Name: 遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: 学ぶレーザー捕捉微小分片法によるマウス胚の軟骨と骨の分離技術。クレシルバイオレット染色で組織を可視化し、高品質RNAを確保して遺伝子発現解析を行う方法を解説。

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この研究は、国立歯科・頭蓋顔面研究所(R01DE022988)とユーニス・ケネディ・シュリバー国立小児保健・人間開発研究所(P01HD078233)によって支援されました。著者らは、シナイ山のイカーン医学部のライカLMD 6500プラットフォームへのアクセスに対するバイオリポジトリと病理学コアに感謝する。

マウスからの組織は、実験動物のケアと使用のための国立衛生ガイドに従って取得され、研究プロトコルは、マウントシナイのイカーン医学部の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 新鮮な冷凍標本の調製
<ol><li>目的の胚または組織を解剖する。最適な切断温度(OCT)化合物を使用して、使い捨て埋め金型にサンプルを埋め込みます。先端または針で試料の向きを調整します。</li>
	<li>ドライアイス/メチル-2-ブタン浴でサンプルを急速に凍結します。次のステップに進むか、-80 °Cで保存します。 注:プロトコルはここで一時停止できます。</li>
</ol>2. レーザー捕捉マイクロダイセクション用クライオセクション
<ol><li>70%エタノールでクライオスタットときれいな内部表面を解凍します。RNase除染剤でアンチロールプレートと鉗子のペアを処理します。クライオスタットを所望の切断温度(-18~-22°C)に設定します。ドライアイスで蓋付き容器を準備し、凍結切除中に断面サンプルスライドを一時的に保管するために、ドライアイスにアルミニウム箔のシートを置きます。 注意:ドライアイスは非常に寒いです。ドライアイスは常に注意して取り扱い、取り扱う時は必ず絶縁手袋を着用してください。</li>
	<li>新鮮な冷凍試料をドライアイスのバケツに移します。OCT化合物の層をクライオスタット標本ホルダーの上に置き、直ちに優しい圧力でOCTの上に標本を置きます。OCTが完全に凍結したら、ホルダーを試料でクライオスタット切断アームに固定します。</li>
	<li>サンプルをクライオスタットに15分間残して、切断温度に平衡化します。</li>
	<li>組織をセクションし、12μmの厚さでポリエチレンナフタレート(PEN)膜スライド上のスライスを収集します。膜上で連続した断面を揃えます。1つのスライドが完了したら、セクションを数分間乾燥させ、必要なスライドがすべて収集されるまでドライアイス容器内のホイルにスライドを移します。</li>
	<li>スライドを -80 °C のスライド ボックスに保管します。 注:セクションの厚さは、組織の効率的な切断を可能にしながら、収集された組織の量を最大化するために選択され、および目的の組織によって異なる場合があります。プロトコルはここで一時停止できます。スライドを RNase 汚染から解放します。温度変化を避けてください。最大 6 か月間保存されたスライドからの RNA の RIN は、まだ RNA の高品質を示している可能性がありますが、できるだけ早くスライドを使用することをお勧めします。</li>
</ol>3. レーザーキャプチャマイクロダイズセクションのサンプル調製
<ol><li>染色および脱水のための解決策を準備する。<ol>
<li>氷上の3つの50 mL遠心管のそれぞれに80%エタノールの45 mLを置きます。#1、#2、#3としてラベル付けします。RNase/DNaseフリーウォーターでエタノールを希釈します。</li>
		<li>氷上の50 mL遠心管に95%エタノールの45 mLを入れます。</li>
		<li>氷上の50 mL遠心管に100%エタノールの45 mLを入れます。</li>
		<li>室温で50mL遠心管にキシレン45mLを入れます。 注意:キシレンはヒュームフードに使用する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PEN膜スライドを手袋の手に当てて簡単に解凍し、50 mL遠心管で攪拌を加えて80%エタノール(#1および#2)の45 mLでそれぞれ30sを2回洗浄し、OCTを除去します。 注:染色前にOCTを除去し、染色中にOCTが緩むのを防ぎ、切片を隠さないようにすることが重要です。鉗子は攪拌によって洗い流されないOCTの除去を促進するために使用することができる。</li>
	<li>アルミ箔のシートにスライドを敷きます。ピペット 0.8 mL 0.1% クレシルバイオレットを 50% エタノールでスライドに上し、30 s の染色を行い、スライドを 80% エタノール (#3) の 45 mL で 30 s で 30 s に洗浄し、次に 95% エタノール、100% エタノール、およびキシレンを 50 mL セントリフュージ チューブで 30 s ずつ 30 mL ずつ脱水します。</li>
	<li>キシレンとドライセクションを排出するために5分間繊細なタスクワイパーにスライドを立ちます。 注:スライドはLCMの前に完全に乾燥する必要があります。</li>
</ol>4. レーザーキャプチャマイクロダイセクション
注:LCMを行いながら、粉末フリーのニトリル手袋を着用してください。
<ol><li>LCM顕微鏡、レーザー、およびコンピュータの電源を入れます。コンピュータにログオンし、ソフトウェアを起動します。キーを「オン」の位置に回してレーザーを起動します。緑色のライト(レーザー)が点灯したら、赤いボタンを押してレーザーを作動させ、レーザーが使用する準備ができていることを示す光(レーザー)が赤色に変わります。 注:レーザーは、ウォームアップに約10分を必要とします。</li>
	<li>回収管を設定します。<ol>
<li>0.5 mLポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブのキャップをコレクターに挿入します。 注:目的の PCR チューブ(0.2 または 0.5 mL)の一致するコレクターを選択します。</li>
		<li>ピペット50μLの抽出緩衝液(材料の表に記載されたRNA分離キットによって提供される)を0.5 mL回収管のキャップに入れた。</li>
		<li>回収装置を顕微鏡に挿入します。</li>
		<li>「コレクター・デバイスの変更」ウィンドウで、「参照ポイントに移動」ボタンをクリックして、コレクターを基準点(RP)に移動します。RP をはっきりと表示するようにフォーカスを調整します。矢印をクリックして RP をビューの中央に移動します。</li>
	</ol></li>
	<li>積み込み標本スライド。<ol>
<li>ツールバーの左の[アンロード]ボタンをクリックして、スライドホルダーを下げます。</li>
		<li>組織部を下向きにして、スライドをホルダーに入します。 注:この向きは捕獲されたティッシュセクションが重力によって集出管の帽子に落ちるように保障する。</li>
		<li>ホルダーをステージに挿入し直します。</li>
	</ol></li>
	<li>レーザー パラメータを設定します。<ol>
<li>レーザーメニューの[コントロール]オプションを選択するか、[レーザー ]アイコンをクリックします。</li>
		<li>必要に応じてこれらのパラメータを調整する:パワー、レーザーのパワー。絞り、レーザーの幅;と速度、描画とカットモードでの切断の速度。 注:対象外の領域でレーザーをテストします。より高い力またはより大きい開口部は切り取りが容易になるが、細胞に多くの損傷を引き起こす。力、絞り、および速度の組み合わせを調整して、組織の効率的な切断と最小限の損傷を得る。たとえば、12 μm セクションの軟骨組織の場合、Power = 40、絞り = 5、速度 = 7 です。</li>
	</ol></li>
	<li>対象領域を選択して切り取ります。<ol>
<li>5倍の目標から始めて関心のある領域を見つけ、関心のある領域を最もよく示す目標 (5x、10x、または 40x) に切り替えます。 注:クレシルスミレ染色後、軟骨はマゼンタに染色され、ミネラル化された組織は茶色または黒色に見え、他の組織と区別できる。イメージは、[ファイル]メニューの [名前を付けてイメージを保存]を使用して保存できます。</li>
		<li>コレクターのマークをクリックして、収集するチューブ(A、B、C、D)を選択します。</li>
		<li>[移動] を選択し、[切り取り] または [描画して切り取り] を選択します。移動およびカットモードでは、マウスまたはタッチスクリーンペンを使用して形状をフリーハンドで描画し、標本を手動でカットします。描画モードと切り取りモードでは、後続の切り取りのためにマウスまたはタッチスクリーン ペンを使用して図形をフリーハンドで描画できます。[カットの開始]ボタンをクリックして、レーザー切断を開始します。</li>
		<li>カットが完了すると、PEN膜を有する標的組織は重力によって回収管のキャップに落ちる。必要に応じて、4.5 を繰り返して複数の対象エリアをプールします。 注:不完全な切断のために組織が回収管のキャップに落ちない場合は、切り傷を繰り返したり、パワーや絞りを増やしたりする必要があります。ミネラル化された骨(茶色または黒)はレーザーで直接切断することはできません。</li>
	</ol></li>
	<li>コレクターをアンロードし、PCRチューブを慎重に閉じます。マイクロセク剖された組織をドライアイスに入れ、次のステップに進むか、-80 °Cで保存します。 注:プロトコルはここで一時停止できます。次のサンプルについては、4.2 ~ 4.6 を繰り返します。</li>
</ol>5. 微分組織のライシスとRNA単離
<ol><li>マイクロセ剖した組織を室温で解凍します。遠心分離機を短時間でインキュベートし、42°Cで30分間サンプルをインキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、lysisバッファーを0.5 mL PCRチューブにスピンダウンします。RNA分離キットを使用してDNase処理とRNA抽出を実行します(材料表を参照)。</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

LCMは、異種組織からの濃縮または均質な細胞集団の単離を可能にする。その利点は、その生体内文脈における細胞の迅速かつ正確な捕捉を含むが、潜在的な欠点は、時間がかかり、費用がかかり、かつ、ユーザが指定されたサンプル30内の個別の部分集団を認識する必要性によって制限されることを含む。このプロトコルは、マウス胚軟骨および骨のLCMの詳細を提供し、RNA-seqによるその後の分析のために高いRNA完全性を維持しながら、正確な組織採取のために軟骨および骨を可視化する迅速な手順でクレシルスミレ染色の使用を強調する。このプロトコルの1つの制限は、ここで使用されるLCMシステムがミネラル化された組織(例えば、図2Cの黒色の下顎組織)を直接切断することができないことです。その結果、骨領域全体を解剖する必要があります。特に、LCMによって単離された微分化されたオセジ化領域は均質ではなく、骨芽細胞、骨細胞、および破骨細胞の少なくとも亜集団を含む(表1)。それにもかかわ...

筋骨格系は、筋肉、結合組織、腱、靭帯、軟骨、および骨からなる多成分系であり、神経によって内在し、血管1によって血管化される。骨格組織は、細胞の不均一性と構造的複雑さの増加に伴って発症する。軟骨と骨は、同じ骨軟骨葉ゲニター系統から発症し、非常に関連しています。胚軟骨と骨は、筋肉、神経、血管、未分化間感に関連して発症する。軟骨はまた、メッケルの軟骨や下顎骨内の軟骨軟骨などの骨に囲まれていてもよい。これらの組織は解剖学的に関連しており、発達中に細胞外シグナルを介して互いに相互作用する。軟骨および骨の発達における遺伝子発現の研究において、1つの障害は、複数の組織型からなる骨格構造の不均一性である。目的の特定の組織の正確な分離は、転写分析を成功させるために重要です。
レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織内の目的の細胞の種類または領域を分離するための強力なツールであり、再現性があり、単一細胞レベル2に敏感である。これは、トランスクリプトミクス、ゲノミクス、およびプロテオミクス3、4における幅広い下流アッセイに対して目的の細胞を正確に標的にし、捕捉することができる。単離されたRNA、DNA、またはタンパク質の品質は、バイオアナライザまたは同等のプラットフォームで評価することができます。例えば、RNA品質は、RNA完全性数(RIN)5で示される。
ここでは、新鮮な凍結組織からのLCMによる軟骨および骨の迅速な染色および単離のためのプロトコルを提供する。マウス胚を使用して、このプロトコルがRNAシーケンシング(RNA-seq)などの後続のトランスクリプトミクス解析のために高品質のRNAを生成することを実証します。

<table><tbody><tr><td>2-メチルブタン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>O3551-4</td><td></td></tr><tr><td>バイオアナライザー</td><td>アジレント</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>339653</td><td>円錐形滅菌ポリプロピレン遠心チューブ、50 mL</td></tr><tr><td>クレシルバイオレットアセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカバイオシステム</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>デリケートタスクワイパー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て埋め込み金型</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>1220</td><td></td></tr><tr><td>蒸留水</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>DNase/RNase-Free</td></tr><tr><td>エタノール、絶対(200プルーフ)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2818</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>ガラスPENメンブレンスライド</td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>11505158</td><td></td></tr><tr><td>LCMシステム</td><td>ライカマイクロシステム</td>ズ <td>ライカLMD6500</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック 12-545FP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>OCT 化合物</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>102094-106</td><td></td></tr><tr><td>フラットキャップ付きPCRチューブ、0.5 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-05-C</td><td>LCMコレクションチューブ</td></tr><tr><td>永久埋込用培地</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>RNA分離キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RNase除染剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2020</td><td>表面洗浄用RNase除染剤</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>214736</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

レーザー捕捉マイクロダイセクション(LCM)は、異種組織から目的の特定の細胞タイプまたは領域を分離するための強力なツールです。骨格要素の細胞および分子複合体は、発達とともに増加する。軟骨および骨の界面や周囲の組織との界面など、組織の不均一性は、軟骨および骨を発達させる研究の障害の1つである。当社のプロトコルは、遺伝子発現解析のための高品質RNAを生み出す軟骨および骨の組織処理および単離の迅速な方法を提供します。マウス胚の新鮮な凍結組織は切り離され、短いクレシルバイオレット染色は、周囲の組織とは異なる色で軟骨および骨を視覚化するために使用される。その後、スライドは急速に脱水され、軟骨と骨はLCMによってその後単離される。このプロセス中の水溶液への暴露の最小化は、RNAの完全性を維持します。E16.5におけるマウスメッケルの軟骨と下顎骨の採取に成功し、遺伝子発現解析により骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞のマーカー遺伝子の微分発現が示された。高品質のRNAはまた、組織および胚性年齢の範囲から単離された。このプロトコルは、低温栓、断面、染色および脱水新鮮な凍結組織を含むLCMのサンプル調製、およびLCMによる軟骨および骨の正確な分離を詳細に説明し、転写分析のための高品質RNAをもたらす。

E16.5の新鮮な凍結マウス組織のコロナセクションは、メッケル軟骨(MC)、結節軟骨、およびLCMによる下顎骨の分離および採取を実証するために使用された。E16.5のマウス胚を解剖し、OCT化合物で極低温型に埋め込んだ。金型中のサンプルをドライアイスおよびメチル-2-ブタン浴中で急速に凍結し、-80°Cで保存した。
軟骨および骨のクレシルスミレ染色を実証するために、コロナ面での凍結切除を行い、顕微鏡スライド上でサンプルを採取した。上記のプロトコルに従って切片を洗浄、染色、脱水した(ステップ3.2~3.4)。スライドを空気乾燥し、永久取り付け媒体で取り付けた。検査したすべての軟骨は、染色マゼンタ(MC、顆粒軟骨、鼻中隔軟骨、肋軟骨、前駆骨の軟骨原始、半径および尺骨の軟骨原始)であり、すべてのミネラル化された組織は茶色または黒色に染色された(図1A-E)。軟骨と骨の両方が、複数の解剖学的部位で他の組織と容易に区別された。
LCMの場合、E...

このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

骨格構造の不均一性は、軟骨や骨の発達における遺伝子発現の研究における1つの障害である。このプロトコルは、隣接する組織の正確な分離方法を提供します。後の分析のために高いRNA完全性を維持することにより、これらの組織を正確に収集するために、クレシルバイオレット染色を用いて軟骨および骨のレーザー捕捉マイクロディシスを最適化します。他の組織は、クレシルバイオレットが標的組織の十分な区別を提供し、RNAの品質が我々の処理方法の後に高いままであれば単離することができる。このような組織には、頭蓋顔面縫合と脳が含まれます。クライオセクションングは、このプロトコルの中で最も要求の厳しいスキルです。RNAの最高の完全性を維持するために、組織が迅速に解剖され、埋め込まれていることを確認してください。この手順を開始するには、目的の胚または組織を解剖する。最適な切断温度化合物を使用して使い捨て型にサンプルを埋め込み、試料の向きを先端または針で調整します。サンプルをドライアイスとメチル-2-ブテン浴で迅速に凍結します。次に、ドライアイスを含む蓋付き容器を、ドライアイスにアルミ箔を置き、凍結切断時に解剖サンプルスライドを一時的に保存します。新鮮な凍結標本をドライアイスのバケツに移します。最適な切断温度化合物の層をクライオスタットの標本ホルダーに置き、すぐに穏やかな圧力で最適な切断温度化合物の上に標本を置きます。最適な切断温度化合物が完全に凍結したら、ホルダーに試料を付けて、クライオスタットの切断アームに固定します。サンプルをクライオスタットに15分間放置し、切断温度に平衡させます。その後、12マイクロメートルの厚さで組織を切り離し、PEN膜スライド上のスライスを収集します。膜上の連続したセクションを整列します。スライドが完了したら、セクションを数分間乾燥させ、必要なすべてのスライドが収集されるまでドライアイス容器のホイルにスライドを移します。スライドボックスにマイナス80°Cでスライドを保存します。まず、ラベル付けされた3本の15ミリリットル遠心分離管を用意します。各チューブに80%エタノールの45ミリリットルを加えます。氷の上に3本のチューブを置きます。95%エタノールの45ミリリットルを含むチューブと氷の上に100%エタノールを含むチューブを置きます。次に、室温で50ミリリットルの遠心分離管に45ミリリットルのキシレンを加えます。PEN膜スライドを手袋をした手に当てはめて短時間解凍し、80%エタノールを含む各チューブに30秒間2回洗浄し、最適な切削温度化合物を除去します。次に、スライドをアルミニウム箔のシートの上に置きます。ピペット8ミリリットルの1%クレシルバイオレットと50%エタノールをスライドに、30秒間染色します。80%エタノールを含む第3のチューブでスライドを30秒間洗浄します。95%エタノールを含むチューブを30秒間通してスライドを脱水し、100%エタノールを含むチューブを30秒間、最後に、キシレンを含むチューブを30秒間行う。この後、スライドを繊細なタスクワイパーに5分間置き、キシレンを排水し、セクションを乾燥させます。まず、レーザーキャプチャマイクロディスセクション顕微鏡、レーザー、およびコンピュータをオンにします。コンピュータにログオンし、ソフトウェアを起動します。緑色のライトが点灯したら、赤いボタンを押してレーザーを有効にします。ライトが赤く変わると、レーザーを使用する準備が整います。5 ミリリットル PCR チューブのキャップをコレクターに挿入します。ピペット50マイクロリットルの抽出バッファーをキャップに入れ、収集装置を顕微鏡に挿入します。[コレクター デバイスの変更]ウィンドウで、[参照点に移動]ボタンをクリックして、コレクターを参照点に移動します。フォーカスを調整して、参照点を明確に表示します。次に、ツールバーの左のアンロードボタンをクリックして、スライドホルダを下げます。下向きの組織セクションを持つホルダーにスライドを置き、ホルダーをステージに戻します。変更標本ウィンドウで[続行]をクリックします。レーザーパラメータを設定するには、レーザーメニューの制御オプションを選択するか、レーザーアイコンをクリックします。必要に応じて、次のパラメータを調整し、レーザーのパワーであるパワー、レーザーの幅である絞り、およびドローとカットモードの切断速度である速度を調整します。5Xの目的から始め、関心のある分野を見つけ、関心のある分野を最もよく示す目的に切り替えます。コレクターでマークをクリックして、収集するチューブを選択し、移動を選択し、カットまたはカットを行います。切断が完了すると、PEN膜を有する標的組織は重力によってコレクション管のキャップに落ちる。必要に応じて、この選択と切断プロセスを繰り返して、複数の対象領域をプルします。この後、コレクタをアンロードし、PCRチューブを慎重に閉じます。マイクロディセックした組織をドライアイスの上に置きます。マイクロディセックした組織を室温で解凍し、次に遠心分離機を短時間解凍し、サンプルを摂氏42度で30分間インキュベートします。この後、5ミリリットルPCRチューブに分解液を回転させます。メーカーの指示に従って、RNA分離キットを使用してDNase処理とRNA抽出を行います。本研究では、軟骨および骨の微細切除を最適化したレーザーキャプチャーが行われ、その後の分析のために高いRNA完全性を維持しながら、軟骨および骨を正確に組織採取するために視覚化する迅速な手順におけるクレシルバイオレット染色の使用を強調した。スライドの観察は、検査されたすべての軟骨が染色されたマゼンタであり、すべての鉱物化された組織が茶色または黒色に染色されていることを示しています。軟骨と骨の両方が複数の解剖学的部位で他の組織と容易に区別される。メッケルの軟骨、顆軟骨、下顎骨領域は、レーザー捕捉マイクロディセクショネによって選択され、単離される。シーケンシングに十分なRNAを得るために、メッケルの軟骨の10領域、顆軟骨の10領域、または下顎骨の4つの領域をそれぞれ3つの個別の採取管に引き出す。RNAを抽出し、全体のRNAをバイオアナライザを用いて分析します。このレーザーキャプチャマイクロディスセクションプロトコルは、異なる発達段階で様々な組織に使用され、RNA完全性数測定は、高いRNA品質を示しています。次いで、遺伝子発現の微分解析が行われる。下顎骨とメッケル軟骨の間には4,006個の遺伝子が有意に異なって発現している。骨芽細胞または骨細胞に特異的な遺伝子は下顎骨骨でより高く発現され、軟骨細胞特異的遺伝子はメッケルの軟骨でより高く発現する。さらに、破骨細胞マーカーは下顎骨においてより高く発現し、標的組織の分離に成功したことを示す。この手順に従って、qPCRおよびRNA-seqを含む遺伝子発現解析を行うことができる。これらの方法は、異種組織内の特定の組織または関心のある領域におけるトランスクリプトームの遺伝子発現を解析することができる。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

哺乳動物の組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

レーザーマイクロダイセクションは、ローカライズされたRNAi実験に供ショウジョウバエの翅のディスクの特定のコンパートメントでの遺伝子発現プロファイリングの解析に適用した...

から細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングへの応用レーザーマイクロダイセクションショウジョウバエウィングディスク

マウス脳の特定の領域におけるRNA発現プロファイリングには、正確で再現性のある組織採取戦略が必要です。ここでは、冠状断による脳切断と組織コーラーを用いたマイクロダイセクションの両方を併用するプロトコルについて説明します。得られたサンプルから抽出した全RNAの収量と品質により、本手法の有用性が確認されています。...

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

我々は、海馬ニューロンまたは定量的リアルタイムPCRおよび/または全ゲノムマイクロアレイを用いてその後の遺伝子発現解析のために負傷したラット脳の凍結切片からの単一ニューロンの濃縮された集団を得るためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を使用する方法について説明します。...

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。...

遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化

ここでは、下流の RNA 解析のための小柱網 (TM) を隔離するため再現性のあるレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) のためのプロトコルについて述べる.TM での遺伝子発現の変化を分析する能力は、TM...

遺伝子発現解析のためのマウスの目から非常に純粋な小柱網のキャプチャ マイクロダイゼクション

心室固有 MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスから解剖マウス胚全体のマウント epifluorescent...

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

骨細胞の遺伝子発現解析に十分な量の高品質RNAを得るために、レーザー捕捉微細解剖(LCM)プロトコルが開発されました。現在の研究は、マウス大腿骨のセクションに焦点を当てています。しかしながら、ここで報告されるLCMプロトコルは、任意の硬質組織の細胞における遺伝子発現を研究するために使用することができる。...

新鮮な凍結マウスの骨から高品質のRNAを得るレーザー捕捉微解剖プロトコル

レーザーマイクロダイセクションを使用してRNAシーケンシングのために個々の線虫組織を単離するプロトコルが記載されている。このプロトコルは、種固有の遺伝子ツールキットを必要とせず、単一組織サンプルのレベルで異なる種間で遺伝子発現プロファイルを比較することを可能にする。...

種にとらわれない単一組織アプリケーションのためのレーザーマイクロダイセクション

本プロトコルは、パラホルムアルデヒド固定および最適切断温度化合物埋め込みマウス肝組織の定義された組織領域からRNAをレーザーキャプチャマイクロ解剖を用いて単離し、ターゲットを絞った下流遺伝子発現解析を可能にする方法を説明しています。...

パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

学ぶレーザー捕捉微小分片法によるマウス胚の軟骨と骨の分離技術。クレシルバイオレット染色で組織を可視化し、高品質RNAを確保して遺伝子発現解析を行う方法を解説。

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

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