Name: 自由に泳ぐ魚における可動テトロデスによるニューロンの無線電気生理学的記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶ 自由に泳ぐ金魚の脳から細胞外神経信号を無線記録する手法。防水デバイスとマイクロドライブを用いて、自然な行動中の神経活動をリアルタイムで観測し、水生動物の行動神経科学の理解を深める。

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私たちは、ナチュム・ウラノフスキーとウラノフスキー研究所のメンバーの皆さんの皆さんのご協力に感謝しています。また、タル・ノヴォプランスキー・ツァーリの技術支援に感謝しています。我々は、イスラエル科学財団-FIRSTプログラム(助成金第281/15)、およびネゲブ大学ベングリオン大学の農業、生物および認知ロボティクスイニシアチブを通じたヘルムズリー慈善信託からの財政的支援を感謝します。

すべての手術手順は、動物福祉に関する地元の倫理委員会(例えば、IACUC)によって承認されなければなりません。
1. マイクロドライブハウジングの建設
<ol><li>ハウジングを構築するには、鋸を使用して19 mm x 29 mm x 1 mm プレートに幅 1 mm の真鍮板をカットします。エッジに垂直な長辺のそれぞれに 5.5 mm のスリットを 2 つカットし、各スリットが狭い側から 6.5 mm 離るようにします (図 2A)。</li>
	<li>プライヤーを使用して、長辺のスリットの間の領域を内側に折りたたみ、下部を内側に折りたたみ、上側を外側に折りたたんでハウジングを取得します(図2B,C)。</li>
	<li>3mmドリルビットを使用して、マイクロドライブハウジングのネジの穴を作ります。 注:これらの穴は後でハウジングをロガーボックスに取り付けるために使用されます(図2D)。</li>
	<li>ハウジングの側面はんだ。</li>
	<li>細かい円形ファイルを使用して、ハウジングの下部に小さな、1.5 mm の半径、半円形のスリットを生成します(図 2E)。 注:これは、電極を導くためにステンレス鋼管を挿入するために後で使用されます。</li>
	<li>1 mm ドリル ビットを使用して、テトロデス用のハウジングの背面に穴を開けます (図 2F)。 注:ハウジングの 3D モデルは、補足住宅.stl ファイルにあります。</li>
</ol>2. マイクロドライブの構築
<ol><li>カッターを使用して、1 行のオスのピン ヘッダー ストリップから 3 ピンの部分を分割します (図 1H)。ペンチを使用して、中央のピンを引き出します。</li>
	<li>カッターを使用して、残りのピンを長さ 10 mm(ねじ長さより 2 mm 小さい)にカットします。もう 1 つの可能性は、より長いネジを使用することです(ステップ 2.4 を参照)。</li>
	<li>中央のピン穴を通して#65ドリルビットを使用して穴を開けます。00-99 タップを使用してスレッドをドリルします。</li>
	<li>マイクロドライブと真鍮板(7.5mm x 2.5mm x 0.6 mm)を組み立てて、真鍮板がピンに触れとなるような。.最初の真鍮プレートを通してネジ(#00-90丸いヘッド、12 mm、真鍮)を挿入し、次にピンヘッダースレッドと2番目の真鍮プレートを通して挿入します。最後に、ネジにナットを置き、組み立てられたマイクロドライブを軽く締めます。</li>
	<li>真鍮板と一緒にピンをはんだ付けし、ナットをねじの先端ではんだ付けします。</li>
	<li>マイクロドライブの真鍮板の側面の4点でマイクロドライブハウジングにマイクロドライブをはんだ付け。</li>
	<li>内径1.5mm、内径1.2mmのステンレス鋼管3mm長で長さ1本のステンレス鋼管を切り、鋭い端を避けるためにチューブの端を磨きます。</li>
	<li>エポキシを使用して、マイクロドライブハウジングの底部にある小さな半円形スリットに6mmの長いチューブを接着します。3mm長いステンレス鋼をピンヘッダーに接着し、ハウジングに6mmの長いチューブを並べておきます。</li>
	<li>直径0.64mmの長さ5cmのシリコーンチューブセグメント2つと、直径0.250mmの5cm長いポリイミドチューブを1つカットします。</li>
	<li>2本のステンレス鋼管に3本のチューブを挿入します。シアノアクリレート接着剤を使用して、ピンヘッダーに取り付けられたステンレス鋼管にチューブを接着します。マイクロドライブを最後までねじ込み、2本の鋼管の上部と下部から余分なチューブを切断します。 注:ハウジング付きのマイクロドライブを使用する準備ができました (図 1C)。</li>
</ol>3. テトローデアレイの準備
<ol><li>各テトロードに4つの電極を持つ2テトローデインプラントを作製するには、直径25μmのタングステンワイヤーのうち、長さ12cmの8本のワイヤーを用意し、Formvar絶縁を行います。 注:同じ設計は4つのテトロデスを収容できる。</li>
	<li>16チャンネル電極インターフェースボード(EIB-16)PCB(材料表参照)のホルダーを顕微鏡下に置きます。</li>
	<li>柔らかい先端の間鍋とライターを使用して、炎を使用して片側の8本のワイヤーのそれぞれを取り除きます。 注:これは、後で配線が PCB コネクタに正しく接続されるようにするためです。</li>
	<li>EIB-16の穴の1つにワイヤーを押し込み、コーティングされた側面を穴に入れます。ピンを置き、ペンチを使用して押します。ピンと配線の未塗装側の間の抵抗を測定して、接続性を確認します。 注:抵抗は数十オームの順序です。</li>
	<li>8 本のワイヤすべてで手順 3.4 を繰り返します。</li>
	<li>各ワイヤの端にダクト テープを使用して、4 本のワイヤの 2 つのグループをテープでまとめます。 注:各グループは、テトローデを形成するために後で一緒に接着されます。</li>
	<li>タングステンワイヤー1本1本を長さ12cm、直径50μmで切ります。EIB-16 接続の 1 つに接続します。 注:このワイヤは、基準電極として機能します。</li>
	<li>記録ロガーの敷地となる直径75μmの長さ12cmの裸の銀線を2本切ります。EIB-16の接地接続に2本のワイヤをはんだ付けします。</li>
	<li>EIB-16を電動旋回装置の上に持ち、4本のワイヤーの1つのグループのダクトテープ端を電動チューニング装置に置きます。時計回りに 130 回を適用し、その後に 20 回の反時計回りの回転を適用します。チアノアクリレート接着剤を塗布してテトローデを覆う。</li>
	<li>接着剤が治るのを待ちます。ダクトテープの近くでテトローデを切ります。</li>
	<li>手順 3.9 と 3.10 を 2 番目のテトロードで繰り返します。 注:これにより、完成した 2 テトロードアレイが生成されます (図 1D)。</li>
</ol>4. インプラントの組み立て
<ol><li>マイクロドライブをずっと下にねじ込みます。</li>
	<li>1 x 3Mプラス丸いヘッドネジを使用して、EIB-16をPVCプレートに取り付けます。</li>
	<li>ソフトエンドピンセットを使用して、ロガーボックスカバーの前面にある穴からすべてのテトロドとワイヤを引き抜きます。</li>
	<li>2 x 6Mプラスフラットヘッドネジを使用して、PVCプレートをロガーボックスカバーに取り付けます。ロガーを EIB-16 に取り付けることができるように、EIB-16 コネクターを正しい方向に保ちます。EIB-16が所定の位置に固定されていることを確認し、記録された信号のモーションアーティファクトを回避します。</li>
	<li>エポキシを使用して箱にワイヤーを密封します。一次シールは後で室温加硫(RTV)によって行われるので、できるだけ少なく適用してください。</li>
	<li>2mmネジを使用して、マイクロドライブハウジングをロガーボックスカバーに取り付けます。</li>
	<li>テトロデスとすべてのワイヤーをマイクロドライブハウジングの背面の穴に通します。マイクロドライブ内の2本のシリコーンチューブにテトロドを通します。マイクロドライブ内のポリイミドチューブを通して50μmタングステン線を通します。</li>
	<li>チューブの上端にシアノアクリレート接着剤を塗布してテトロデスとワイヤーをチューブに接着し、動きがマイクロドライブと一致していることを確認します。マイクロドライブを上部までねじ込みます。</li>
	<li>動きを防ぐために、マイクロドライブハウジング内の露出したテトロードとワイヤに軟質石油(材料表を参照)を適用します。</li>
	<li>加熱されたカミソリの刃を使用して、12ミリメートルx 14.5ミリメートルペトリ皿の底窓をカットします。エポキシでマイクロドライブハウジングの前面に窓を取り付けます。アース線は窓の外に置いておいてください。</li>
	<li>ロガーボックスカバーとマイクロドライブハウジングの間の露出したテトロドとワイヤーにRTVコーティングを適用します。</li>
	<li>RTVが硬化した後、中に小さな重量で箱を閉め、箱に水漏れがないことを確認するために一晩水に沈みます。</li>
	<li>鋭いはさみを使用して、テトロデスとリファレンスワイヤーを目的の長さにカットします。</li>
	<li>マークされた押し出しポリスチレンフォーム(「材料表」を参照)をボックスに取り付けます。水浴に水没したときに浮力のバランスが取るように、そのサイズを調整します。</li>
	<li>白金ブラック溶液にテトロード先端を浸し、直接電流(-0.2 μA)を使用して電極をコーティングし、必要に応じて電極のインピーダンスを設定します。コーティングおよびインピーダンス測定には、マルチ電極インピーダンステスター(材料表参照)を使用します。 注:金魚のパリウムでは、40kOhmの値が最適です。用途に応じて、電極インピーダンスは、白金ブラックコーティング10、11を修正することによって調整することができる。</li>
</ol>5. 麻酔準備 - 1% MS-222 原液
注意:麻酔製剤は、発がん性物質である粉末MS-222の使用を含む。したがって、ステップ5.2と5.3は、手袋を使用して化学フードで行う必要があります。
<ol><li>100 mL を超えるチューブに 100 mL の水を追加します。</li>
	<li>化学フードに、使い捨て重みプレートをスケールに置きます。へらを使ってMS-222粉末を1g加え、粉末をチューブに加えます。</li>
	<li>チューブをよく振りなさい。 注:液体の形で、MS-222は手袋を着用する化学フードの外で使用することができるが、マスクを要求しない。</li>
	<li>使い捨て重み板をスケールに置きます。スパチュラを使用して重炭酸ナトリウムを2g加え、粉末をチューブに加えます。チューブをよく振りなさい。</li>
</ol>6. 魚の頭蓋骨の準備
注:この段階で、魚はインプラント手術の準備ができています。手術の前に、すべてのコンポーネントと供給が適切な手順で殺菌されていることを確認してください。このステップでは、水外のU字型魚ホルダーが必要です。このプロトコルでは、長い金魚の尾に15 cmの頭部に合うアルミニウムホルダーが使用される。このシステムは、酸素化された水でエラを浸透しながら、水から魚を保持します。詳細については、ヴィネピンスキーら8を参照してください。
<ol><li>魚が眠るまで0.02%MS-222水浴に20分間置きます。</li>
	<li>滅菌手袋を使用して、水から魚を取り出し、ホルダーに入れます。 注:魚を浸透させる酸素化された水は、0.02%の濃度でMS-222を含み、手術中に魚が麻酔されたままになるようにします。</li>
	<li>滅菌スパチュラを使用して、10分間手術のために指定された場所の上の皮膚にリドカイン5%ペーストを適用し、その後、リドカインを除去します。 注:特定の脳領域をターゲットに適切な脳アトラスを相談します。.</li>
	<li>滅菌15ブレードメスを使用して、インプラント領域の頭蓋骨の上の皮膚を取り除きます。</li>
	<li>0.7mmドリルビットの歯科ドリルを使用して、頭蓋骨に4つの穴を開けます。各穴に1mmネジ(長さ3mm)を挿入し、ネジを挿入する直前に穴にシアノアクリレート接着剤を塗布します。</li>
	<li>歯科用バーニッシャーを使用して、ネジと露出した頭蓋骨の周囲に歯科用セメントを塗布します。</li>
	<li>歯科ドリルを使用して、目的の脳領域の上の頭蓋骨に直径5mmの穴を作ります。頭蓋骨と脳の間の脂肪組織を取り除き、細かいピンセットと軟部組織紙を使用して脳領域ターゲットを露出させます。頭蓋骨の下の大きな血管に損傷を与えないように注意してください。 注:この段階の終わりまでに、魚は調査を移植するために準備される。ここでは、このプロトコルに固有の主な手順についてのみ説明します。いくつかの術後処置(動物の健康と手術ツールおよび領域の殺菌に関する詳細な文書など)は、魚や小動物を含むすべての手術に適用可能であるため、提示または議論されない。</li>
</ol>7. プローブの埋め込み
注:プロトコルの最後のステップを完了するには、インプラントを脳に挿入しながら所定の位置に保持できるマニピュレータが必要です。
<ol><li>マニピュレータを使用して、魚の脳を指し示すテトロデスでロガーボックスカバーを保持します。</li>
	<li>テトロデスが脳に下がるとき、参照が脳の外にとどまるように参照電極を曲げます。</li>
	<li>頭蓋骨に収まるように敷地を切り取ります。必要に応じて、1 本のアース 線を頭蓋骨ねじの 1 つに接続します。</li>
	<li>マイクロドライブハウジングの下部が頭蓋骨の近くにある間に電極が脳に挿入されるようにインプラントを下げます。</li>
	<li>ハウジングと最も近い頭蓋骨ねじの間に少量の歯科用セメントを塗布して、インプラントを頭蓋骨に取り付けます。</li>
	<li>歯科セメントの最初の部分が治った後、歯科用セメントを適用し、頭蓋骨と露出した頭蓋骨全体の上の穴を閉じます。 注:通常、露出した頭蓋骨全体をカバーするために、歯科セメントアプリケーションの数ラウンドが必要です。</li>
	<li>ボックスにロガーとバッテリーを取り付け、すべてのネジでボックスを密封します。</li>
	<li>実験に使用する魚の種類に応じて抗生物質と局所鎮痛剤を適用します。</li>
	<li>魚が目を覚ますまで、新鮮な水で魚のエラを洗い流します。ホルダーから魚を取り出し、家庭用タンクに戻します。 注:魚は手術後60分以内に完全に回収される。</li>
	<li>魚がインプラントで自由に泳げであることを確認してください (図 3、補足ビデオ 1)。必要に応じて、魚が容易にバランスを取ることができるように、ロガーボックスの上に押し出されたポリスチレンフォームのサイズを再調整します。</li>
</ol>

<ol><li>Jacobson, M., Gaze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Types+of+visual+response+from+single+units+in+the+optic+tectum+and+optic+nerve+of+the+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Journal+of+Experimental+Physiology+and+Cognate+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Types of visual response from single units in the optic tectum and optic nerve of the goldfish.</a> Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences. 49 (2), 199-209 (1964).</li>
<li>Ben-Tov, M., Donchin, O., Ben-Shahar, O., Segev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pop-out+in+visual+search+of+moving+targets+in+the+archer+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pop-out in visual search of moving targets in the archer fish.</a> Nature Communications. 6, 6476(2015).</li>
<li>Zottoli, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+the+startle+reflex+and+Mauthner+cell+auditory+responses+in+unrestrained+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of the startle reflex and Mauthner cell auditory responses in unrestrained goldfish.</a> Journal of Experimental Biology. 66 (1), 243-254 (1977).</li>
<li>Canfield, J. G., Rose, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Mauthner+neurons+during+prey+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology+A%22%5BJournal%5D)">Activation of Mauthner neurons during prey capture.</a> Journal of Comparative Physiology A. 172 (5), 611-618 (1993).</li>
<li>Canfield, J. G., Mizumori, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+chronic+neural+recording+in+the+telencephalon+of+freely+behaving+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods for chronic neural recording in the telencephalon of freely behaving fish.</a> Journal of Neuroscience Methods. 133 (1-2), 127-134 (2004).</li>
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<li>Vanwalleghem, G. C., Ahrens, M. B., Scott, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+whole-brain+neuroscience+in+larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Integrative whole-brain neuroscience in larval zebrafish.</a> Current Opinion in Neurobiology. 50, 136-145 (2018).</li>
<li>Vinepinsky, E., Donchin, O., Segev, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wireless+electrophysiology+of+the+brain+of+freely+swimming+goldfish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Wireless electrophysiology of the brain of freely swimming goldfish.</a> Journal of Neuroscience Methods. 278, 76-86 (2017).</li>
<li>Vandecasteele, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+recording+of+neurons+by+movable+silicon+probes+in+behaving+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (61), e3568(2012).</li>
<li>Ferguson, J. E., Boldt, C., Redish, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+low-impedance+tetrodes+by+electroplating+with+additives%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+A%3A+Physical%22%5BJournal%5D)">Creating low-impedance tetrodes by electroplating with additives.</a> Sensors and Actuators A: Physical. 156 (2), 388-393 (2009).</li>
<li>Arcot Desai, S., Rolston, J. D., Guo, L., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+impedance+of+implantable+microwire+multi-electrode+arrays+by+ultrasonic+electroplating+of+durable+platinum+black%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroengineering%22%5BJournal%5D)">Improving impedance of implantable microwire multi-electrode arrays by ultrasonic electroplating of durable platinum black.</a> Frontiers in Neuroengineering. 3, 5(2010).</li>
<li>Lewicki, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+methods+for+spike+sorting%3A+the+detection+and+classification+of+neural+action+potentials%5BTitle%5D)+AND+%22Network%3A+Computation+in+Neural+Systems%22%5BJournal%5D)">A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials.</a> Network: Computation in Neural Systems. 9 (4), R53-R78 (1998).</li>
<li>Teixeira, F. B., Freitas, P., Pessoa, L. M., Campos, R. L., Ricardo, M. Evaluation of IEEE 802.11 underwater networks operating at 700 MHz, 2.4 GHz and 5 GHz. Proceedings of the 10th International Conference on Underwater Networks & Systems. , Arlington, VA. (2015).</li>
<li>Sendra, S., Lloret, J., Rodrigues, J. J., Aguiar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underwater+wireless+communications+in+freshwater+at+2.4+GHz%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Communications+Letters%22%5BJournal%5D)">Underwater wireless communications in freshwater at 2.4 GHz.</a> IEEE Communications Letters. 17 (9), 1794-1797 (2013).</li>
<li>Lloret, J., Sendra, S., Ardid, M., Rodrigues, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Underwater+wireless+sensor+communications+in+the+2.4+GHz+ISM+frequency+band%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">Underwater wireless sensor communications in the 2.4 GHz ISM frequency band.</a> Sensors. 12 (4), 4237-4264 (2012).</li>
<li>Hoogerwerf, A. C., Wise, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+microelectrode+array+for+chronic+neural+recording%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional microelectrode array for chronic neural recording.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 41 (12), 1136-1146 (1994).</li>
<li>Harris, K. D., Quiroga, R. Q., Freeman, J., Smith, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+data+quality+in+neuronal+population+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Improving data quality in neuronal population recordings.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1165(2016).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

このプロトコルは、自由に泳ぐ金魚のテレンセファロンにテトローデ配列を埋め込む際に必要なステップを詳しく説明します。この技術は、脳内のテトロード位置を調整できるマイクロドライブと共に、最大16チャンネルから取得した信号を増幅して記録するニューラルロガーを実装します。マイクロドライブは記録を最大限に活用するために脳の位置を調節することを可能にする。
このプロトコルは、他の脳領域からの記録のために簡単に変更することができます(同様の技術を使用して光学テクタムから記録するためのVinepinsky etal.8を参照)または他の水生動物15cm以上長い(およそ金魚の頭から尾に等しい、〜100グラムの重量)。さらに、プロトコルは、水を貫通できる周波数で通信する限り、任意のデータロガーで動作するように変更することができます。ここで使用するロガーは、900MHzの無線周波数を使用して通信し、約20cmの水を介して通信することができます。2.4 GHz の無線周波数も約 15 cm の淡水を貫通できます。低い周波数やその他の選択肢は、さらに良い結果を...

魚は脊椎動物の最大かつ最も多様なグループであり、他の脊椎動物と同様に、ナビゲート、社交、睡眠、狩猟などの複雑な認知能力を示しています。それにもかかわらず、魚の挙動を支配する神経機構は、ほとんどの部分が未知のままである。
過去数十年間、固定化された魚からの細胞外記録は、主に行動1、2の神経基盤の異なる側面を調査するために実施されてきた。この技術は一部の感覚系に適しているが、固定化動物では不可能でない場合には神経行動の全スペクトルの調査は困難である。最初の進歩は、つながれた水泳魚3、4のモートナー細胞からの記録に関与した。しかし、Mauthner細胞は不均衡に大きく、記録された作用電位振幅は、数mVと同じくらい高く行くことができ、記録を容易にする。その後、Canfieldら、魚5のテレンセファロンから記録するためにテザー動物を使用する際の概念実証について説明した。魚からの神経活動を記録するためのもう一つの最近の技術は、カルシウムイメージングです(オルガーとデポラビエハ6によるレビューを参照してください、およびVanwalleghemら7)。この技術は、皮膚と頭蓋骨が幼虫の段階で透明であるため、ゼブラフィッシュ幼虫で使用するために開発されました。ただし、この手法を使用して、開発の後の段階で複雑な動作を学習することはできません。
ここでは、自由に泳ぐ魚の脳から細胞外神経活動を記録する新しい技術を提示する。これは、Vinepinsky et al.8で説明されているプロトコルの修正バージョンです。主な革新は外科後の電極の位置を制御することを可能にするマイクロドライブの付加である。この技術は、マイクロドライブを介してニューラルデータロガーに接続されたテトロデスのセットを使用して、金魚の脳波から記録するために設計されています。全体のセットアップはワイヤレスで、魚の頭蓋骨に固定されています。システムの特定の重量は魚が自由に泳ぐことを可能にする小さい浮遊物を加えることによって水特有の重量に等しくなされる。
この手法は、信号をオンボード メモリ デバイスで増幅、デジタル化、および格納するニューラル データ ロガーの使用に基づいています。ロガー テレメトリ システムは、録画の開始と停止、およびビデオ カメラとの同期に使用されます。このプロトコルでは、マイクロドライブと一緒に防水ボックスに埋め込まれた16チャンネルニューラルロガーが使用されます。
マイクロドライブ・アセンブリーは、マイクロドライブ自体とマイクロドライブ・ハウジング (図 1A,B)の 2 つの主要コンポーネントから製造されます。ハウジングはマイクロドライブとテトロデスを保持し、頭蓋骨とロガーボックスの間のアンカーとしても機能します(図1C)。PVCロガーボックスは機械プロセスを使用して製造され、Oリングを使用して密封されています(図1E-G、補足図1、補足図2、補足図3(3D)図も参照)。一方の端で、インプラントの重量を補償し、浮力中性インプラントを魚に提供するために、ポリスチレンフォームの一部がロガーボックスに取り付けられています。プロトコルに記載されたマイクロドライブの構築は、Vandecasteeleら9によって提示された手順に従い、マイクロドライブをハウジングに取り付ける変更を伴う(図1A)。すべての主要な手順が表示されます。
魚の頭蓋骨を調製するためのプロトコルに記載された手順は、Vinepinsky etal. 8に提示されたものと同様であり、プロトコルで簡単に説明される。手術の翌日、魚は通常麻酔の効果から完全に回復し、行動実験の準備ができています。テトロードの位置は、マイクロドライブのネジを回すことによって調整できることに注意してください。ねじの全回転あたり300μmの間隔があり、目標の脳位置に達するまで75μmの進歩が推奨される。適切な脳アトラスは、対象の特定の脳領域をターゲットに相談する必要があります。魚がバッテリーまたはメモリカードの交換のために麻酔されるたびに電極インピーダンスをテストすることをお勧めします。

<table><tbody><tr><td>0.7mm丸ドリルビット</td><td></td><td></td><td>ドリルと互換性があります。</td></tr><tr><td>15ブレードメス</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16チャンネルPCBボード</td><td>Neurlynx</td><td>EIB-16</td><td></td></tr><tr><td>1x3Mフィリップス皿頭ネジ</td><td></td><td></td><td>ステンレス鋼。任意のタイプ。</td></tr><tr><td>1x3Mフィリップス丸頭ネジ</td><td></td><td></td><td>ステンレス鋼。任意のタイプ。</td></tr><tr><td>27 cm x 19 cm x 1 mm真鍮プレート</td><td></td><td></td>図<td>2</td></tr><tr><td>2x6Mプラスネジ</td><td></td><td></td>ステンレス鋼<td>を参照してください。任意のタイプ。</td></tr><tr><td>3140 RTV コーティング</td><td>ダウ クラウニング 2767996</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 & マイクロ;m 銀線</td><td>A-M Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真鍮小ネジ #00-90</td><td></td><td>947-1006</td><td></td></tr><tr><td>真鍮プレート 7.5 mm x 2.5 mm x 0.6 mm</td><td></td><td></td><td>3D図面をご用意しています。補足1</td></tr><tr><td>コーティングタングステンワイヤー25&microを参照してください。m</td><td>California Fine Wire Company</td><td>5000160</td><td>用途に応じて、四極管は任意のタイプのワイヤーから製造できます。一般的なワイヤーは、より低い直径で見つけることができるニクロムワイヤーです(例:AMシステム、762000)</td></tr><tr><td>コーティングされたタングステンワイヤー50&マイクロ;m</td><td>A-Mシステム</td><td>795500</td><td>低インピーダンス</td></tr>の<tr><td>シアノアクリリック接着剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>歯科用バーニッシャー</td><td>ComDent UK</td><td></td><td>小さな滅菌ステンレス製の静止工具で他の</td></tr>ワイヤーと交換できます。<tr><td>歯科用セメント - GCFujiPLUS</td><td>GC</td><td>431011</td><td>他の歯科用セメントは、おそらく同様に動作するでしょうが、私たちは他のものを試したことはありません。</td></tr><tr><td>デンタルドリルまたはマニキュアドリル</td><td></td><td></td><td>デンタルドリルは高価ですが、マニキュアドリルは安価な代替品になる可能性があります。</td></tr><tr><td>ドリルビット#65</td><td></td><td>947-65</td><td></td></tr><tr><td>速硬化エポキシ</td><td></td><td></td><td>ここでは、任意の5分間硬化エポキシを使用することができます。</td></tr><tr><td>Oリングシール</td><td></td><td></td>付きロガーボックス <td>3D図面が用意されています。補足1-3を参照してください。ボックスは機械で製造する必要があります(3Dプリンターは使用しないでください)。ロガーのインジケーターLEDが見えるように、トランスペラント素材を使用してください。</td></tr><tr><td>電動回転装置</td><td></td><td></td><td>「open ephys」のウェブサイトに記載されているカスタムメイド。また、neurolynx(「Tetrode Spinner 2.0」)またはbulitから他の手段で購入することもできます。</td></tr><tr><td>Mouselog-16 ニューラルロガー</td><td>Deuteron Technologies Ltd</td><td></td><td>市場には、SpikeGadget (UH32 32チャンネル) や Alexei Vyssotski のニューロロガー 2/2A/2B など、いくつかのニューラルロガーがあります。それは浮遊発泡スチロール</td></tr><tr><td>MS-222</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>E10521</td><td>Ethtl 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸98%</td></tr><tr><td>ナノZメッキ</td><td>白質LLC</td><td></td>と相殺することができるので、重量は主要な制約ではないことに注意すべきです <td>ナノZはいくつかの供給から購入することができます。インピーダンスメーターは、IMP-1 / 6662 / 2788、BAK Electronicsなど、任意のものを使用できます。</td></tr><tr><td>PCBピン</td><td>Neurlynx</td><td>Neuralynx EIBピンポリ</td><td></td></tr><tr><td>イミドチューブ250&micro;m</td><td>AMシステム</td><td>822000</td><td></td></tr><tr><td>充電式バッテリー3.7</td><td></td><td></td>リ<td>ポバッテリー、370 mAh。約6時間の録音を保持します。小さいまたは大きいバトリーを使用して、重量を減らしたり、記録時間を延長したりできます。</td></tr><tr><td>シリコーンチューブ 0.64 mm</td><td>A-M システム</td><td>806100</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼 1.5 mm</td><td>A-M システム</td><td>846000</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>タップ #00-90</td><td></td><td>947-1301</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン</td><td></td><td></td><td>ここでは、あらゆる種類の軟質石油皮膚保護剤を使用できます。</td></tr></tbody></table>

自由に泳ぐ魚における可動テトロデスによるニューロンの無線電気生理学的記録

Wireless Electrophysiological Recording of Neurons by Movable Tetrodes in Freely Swimming Fish

魚の行動を支配する神経機構はほとんど未知のままであるが、魚はすべての脊椎動物の大部分を占める。自由に動く魚から脳活動を記録する能力は、魚の行動の神経ベースの研究をかなり進めるだろう.さらに、脳内の記録位置の正確な制御は、魚の脳内の領域全体の協調神経活動を研究するために重要です。ここでは、自由に泳ぐ魚の脳から無線で記録する技術を提示し、記録場所の深さを制御する。このシステムは、マイクロドライブ制御テトロデスによって記録位置を調整できる新しい水互換インプラントに関連するニューラルロガーに基づいています。システムの機能は金魚のテレンセファロンからの記録によって示される。

記録セッション中、金魚は、その脳波の神経活動が記録されている間、正方形の水槽で自由に泳いでいました。これらの実験の目的は、単一細胞の神経活動が魚の行動をどのように決定するかを研究するであった。そのためには、記録されたデータでスパイク活動を特定する必要がありました。脳活動は記録されている間、31,250 Hzでデジタル化され、ハイパスはデータロガーによって300 Hzでフィルタリングされた。次に、オフラインで、信号にバンドパスフィルタ(300~5,000 Hz)を適用し、事前にソートされた生データを各テトロードのチャンネルとリファレンスチャンネルに分離します(図4A)。次に、一般的なスパイクソートアルゴリズム12を使用して、単一細胞活性を特徴付けた。まず、各チャンネルは、最小スパイク振幅しきい値(各チャンネルのノイズレベルに対して)で手動でフィルタリングされました。そして、テトロデスの先端が同じ部位にないので、基準電極が脳の外にあった...

自由に泳ぐ金魚の脳からの細胞外神経信号を記録するための新しい無線技術が提示される。記録装置は、マイクロドライブ、ニューラルデータロガー、防水ケースの2つのテトロドで構成されています。データロガーとそのコネクタを除くすべての部品はカスタムメイドです。

The neural mechanisms governing fish behavior remain mostly unknown, although fish constitute the majority of all vertebrates. The ability to record brain ...

自由に泳ぐ魚の脳から細胞外神経信号を記録する新しい方法を開発しました。これは、一日の終わりに魚の行動のニューロンのメカニズムを研究するための扉を開きます.この方法は有効で、防水性があるため、魚が水槽内を自由に泳いでいる間に記録することができます。また、記録場所はマイクロドライブで造られるによって制御することができる。私たちのラボ技術者であるTal Zoor-Novoplanskyは、この手順をデモンストレーションするのに役立ちます。ハウジングを構築するには、19ミリメートル×29ミリメートル×1ミリメートルの寸法の真鍮プレートを使用してください。長い側面に2つの5.5ミリメートルのスリット、端に垂直。スリットは狭い側から6.5ミリメートル離れている必要があります。ペンチを使用して、長い側面のスリットの間の領域を内側に折ります。次に、下部部分を内側に折り、上側を外側に折り、ハウジングを得ます。次に、3ミリメートルのディルビットを使用して、ネジ用のマイクロドライブハウジングに穴を開け、ハウジングの側面をはんだ付けします。細かい円形のファイルを使用して、半径 1.5 ミリメートルのハウジングの下部に小さな半円形スリットを作成します。1ミリメートルのドリルビットを使用すると、テトロードのハウジングの背面に穴が開きます。まず、カッターを使用して、単一の行の男性ピンヘッダーストリップから3つのピンピースを分解します。ペンチを使用すると、中央のピンが引き出されます。次に、カッターを使用して残りのピンを10ミリメートルの長さにカットします。数字65ドリルビットを使用して中央のピン穴に穴を開け、ダブルゼロ99タップを使用してスレッドをドリルします。マイクロドライブと真鍮プレートを組み立てます。最初の真鍮プレートを通して、ピンヘッダースレッドを通して、2番目の真鍮プレートを通してネジを挿入します。最後に、ネジにナットを置き、組み立てたマイクロドライブを軽く締めます。真鍮プレートと一緒にピンをはんだ、ネジの先端と一緒にナットをはんだ。この後、マイクロドライブはマイクロドライブの真鍮板の側面の4点のマイクロドライブハウジングにはんだ付けする。エポキシ接着剤6ミリメートル長いステンレス鋼管をマイクロドライブハウジングの底にある小さな半円形のスリットに使用する。長さ3ミリのステンレスチューブをピンヘッドに接着して、ハウジングの長さ6ミリメートルのチューブに並びます。2つのステンレス鋼管に準備されたシリコーンおよびポリイミド管を挿入し、シアノクリレート接着剤を使用して、ピンヘッダーに取り付けられたステンレススチールチューブに接着します。その後、マイクロドライブをずっとねじ込み、2つの鋼管の上部と下部から余分なチューブを切り落とします。次に、直径75マイクロメートルのベアシルバーワイヤーを12センチメートルの長さに2本切断し、電極インターフェースボードのグランド接続と未使用のすべてのチャンネルに両方をはんだします。準備したタングステン線の1つを16チャンネル電極インターフェースボードの穴の1つに押し込みます。穴にピンを入れ、ペンチのペアでそれを押します。ピンと配線の符号なし側の間の抵抗を測定して、接続性を確認します。参照電極用の50マイクロメートルワイヤを含む、準備されたワイヤすべてに対してこのプロセスを繰り返します。次に、電極ワイヤをそれぞれ4つのワイヤーから成る2つのグループにグループ化し、参照ワイヤを単独で残す各配線の端にあるダクトテープを使用してテープを貼ります。電動回転装置の上に電極インターフェースボードを持ち、デバイス上の4本のワイヤの1つのグループからダクトテープの端部を置きます。時計回りに 130 ラウンドを適用し、その後に 20 回時計回りに回転します。その後、シアノアクリル酸接着剤を塗布してテトロードを覆います。接着剤が硬化したら、管テープの近くにテトロードをカットします。この回転、接着、切断を他のテトロードに繰り返します。まず、マイクロドライブハウジングを2ミリメートルのネジでロガーボックスに取り付けます。テトロードと参照電極をマイクロドライブハウジングの背面にある穴に通します。テトロードを2本のシリコンチューブに通し、ポリイミドチューブを通して50マイクロメートルタングステンワイヤーを通します。マイクロダイブをずっと下にねじ込み、シアノアクリル酸接着剤をチューブの上部に塗布してテトロードとワイヤーをチューブに接着し、動きがマイクロドライブと一致していることを確認します。マイクロドライブを上までねじ込みます。動きを防ぐために、露出したテトロードとマイクロドライブハウジング内のワイヤーに柔らかい石油を適用します。プレカットシャーレボトムウィンドウをエポキシでマイクロドライブハウジングの前面に取り付け、アースワイヤーを窓の外に置きます。次に、ロガーボックスカバーとマイクロドライブハウジングの間の露出テトロデおよびワイヤに室温加硫コーティングを適用する。鋭利なはさみを使用してテトローデと参照ワイヤを所望の長さに切断します。この後、ボックスにマークされた、滲出ポリスチレンフォームを取り付けます。水浴に沈んだときに浮力がバランスが取れたりするように、そのサイズを調整します。魚を麻酔した後、魚を水から取り出し、ホルダーに入れます。滅菌ヘラを使用して、指定された手術部位の上の皮膚に5%のリドカインペーストを10分間塗布する。その後、リドカインを取り除く。無菌番号15刃メスを使用して、インプラント用に指定された領域の頭蓋骨の上の皮膚を取り除きます。その後、0.7ミリメートルのドリルビットを備えた歯科ドリルを使用して、頭蓋骨に4つの穴を開けます。穴の1つにシアノアクリル酸接着剤を塗布し、すぐに1ミリメートルのネジを挿入します。残りのドリル穴に対してこのプロセスを繰り返します。この後、歯科用バーニッシャーを使用して、ネジと露出した頭蓋骨の周囲に歯科用セメントを塗布します。歯科ドリルを使用して、関心のある脳領域の上に直径5ミリメートルの穴を作ります。頭蓋骨と脳の間の脂肪組織を除去し、頭蓋骨の下の大きな血管を損傷しないように注意して脳領域ターゲットを露出させるために細かいピンセットと柔らかいティッシュペーパーを使用してください。まず、マイクロドライブハウジングの下部が頭蓋骨の近くにある間に電極が脳に挿入されるようにインプラントを下げる。ハウジングと最も近い頭蓋骨ねじの間に少量の歯科用セメントを塗布することによって、インプラントを頭蓋骨に取り付け始めます。歯科用セメントの最初の部分が硬化した後、追加の歯科用セメントを適用し、頭蓋骨と全体の露出した頭蓋骨の上の穴を閉じます。魚のエラを新鮮な水で洗い流して目を覚ました後、ホルダーから魚を取り出し、ホームタンクに戻します。魚がインプラントで自由に泳ぐことができることを確認してください。これらの実験の目的は、単一細胞の神経活動が魚の行動をどのようにコードするかを研究することです。これを達成するために、テトロードアレイは、神経活動を記録することを可能にする自由に泳ぐ金魚のテレンスファルンに埋め込まれる。記録されている間の脳活動は、データロガーによって300ヘルツでフィルタリングされた31、250ヘルツとハイパスでデジタル化されます。次に、オフラインで禁止パスフィルタが信号に適用され、事前にソートされた生データが各テトロードのチャンネルとリファレンスチャンネルに分けられます。次に一般的なスパイクソートアルゴリズムを使用して、単一セルのアクティビティを特徴付けます。まず、各チャンネルは最小のスパイク振幅しきい値で手動でフィルタリングされます。複数のテトロードまたは参照チャネルに出現したスパイクもフィルタリングされます。検出されたスパイクは、形状、長さ、スパイク間間隔、および原則成分分析によって手動でクラスター化され、フィルタリングされます。手術前にインプラントの完全性を確認することが重要です。テトロードは、標準的なインピーダンスメーターを使用してチェックすることができ、ボックスは水中で漏出をチェックする必要があります。この方法は、システムを保持するのに十分な大きさであれば、多くの水生動物と一緒に動作するように変更することができます。これにより、その行動の根本となる神経機構を研究することができます。

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神経科学

このプロトコルでは、ラットの慢性的な電気生理学的記録のために設計されたマイクロドライブアレイで使用するためのtetrodesを作製し、条件する方法を示しています。さらに、我々は、インストールのアース線と保護円錐を含むマイクロドライブアレイの建設、最終段階を示しています。...

慢性のためのマイクロドライブアレイ in vivoで録音：四極管アセンブリ

麻酔ラットのシリコンプローブを用いた神経活動の細胞外記録について説明する。この技術は、同時に100以上のニューロンからの複数の脳領域間で情報を得ることができる。それは、複数の局所回路における神経細胞のアンサンブルのダイナミクスについての単一細胞の解像度で情報を提供します。...

麻酔ラットのシリコンプローブで大規模なニューロンアンサンブルの録音

ゼブラフィッシュ幼生前脳における細胞外電場電位を記録するためのシンプルな方法が記載されている。方法は、堅牢を提供...

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

このビデオでは、複雑な神経回路を維持し、脳全体の準備、で識別される単一のニューロンからの電気的活動を記録する方法を説明します。私たちは、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）ニューロンは遺伝的に無傷の脳の準備の識別のための蛍光タンパク質でタグ付けされたトランスジェニック魚を使用しています。...

トランスジェニックフィッシュの無傷の脳内で識別ニューロンからの電気的活動を記録する

我々は、自由に同期して、感覚の内部に特別に設計された水槽の両方で正確かつ確実に、動物の電気器官吐出​​タイミング、上体位置姿勢を測定することにより、長時間にわたって弱電気魚の水泳の自発的挙動を研究するための技術のセットを記述隔離室。...

自由水泳弱電気魚の長期的な行動の追跡

本論文では、成人のゼブラフィッシュは、固定化された挿管、無傷の動物における記録と神経活動の操作を可能にするためのin vivo電気生理学的実験のために使用する方法について説明します。...

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

新しい刺激応答の関連付けを学ぶことは、最終的には個々のニューロンのスパイク出力を変えるに反映されている神経プロセスを幅広く行っています。ここでは、動物は、取得し消火し、単一の実験セッション内で条件反応を再取得しながら、単一ニューロン活動の継続的な登録を可能にする行動のプロトコルを記述します。...

自由に学習の三つの段階を越えハトを移動する単一ニューロン」の活動電位を記録する

我々は以前、私たちはつながれたゴキブリの個々のユニットでの活動を監視することを可能にするゴキブリの脳の中心複合体に四極電線を移植するための技術を開発しました。ここでは、私たちが自由に虫を移動させる際に、脳の活動を記録することを可能にする技術の修正版を提示します。...

自由に昆虫を歩くの脳における細胞外ワイヤーテトロード録音

ワイヤレス、マルチ チャンネル記録と自由行動下ラットにおける刺激の双方向システムを導入します。システムは軽量でコンパクトなこのように animal´s...

ワイヤレス、 In Vivo記録そして自由行動下ラットにおける神経活動の刺激のための双方向インタ フェース

このプロトコルは、自由に動くマウスの2つの脳領域に9つの独立して調節可能なテトロデスと1つの調節可能な光シリコンプローブの移植を可能にするハイブリッドマイクロドライブアレイの構築について説明する。また、オプトシリコンプローブを複数の目的で安全に回収・再利用する方法も実証されています。...

自由に動くマウスの二重部位高密度記録のための回収可能なオプトシリコンプローブとテトロードを備えたハイブリッドマイクロドライブシステム

ここでは、使いやすさ、プローブの回収率、実験の汎用性、および行動との適合性が最適化された、げっ歯類の慢性電気生理学用の軽量で費用対効果の高いプローブインプラントシステムを紹介します。...

DREAMインプラント:頭部固定マウスと自由行動マウスの慢性電気生理学のための軽量でモジュール式で費用対効果の高いインプラントシステム

学ぶ 自由に泳ぐ金魚の脳から細胞外神経信号を無線記録する手法。防水デバイスとマイクロドライブを用いて、自然な行動中の神経活動をリアルタイムで観測し、水生動物の行動神経科学の理解を深める。

自由に泳ぐ魚における可動テトロデスによるニューロンの無線電気生理学的記録

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