, N2 supplement (1:100), B27 supplement (1:50)</td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>R&D</td><td>AR009</td><td></td></tr><tr><td>非イオン性界面活性剤 (Triton X)</td><td>BBI</td><td>TB0198-500ML</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ (12.5cm)</td><td>タンソール</td><td>2025785</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (PFA)</td><td>sigma</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Penn/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>位相差顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>TS1000</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Σ</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>組換え EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス R-Spondin 1</td><td>R&D</td><td>3474-RS-050</td><td></td></tr>組<tr><td>換えマウスIL-22</td><td>PeproTech</td><td>210-22-10</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>BBI</td><td>SB0498</td><td></td></tr><tr><td>組織鉗子</td><td>Tansoole</td><td>2026704</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HC1</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

腸上皮は、病原性微生物叢や毒素などの発光内容物が身体の残りの部分に入るのを防ぐ障壁として機能する。上皮バリア機能は、腸上皮細胞の完全性を必要とする。上皮細胞の増殖はバリアを形成する細胞の連続層を維持する一方で、上皮損傷はバリア機能障害を引き起こす。その結果、明るい内容物は、制限のない経路を介して腸の障壁を越えることができます。腸内バリアの機能不全は、炎症性腸疾患などの多くの腸疾患に関連している。単離されたマウス腸管は、腸オルガノイドまたは「腸内ロイド」と呼ばれるクリプト・ビラス様構造として培養および維持することができる。腸内ロイドは、腸管上皮細胞の増殖および細胞死をインビトロで研究するのに理想的である。このプロトコルでは、培養エンテロイド中の増殖細胞および死細胞数を定量化する簡単な方法を説明する。5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびヨウ化プロピジウムは、腸内の増殖および死細胞の標識に使用され、増殖および死細胞の割合は、フローサイトメトリーによって分析される。これは、腸上皮細胞増殖および細胞生存に対する薬物治療の効果を試験するのに有用なツールである。

小腸のクリプトは、基細胞膜マトリックス中の腸ロイドとして単離し、培養した。エンターイドは、分離の2日後に芽を形成し始めました。6日目、腸内ロイドは、内腔に多くの破片(死細胞)を持つ多くの芽を持っていました。この段階で腸ロイドは継代を行う準備ができていました(図3)。
多くの研究は、炎症性サイトカインが腸上皮性恒常性の維持に不可欠であることを示している。炎症性サイトカインの異常な発現は、炎症性腸疾患11の発生と密接に関連している。例えば、我々の以前の研究は、IL-22がトランジット増幅細胞の増殖を促進するが、Lgr5+幹細胞12を枯渇させることも示した。
腸イドはIL-22で3日間処理し、その後、合成DNAをEdUで標識して細胞増殖を示した。IL-22処理されたエンチドイドは、EdU+細胞の数を増加させた(<strong class...

提示されたプロトコルは、フローサイトメトリーを使用して、培養マウスエンターイドにおける増殖細胞および死細胞の数を定量化する。この方法は、オルガノイドの増殖および生存に対する薬物治療の効果を評価するのに役立つ。

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

このプロトコルは、細胞増殖とエンタイドの生存を調査することに加えて、培養中の腸内分離に有用である。科学者は、腸内の培養にこの技術を適用し、インビトロで腸上皮細胞に対する薬物および炎症性サイトカインの効果を研究することができます。この技術の意味は、炎症性腸疾患の水療法にも及ぶ。我々は、いくつかの治療サイトカインを見つけるために、この方法を適用します.この方法は、腸上皮増殖および生存に関する洞察を提供する;加えて、腸以外の組織の周りに培養されたオルガノイドにも使用され得る。腸内窩を分離し、腸内培養を行うために、組織鉗子を使用し、虹彩はさみを見つけて、安楽死させた8週間齢の野生型マウスから約8センチメートルの回腸を解剖する。ガベージ給餌針付きの注射器を使用して、氷冷ダルベックコのリン酸緩衝生理食塩水の約40ミリリットルで回腸を洗い流し、ハサミで縦に切り、回腸を開きます。回腸を小さく切り、15ミリリットルの円錐形チューブに滅菌氷冷DPBSの5ミリリットルに入れる。その後、氷の上で5分間サンプルを揺らします。ピペットコントローラを使用してDPBSを吸引し、10ミリリットルのコールドバッファーに交換します。氷の上で30分間揺れた後、ピペットコントローラを使用してバッファ1を吸引し、10ミリリットルのコールドバッファー2に置き換えます。その後、毎分約80回揺れで手で2〜3分間振ります。揺れの後、顕微鏡下で2つの内容物を緩衝液の20マイクロリットルの液滴を検査し、粒状のPaneth細胞を有する納骨堂があることを確認する。70ミクロンの滅菌細胞ストレーナーを用いた2つの内容物を濾過し、50ミリリットルの円錐管に濾過したバッファーを集める。ピペット20マイクロリットルの濾液をスライド上に濾過し、納骨堂を数える。フィルター処理されたバッファーの 2 つの内容の十分なボリュームを転送して、井戸あたり約 500 個の暗号が存在することを確認します。摂氏4度で10分間150倍Gでスピンダウンし、上清を慎重に吸引します。500個の暗号に対して50マイクロリットルの基部膜マトリックスで再懸濁する。気泡を避けるために注意してピペット上下。24ウェルプレートの1つの井戸の中央に、基部膜マトリックスとクリプトミックスの50マイクロリットルの液滴を置きます。37°Cで30分間インキュベートし、基質膜マトリックスを重合します。重合の30分後、慎重に各ウェルにミニグット培地の600マイクロリットルを追加します。プレートを摂氏37度のインキュベーターに戻し、毎日顕微鏡で観察し、2~3日ごとに培地を交換します。腸を通過するには、組織培養プレートを氷の上に置き、培地を吸引し、各ウェルに冷たいDPBSを1ミリリットル加える。P1000 チップを使用して、行列のチャンクが残らないまでピペットを上下に移動します。サンプルを1ミリリットルのインスリン注射器を通して、15ミリリットルの円錐形チューブに下に渡します。G150倍と摂氏4度で5分間回転した後、ピペットを使用してDPBSを取り除きます。腸内を井戸当たり50マイクロリットルの基質膜マトリックスで再懸濁する。プレートを37°Cのインキュベーターに30分間置き、基質膜マトリックスを重合させます。次に、ENR培地の600マイクロリットルで各井戸を重ね、プレートをインキュベーターに戻します。エンタイドを5〜7日間成長させ、1〜2の分割比を使用して新しい24ウェルプレートに渡します。各ウェルにENR培地600マイクロリットルを加え、37°Cインキュベーターで4〜5日間エンターイドをインキュベートします。未処理の腸内の対照群とインターロイキン-22の1ミリリットル当たり5ナノグラムで処理されたエンテロイドの実験群を設定する。各グループに対して少なくとも 3 つのレプリケートを準備します。600マイクロリットルのEdU培地をエンタイドの各ウェルに加え、背景減算の負のコントロールとして使用するウェルを1つ除きます。37°Cインキュベーターでプレートを2時間インキュベートします。基部膜マトリックスからエンタイドを収穫するには、ピペットコントローラを使用してEdU培地を吸引し、DPBSで1回洗浄します。その後、DPBSを1ミリリットル加えます。固体基質膜マトリックスの塊が残らないまで、P1000ピペットチップを使用して上下にピペットを使用します。サンプルを15ミリリットルのチューブに移し、上清を捨てる前に5分間Gの300倍でスピンダウンします。500マイクロリットルの細胞解離酵素を加え、摂氏37度で15分間インキュベートします。次に、P200ピペットチップを使用してピペットを上下にピペットし、腸内を単一細胞に分解します。次に、10%の胎児ウシ血清を含むダルベックの修正イーグル培地を3ミリリットル加え、P1000ピペットチップを繰り返しピペットします。300回Gで5分間遠心し、上清を吸引した後、細胞を1ミリリットルのDPBSで懸濁させた。細胞の固定および透過を行うために、まず細胞懸濁液を5ミリリットルチューブの1点に移し、Gで5分間300回スピンダウンし、上清を捨てる。細胞を4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルに吊り下げ、室温で15分間固定します。5分間Gの300倍で遠心した後、ピペットチップで上清を吸引する。DPBSで細胞を一度洗い、再びスピンダウンして上清を取り除きます。1ミリリットルの非イオン性界面活性剤を1ミリリットルで再懸濁し、室温で10分間インキュベートしてから、細胞をDPBSで洗浄する。EdUを検出するには、1.5ミリリットルのチューブに反応カクテルを100マイクロリットル加えます。細胞を再懸濁し、光から保護し、室温で30分間インキュベートする。5分間Gの300倍で遠心した後、ピペットチップで反応液を軽く吸引し、各チューブに0.5%非イオン性界面活性剤浸透剤を加えて室温で1回洗浄する。前のように遠心分離に続いて、1ミリリットルのDPBSで細胞を懸濁させる。40ミクロンのストレーナーで再懸濁細胞を濾過し、15ミリリットルの円錐管に濾過した細胞を集める。できるだけ早くマシン検出に関する事実を実行します。フローサイトメトリー解析に適したチャンネルと電圧を選択します。格紙の戦略では、FSC-A対SSC-Aの疑似色プロットを描画し、電圧を調整することによって、ほとんどのセルをドットマップの可視範囲に分配します。セルの母集団を R1 として選択し、左下隅のセルデブリを除外します。R1細胞集団から、FSC-A対FSC-H疑似色プロットを確立する。ゲートを設定して、R2 として指定された単一セルを選択し、セルの束を除外します。R2細胞集団から、蛍光強度対細胞数プロットを確立し、陰性制御を使用してゲートを設定する。蛍光シグナルの領域は、R3と指定された正の細胞領域であり、実験群と対照群との間のこれらのEdU陽性細胞の比率を比較する。小腸窩を単離し、基部膜マトリックス中のエンテロイドとして培養した。エンテロイドは、分離の2日後に芽を形成し始めました。6日目、腸内には内腔にたくさんの破片が入った芽が多く入っていました。腸は、この段階で通過する準備ができていました。エンテノイドをIL-22で3日間処理し、その後、合成DNAを赤で標識し、細胞増殖を示した。IL-22処理されたエンテロイドは、EdU陽性細胞の増加数を示した。IL-22は、フローサイトメトリーで分析した40.1%から83.5%に増殖細胞を増加させた。IL-22治療はまた、赤でヨウ化プロピジウム染色によって示されるエンタノイドの細胞死を増加させる。IL-22は、フローサイトメトリーで分析した死細胞を4.9%から16.2%に増加させた。暗号分離の進行の間、十分な暗号が揺さぶられるようにバッファを追加した後、公正な揺れが必要です。顕微鏡で内容物を検査することをお勧めします。この手順に従って、特定の方法を用いて分化された上皮の種類と腸内膜を定量化することも可能です この方法は、研究者がエンテロイドの腸上皮分化を調査するのに役立ちます。その開発後、この質問は、消化器科の分野の研究者がカットの発達または病理学的な質問を探求する方法を開きます。

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Research

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Biology

生物学

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壊死性腸炎新規ヒト上皮 Enteroid モデル

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インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

このプロトコルは、胎児の腸組織からの3次元腸モデルであるエンテロイドの確立を詳述しています。上皮バイオマーカーの免疫蛍光イメージングをモデルの特性評価に使用しました。細菌性エンドトキシンであるリポ多糖の頂端曝露は、マイクロインジェクション技術を用いて、蛍光デキストランの漏出によって測定される用量依存的に上皮透過性を誘導した。...

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エンテロイドは、組織生理学や病態生理学、医薬品開発、再生医療を研究するための新しいモデルとして浮上しています。ここでは、関連する組織細胞タイプとの共培養を可能にするウシ初代細胞2Dエンテロイド由来培養システムについて説明します。このモデルは、消化器研究のモデリングにトランスレーショナルな利点をもたらします。...

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生蛍光顕微鏡を用いたヒト結腸オルガノイドにおけるサイトカイン誘発性細胞死の定量化(英語)

この研究では、小腸と大腸に由来するブタオルガノイドの2D単層を生成するためのプロトコルを概説しています。これらの単層の成長は、TEER値の増加によって特徴付けられ、堅牢な上皮の完全性を示します。さらに、これらの単分子膜は、フォルスコリンの適用後のUssingチャンバー実験で生理学的分泌応答を示します。...

天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド

ここでは、標準的なマトリックス包埋オルガノイド培養物からアピカルアウト腸オルガノイドを生成するためのプロトコールについて説明します。また、その後の活発増殖細胞へのEdUの組み込みと、EdU陽性細胞の半自動定量についても概説します。...

EdU標識を用いたアピカルアウト腸オルガノイドの作製とオルガノイド増殖速度の評価

学ぶ腸内細胞増殖と死細胞の定量化法。マウス回腸由来エンテロイドを培養し、フローサイトメトリーで薬剤や炎症性サイトカインの影響を評価する。炎症性腸疾患治療研究に応用可能です。

腸内細胞増殖細胞および死細胞の定量化

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