リンパ節凍結部における腫瘍細胞接着の定量

転移の最も頻繁な部位は、元のリンパ節である。ソマチドは、インビトロで腫瘍細胞リンパ節間の接着親和性を検出するために使用することができる。この技術の利点の1つは、新鮮なリンパ節セクションが元の組織の自然な複雑さを提供し、精製されたタンパク質を使用して再現できないことです。

この方法は、リンパ節のような転移性標的器官における腫瘍細胞の接着を妨げる遺伝子または治療法を同定しようとする分子腫瘍学研究に有用である可能性がある。犠牲から30分以内にリンパ節を収穫するには、成人のウィスターラットを室温のきれいな解剖板の上に後回しの精液に置き、毛皮に70%イソプロピルアルコールを噴霧する。滅菌された器具を使用して、腹部の皮膚を持ち上げ、内側皮膚切開を行い、腹部内臓を露出させます。

胸部および腹部リンパ節が見えるまで腸を抽出する。鈍い先端のはさみを使用して、下層の上腸間膜動脈を傷つけずにリンパ節を慎重に切除し、リンパ節を5mLの無菌PBSを含む15 mLチューブに入れる。すべてのリンパ節が採取されたら、各型の基部にクリオマール1個のリンパ節を下に置き、組織を覆うのに十分な最適な切断温度媒体を加える。

スナップ凍結後、クライオスタットを使用して22°Cで5〜8マイクロメートルの厚さのセクションを取得し、ガラス顕微鏡スライドにセクションを収集します。同じリンパ節の連続したスライスからの良好な品質の凍結部分は、スライス間の違いを最小限に抑え、一貫した細胞接着率を促進するために重要です。腫瘍細胞標識の場合、目的の細胞を適宜ステージングされた細胞培養から収穫し、1x10で細胞をmL濃度および無血清培地の6細胞に再懸濁する。

1 mLの細胞を新しい15 mL円錐形チューブに移し、細胞に37°Cで10分間10分間、細胞沈沈を避けるために10分間、10マイクログラム/mL DiI(C18)で細胞にラベルを付けます。インキュベーションの終了時に、遠心分離により細胞をペレット化し、10mLの新鮮な無血清培地で標識細胞を2回洗浄し、余分な染料を除去する。2回目の洗浄後、1 x 10で細胞を血清フリー培地のmL当たり6細胞に再懸濁し、0.1%ウシ血清アルブミン濃度を補った。

標識された腫瘍細胞を採取したリンパ節組織切片に進み、PBSで2回静かに切片を洗浄し、続いて室温で15分間新鮮なPBSで再水和した。インキュベーションの最後に、綿棒を使用してスライドを乾燥させる前に、2.5%のウシ血清アルブミンを37°Cで30分間非特異的な結合をブロックします。疎水性ペンを使用して各セクションの周りに障壁を描き、各囲まれたリンパ節に100マイクロリットルの標識細胞を追加します。

加湿チャンバーで摂氏37度で1~2時間後、PBSで4回の緩やかな洗い流しで非付着細胞を取り除き、残りの接着性蛍光細胞をPBSで3.7%ホルムアルデヒドで室温で15分間固定します。接着剤指数の定量化には、蛍光顕微鏡で10xの目的を使用して、明るい蛍光界と赤色の蛍光場の各セクションの個々のTIFF画像を取得します。次に、フィジーで画像を開く前に、画像に名前を付けて体系的に保存します。

スケールを設定したら、ポリゴン ツールを使用して、定量化する対象地域を選択します。リンパ節領域を定量化する場合に選択します。データは平方ミリメートルで表されます。

次に、プラグイン、分析、セルカウンターを選択し、定量化する写真をクリックします。[初期化] をクリックし、[カウンターの種類] を選択します。次に、写真のセルをクリックします。

リンパ節接着指数は、対象領域のリンパ節あたりの接着性腫瘍細胞数として表される。次の写真を初期化するには、次の写真を開き、実例に示すように定量化を繰り返します。観察されるように、接着細胞の形態は形で丸められ、細胞は目的のリンパ節全体に不均一に分散される。

リンパ節の接着指数は、対応するNDRG4陽性細胞について測定したものと比較して、NDRG4陰性乳癌細胞株において2〜3倍高い。この手順は、脳や肺のような他の転移性標的組織における接着率を補助し、授精腫瘍細胞に対する接着の二次的優先部位を評価するように適合させることができる。新鮮な組織と凍結組織の両方が生体有害であると考えられ、適切な生体安全対策を講じて処理する必要があることを覚えておいてください。