Name: マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぶマウスインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答評価法。C57BL/6マウスを用いた免疫応答解析プロトコルは、抗体産生メカニズムの理解に不可欠です。

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上海のパスツール研究所のフローサイトメトリー施設、ABSL2施設、SPF動物施設のスタッフの皆様に、技術的なアドバイスとアドバイスをいただき、ありがとうございました。この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム(XDB29030103)、中国国家キーR&Dプログラム(2016YFA0502202)、中国国立自然科学財団(31570886)によって支えられました。

<ol><li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+Blimp-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and Blimp-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+Bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor Bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Pedros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TRAF-like+motif+of+the+inducible+costimulator+ICOS+controls+development+of+germinal+center+TFH+cells+via+the+kinase+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">A TRAF-like motif of the inducible costimulator ICOS controls development of germinal center TFH cells via the kinase TBK1.</a> Nature Immunology. 17 (7), 825-833 (2016).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+T-helper+cell+recruitment+governed+by+bystander+B+cells+and+ICOS-driven+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular T-helper cell recruitment governed by bystander B cells and ICOS-driven motility.</a> Nature. 496 (7446), 523-527 (2013).</li>
<li>Lee, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cell+priming+for+extrafollicular+antibody+responses+requires+Bcl-6+expression+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">B cell priming for extrafollicular antibody responses requires Bcl-6 expression by T cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 208 (7), 1377-1388 (2011).</li>
<li>Zotos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+regulates+germinal+center+B+cell+differentiation+and+proliferation+through+a+B+cell-intrinsic+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">IL-21 regulates germinal center B cell differentiation and proliferation through a B cell-intrinsic mechanism.</a> The Journal of Experimental Medicine. 207 (2), 365-378 (2010).</li>
<li>Vogelzang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fundamental+role+for+interleukin-21+in+the+generation+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A fundamental role for interleukin-21 in the generation of T follicular helper cells.</a> Immunity. 29 (1), 127-137 (2008).</li>
<li>Ansel, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemokine-driven+positive+feedback+loop+organizes+lymphoid+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A chemokine-driven positive feedback loop organizes lymphoid follicles.</a> Nature. 406 (6793), 309-314 (2000).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+Controls+Follicular+T+Helper+Cell+Positioning+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">PD-1 Controls Follicular T Helper Cell Positioning and Function.</a> Immunity. 49 (2), 264-274 (2018).</li>
<li>Methot, S. P., Di Noia, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+of+Somatic+Hypermutation+and+Class+Switch+Recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+ImmunoChemical%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms of Somatic Hypermutation and Class Switch Recombination.</a> Advanced ImmunoChemical. 133, 37-87 (2017).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annual Review of Immunology. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Calame, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cells%3A+finding+new+light+at+the+end+of+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasma cells: finding new light at the end of B cell development.</a> Nature Immunology. 2 (12), 1103-1108 (2001).</li>
<li>Yoo, J. K., Fish, E. N., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LAPCs+promote+follicular+helper+T+cell+differentiation+of+Ag-primed+CD4%2B+T+cells+during+respiratory+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">LAPCs promote follicular helper T cell differentiation of Ag-primed CD4+ T cells during respiratory virus infection.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1853-1867 (2012).</li>
<li>Leon, B., Bradley, J. E., Lund, F. E., Randall, T. D., Ballesteros-Tato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FoxP3%2B+regulatory+T+cells+promote+influenza-specific+Tfh+responses+by+controlling+IL-2+availability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">FoxP3+ regulatory T cells promote influenza-specific Tfh responses by controlling IL-2 availability.</a> Nature Communications. 5, 3495(2014).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+protein+1+promotes+follicular+helper+T+cell+differentiation+and+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix protein 1 promotes follicular helper T cell differentiation and antibody production.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (34), 8621-8626 (2018).</li>
<li>León, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TH2+development+by+CXCR5%2B+dendritic+cells+and+lymphotoxin-expressing+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of TH2 development by CXCR5+ dendritic cells and lymphotoxin-expressing B cells.</a> Nature Immunology. 13 (7), 681-690 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Foxp1+is+a+critical+negative+regulator+of+the+differentiation+of+follicular+helper+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Foxp1 is a critical negative regulator of the differentiation of follicular helper T cells.</a> Nature Immunology. 15 (7), 667-675 (2014).</li>
<li>Bouvier, N. M., Lowen, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+for+Influenza+Virus+Pathogenesis+and+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Animal Models for Influenza Virus Pathogenesis and Transmission.</a> Viruses. 2 (8), 1530-1563 (2010).</li>
<li>Miyauchi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+neutralizing+influenza+antibody+response+in+the+absence+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective neutralizing influenza antibody response in the absence of T follicular helper cells.</a> Nature Immunology. 17 (12), 1447-1458 (2016).</li>
<li>Rodriguez, L., Nogales, A., Martinez-Sobrido, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+Virus+Studies+in+a+Mouse+Model+of+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Influenza A Virus Studies in a Mouse Model of Infection.</a> Journal of Visualized Experiments. (127), (2017).</li>
<li>Kitano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+protein+expression+shapes+pre-germinal+center+B+cell+dynamics+and+follicular+helper+T+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Bcl6 protein expression shapes pre-germinal center B cell dynamics and follicular helper T cell heterogeneity.</a> Immunity. 34 (6), 961-972 (2011).</li>
<li>Yusuf, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germinal+center+T+follicular+helper+cell+IL-4+production+is+dependent+on+signaling+lymphocytic+activation+molecule+receptor+%28CD150%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Germinal center T follicular helper cell IL-4 production is dependent on signaling lymphocytic activation molecule receptor (CD150).</a> The Journal of Immunology. 185 (1), 190-202 (2010).</li>
<li>Sun, J., Dodd, H., Moser, E. K., Sharma, R., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+cell+help+and+innate-derived+IL-27+induce+Blimp-1-dependent+IL-10+production+by+antiviral+CTLs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD4+ T cell help and innate-derived IL-27 induce Blimp-1-dependent IL-10 production by antiviral CTLs.</a> Nature Immunology. 12 (4), 327-334 (2011).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

高親和性抗体を生成するためのB細胞の助けを提供する上で専門的な役割を果たしているため、Tfh細胞はワクチン設計のための新しい戦略を提供するために分化および操作のメカニズムにおいて広範囲に研究されてきた。インフルエンザウイルス感染は、TfhおよびGC B細胞の応答を活発に誘導し、この分野の研究に適したモデルとなる。本論文では、鼻腔内接種によるインフルエンザウイルス感染のプロトコル、フローサイトメトリーによるTfh関連応答の評価、免疫蛍光およびELISAについて述べた。これらのアッセイは、Tfh分化、GC Bの開発およびインフルエンザウイルス特異的抗体の検出を促進し、研究者が免疫応答における新しい重要な分子を探索し、同定するのに役立ちます。
インフルエンザウイルス感染マウスモデルの研究では、体重減少はマウス罹患率の一般的に使用される指標です。インフルエンザウイルス感染マウスにおける期待体重変化動態は 、図1aに記載されているように、マウスに誘導された適切な免疫応答を反映している。しかし、異常な症例は定期的に起こり、マウスは体重...

最近の10年間、新たに同定されたCD4+T細胞サブセット、Tfh細胞サブセットに多数の研究が焦点を当てられており、胚中心(GC)Bの開発におけるその本質的な役割について。B細胞リンパ腫6(Bcl6)は、主に遺伝子リプレッサーと考えられているが、Bcl6の異所性発現がTfh分化を促進するのに十分であるという証拠に対するTfh細胞の系統定義因子であり、Bcl6の欠乏は消失したTfh分化1、2、3をもたらす。炎症部位への移行によってエフェクター機能を実行する他のCD4+Tヘルパーサブセットとは異なり、Tfh細胞は、主に脾臓およびリンパ節のB細胞濾胞帯においてB細胞の助けを提供する。共刺激分子ICOSとCD40Lは、TfhとGC B細胞との相互作用において重要な役割を果たす。Tfh分化の間、ICOSは、同結合B細胞から必要なシグナルを伝達し、B細胞ゾーン局在4,5に対する傍観者B細胞からの移行シグナルを受け取る受容体としても機能する。CD40Lは、B細胞の増殖および生存のためのTfh細胞からのシグナルのメディターである6.CD40Lと同様の役割を果たすもう一つの要因は、主にTfh細胞によって分泌されるサイトカインIL21である。IL21はGC B細胞の高親和性抗体の開発と産生を直接調節するが、Tfh分化におけるその役割は依然として議論の余地がある7,8である。現在、フローサイトメトリー分析でTfh細胞を同定する際に最も頻繁に使用されているPD-1およびCXCR5は、このサブセットの分化と機能においても重要な役割を果たしています。CXCR5は、B細胞濾胞ケモカインの受容体であり、B細胞卵胞9におけるTfh細胞の局在化を媒介する。PD-1は、濾胞誘導機能を有するだけでなく、GCB細胞親和性成熟10の過程で臨界信号を伝達することも同定された。これらの知見に基づいて、これらの分子の発現を評価することは、基本的にTfh細胞の成熟および機能を反映することができる。
GCは、二次リンパ器官における誘導過渡的な微小解剖学的構造であり、Tfh細胞に非常に依存し、Tfh応答を評価するのに最適な読み出しである。GCにおいて、サイトカインおよび共刺激分子によって媒介される信号を受信した後、B細胞はクラススイッチングおよび体細胞ハイパー突然変異を受けて高親和性抗体11を生成する。差動抗体クラス切り替えは、微分サイトカインニッチで起こり、IL4およびIL21はIgG1クラス切換を誘導し、IFNγはIgG2クラススイッチング12を誘導する。形質細胞は分泌された抗体の生産者であり、末端分化細胞である。Tfh細胞と同様に、GCにおけるB細胞の発達は、多くの重要な分子の動的発現と関連している。現在の研究に基づいて、GC B細胞はB220+PNA+Fas+またはB220+GL7+Fas+Fas+細胞および形質細胞と同定することができ、その前駆体と比較して、B220の発現を下方調節し、CD138発現13をアップコンジェクツする。さらに、これらの特性の両方をフローサイトメトリーおよび免疫蛍光分析において検出することができ、よってGC応答の適切な評価が行われる。
強い細胞および体液性応答は、インフルエンザウイルス感染において誘導され、TfhおよびTh1細胞がCD4+ T細胞応答を支配し、Tfh細胞分化研究に最適なモデルとなる。インフルエンザA/プエルトリコ/8/34 H1N1(PR8)は、一般的に使用されるマウス適応株であり、この研究では14、15、16によく使用される。ここでは、インフルエンザウイルス感染におけるTfh研究関連アッセイの基本的なプロトコルについて説明します: 1) PR8ウイルスの鼻腔内接種;2)抗原特異的Tfh細胞、GC Bおよび形質細胞およびIL21検出とフローサイトメトリーを用いた;3) GCの組織学的可視化;4)ELISAによる血清中の抗原特異的抗体抗体の検出。これらのプロトコルは、Tfh関連研究の新しい研究者に必要な技術を提供します。

<table><tbody><tr><td>Tfh細胞、NP特異的Tfh細胞およびBcl-6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37%ホルムアルデヒド</td>の免疫染色 <td>Sigma</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>抗CD16/32マウス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC class II tetramer</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bcl-6 PE</td><td>Biolegend</td><td>358504</td><td>クローン:7D1</td></tr><tr><td>Biotin-CXCR5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-7185-82</td><td>クローン:SPRCL5</td></tr><tr><td>CD4 Percp-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-0041-82</td><td>クローン:GK1.5</td></tr><tr><td>CD44 eVolve 605</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>83-0441-42</td><td>クローン:IM7</td></tr><tr><td>CD44 FITC</td><td>Thermo Fisher Scientifi</td><td>11-0441-82</td><td>クローン:IM7</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>553150</td><td>クローン:MEL-14</td></tr><tr><td>ICOS BV421</td><td>Biolegend</td><td>564070</td><td>クローン:7E.17G9</td></tr><tr><td>PD1 PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>135216</td><td>クローン:29F.1A12</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン BV421</td><td>BD Pharmingen</td><td>563259</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>554081</td><td></td></tr><tr><td>IL21</strongの細胞内染色></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37% ホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>抗ヒト IgG</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>109-605-098</td><td></td></tr><tr><td>ブレフェルジン A</td><td>Σ</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FCc IL-21 受容体</td><td>R&Dシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イオノマイシン</td><td>Sigma</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>生/死 固定可能なアクア 死細胞染色キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>サポニン</td><td>MP</td><td>102855</td><td></td></tr><tr><td>GC B および形質細胞染色</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B220 APC</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17-0452-81</td><td>クローン:RA3-6B2</td></tr><tr><td>CD138 PE</td><td>BD Pharmingen</td><td>561070</td><td>クローン:281-2</td></tr><tr><td>CD95 (FAS) PE/Cy7</td><td>BD Pharmingen</td><td>557653</td><td>クローン:Jo2</td></tr><tr><td>IgD eFluor 450</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>48-5993-82</td><td>クローン:11-26c</td></tr><tr><td>PNA FITC</td><td>Sigma</td><td>L7381</td><td></td></tr><tr><td>ELISA></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PR8-HA</td><td>Sino Biological</td><td>11684-V08H</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SSBC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIg (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgM (SBA Clonotyping System-HRP)</td><td>SouthernBiotech</td><td>5300-05</td><td></td></tr>によるHA特異的抗体価のアッセイ<<tr><td>ヤギ抗マウスIgG1(SBAクロノタイピングシステム-HRP)</td><td>サザンバイオテック</td><td>5300-05</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗マウスIgG2b(SBAクロノタイピングシステム-HRP)</td><td>サザンバイオテック</td><td>5300-05</td><td></td></tr>ヤ<tr><td>ギ抗マウスIgG2c(SBAクロノタイピングシステム-HRP)</td><td>サザンバイオテック</td><td>5300-05TMB</td><td></td></tr><tr><td>基質試薬セット</td><td>BDファーミンゲン</td><td></td>555214<td></td></tr><tr><td><ストロング>組織学</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-ヤギ-抗ラット IgG</td><td>Life Technology</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス IgD</td><td>Biolegend</td><td>405702</td><td></td></tr><tr><td>ビオチン化 PNA</td><td>Vector laboratories</td><td>B-1075</td><td></td></tr><tr><td>dilute Alexa Fluor 488-streptavidin</td><td>Life Technology</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>正常なヤギ血清</td><td>SouthernBiotech</td><td>0060-01</td><td></td></tr><tr><td>プロロングゴールド退色防止試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P3630</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン/バイオチンブロッキングキット</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>SP-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおけるインフルエンザaウイルス感染時のt濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価

Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice

T濾胞ヘルパー(Tfh)細胞は、生殖中心(GC)の開発および高親和性抗体の生成に関する助けを提供することに特化した独立したCD4+T細胞サブセットです。インフルエンザウイルス感染では、強力なTfhおよびGC B細胞応答が誘導され、効果的なウイルス根絶を促進し、Tfh関連研究のための適格なマウスモデルを与える。本論文では、マウスにおけるインフルエンザウイルス感染時のTfh関連免疫応答の基本的な検出におけるプロトコルについて述べた。これらのプロトコルは、含まれます: インフルエンザウイルスの鼻内接種;フローサイトメトリー染色とポリクローナルおよび抗原特異的Tfh細胞の分析, GC B細胞および形質細胞;GCの免疫蛍光検出;血清中のインフルエンザウイルス特異的抗体の酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)これらのアッセイは、基本的にインフルエンザウイルス感染におけるTfh細胞の分化と機能を定量化し、分化メカニズムおよび操作戦略の解明に関する研究に役立つ。

インフルエンザウイルス感染におけるマウス罹患率の特徴 インフルエンザウイルス感染後、マウスは重度の体重減少によって反映される病気による活性および拒食症が少なく、マウスの罹患率19を監視するために一般的に使用される症状である。図1aに示すように、PR8ウイルス感染マウスは6日目に体重を減らし始め、8日目に最高の損失レベルに達し、10日目に初期レベルに戻った。予想通り、PBS処理対照マウスでは、全期間を通して体重減少は認められなかった。インビボ症状の場合、ウイルス感染は、この場合のmLNの排水リンパ節における強いリンパ球の拡大をもたらす。したがって、PR8ウイルス感染マウスでは対照マウスよりも有意に大きなサイズのmRNが観察された(図1b)。まとめると、これらのマウスはすべて期待される症状を示し、その後のTfh関連免疫応...

本論文では、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおけるTfhおよびGC B応答を評価するプロトコルについて説明する。

マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価

T Follicular Helper (Tfh) cells are an independent CD4+&#160;T cell subset specialized in providing help for germinal center (GC) development and ...

T濾胞性ヘルパー細胞は、新たに同定されたCD4 T細胞サブセットであり、高親和性動物生産においてB細胞に助けを提供します。インフルエンザウイルス感染におけるTfh細胞の同定を実証することは、新しい研究者がTfh関連研究に必要な手法をどのように実行するかを理解するのに役立ちます。不適切なウイルス力価は、死に至ったり、免疫反応が弱すぎたりする可能性があるため、実験を行う前に力価を決定することをお勧めします。8週齢の雄C57黒色6マウスのPR8ウイルス接種用。バイオセーフティレベル2の条件下で、マイナス80°Cで保存されたPR8ウイルスストックを氷上で解凍します。ウイルスをボルテックスして均質な溶液を得ます。事前に冷却した1.5ミリリットルのチューブでウイルスをPBSのマイクロリットルあたり2つのプラットフォームユニットに希釈し、麻酔をかけた動物のつま先のつま先のピンチが反応しないことを確認します。ウイルスを再び渦巻きます。20マイクロリットルのピペットチップに10マイクロリットルのウイルスをロードします。最大3匹の鎮静剤を投与した動物の1つのナリスにウイルスの滴を慎重に追加してから、反対側で接種を繰り返します。次に、すべてのマウスを温かいケージの胸骨横臥位に置き、完全に回復するまで監視し、各マウスの体重を10日間毎日測定します。実験の最後に、マウスをバイオセーフティレベル2の層流フードに入れ、最初の動物を吸収性の紙で覆われた発泡スチロール解剖ボードに固定します。解剖ハサミを使用して腹部の正中線に沿って皮膚を切り、ピンセットで皮膚を伸ばし、皮膚を解剖ボードに固定します。腹膜を開いて脾臓を採取し、脾臓を70マイクロメートルのフィルターに入れ、5ミリリットルのDMEMを1%FBSで補充した6センチの皿に入れます。横隔膜と肋骨を胸腺まで分割し、肋骨を横に固定して胸腔を露出させます。肺と心臓を動かして、気管の腹側近くの縦隔リンパ節を見つけます。次に、リンパ節を5ミリリットルの培地が入った2番目の6センチメートル皿の独自のストレーナーに入れ、3ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、両方のストレーナーのメッシュを介して両方の組織を優しくつぶします。各ストレーナを1ミリリットルの新鮮なDMEMとFBSですすぎ、細胞懸濁液を個々の15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。遠心分離により細胞を回収し、チューブあたり1ミリリットルの新鮮なDMEMとFBSにペレットを完全に再懸濁します。次に、脾臓細胞懸濁液にさらに4ミリリットルの培地を追加し、両方のチューブを氷の上に置きます。CXCR5発現のために細胞を染色するには、チューブを数回反転させて混合し、サンプルごとに6つの細胞に2倍10を個々のFACSチューブに移します。各チューブに2ミリリットルの染色バッファーを加え、ボルテックスして細胞を混合します。遠心分離により細胞をペレット化し、上清を廃棄します。各チューブを吸収紙で2回軽くたたき、2つの底を静かにはじいて、残留上清の細胞を再懸濁します。チューブあたり0.2マイクロリットルのFc受容体ブロックで非特異的結合をブロックし、チューブを穏やかにフリックして混合してから、チューブを氷上に10分間置きます。インキュベーション終了時に、各チューブに0.3マイクロリットルのビオチン抗マウスCXCR5を加え、穏やかにフリックして混合します。チューブを氷の上に1時間置き、30分で軽くはじきます。インキュベーションの終了時に、2ミリリットルの染色バッファーをチューブとボルテックスで混合し、遠心分離により細胞を沈降させます。上清を捨ててフリックし、細胞を残留バッファーに再懸濁します。次に、チューブを氷上に配置し、表に示されているように、目的の表面マーカーに対する抗体で細胞を標識します。インキュベーションの終了時に、細胞を2ミリリットルの染色緩衝液で洗浄し、各ペレットを400マイクロリットルの新鮮な染色緩衝液に再懸濁して、フローサイトメトリーによる分析を行います。PR8ウイルスに感染したマウスは、6日目から体重が減少し始め、8日目に最大の損失に達し、10日目に初期体重レベルに戻ります。予想通り、PBS処理された対照マウスでは体重減少は観察されません。ウイルス感染は、ドレナージリンパ節内のリンパ球の強力な拡張にもつながります。フローサイトメトリー解析で観察されたように、ヘルパーT濾胞細胞の分化は感染後5日目に開始し、感染後10日目にピークに達し、対照動物と比較してインフルエンザウイルスに感染したマウスでは、ヘルパーT濾胞細胞が大量に誘導されます。さらに、縦隔リンパ節および脾臓の両方において、インフルエンザ抗原特異的CD4陽性T細胞数は、PR8動物のPD−1陽性CXCR5陽性細胞の集団が増加した対照マウスにおいて観察されたものと比較して有意に誘導される。さらに、IL-21の細胞内染色により、PR8感染はウイルス感染に応答してこのサイトカインの産生が有意に高いことを明らかにしています。免疫蛍光染色は、PR8感染マウスにおける誘導性胚中心反応の存在を示し、ELISAは、ウイルス感染動物におけるインフルエンザウイルス特異的抗体の産生を示しています。CXCR5の染色は、染色温度と時間によって染色の品質が影響を受けるため、氷上で1時間行うことが重要です。CXR5およびIL-21染色を実証しましたが、この方法では、他の表面マーカー、転写因子、およびサイトカインを評価することで、Tfhの分化と機能について多くの知見を得ることができます。

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