Name: 抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶ抗生物質脱複製法。耐性遺伝子ライブラリをカスタマイズし、大腸菌を用いて既知の抗生物質を効率的に同定します。専門機器不要で、微生物学研究におけるコストと時間を大幅に削減できます。

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ARP/MARPに関するライトラボの研究は、オンタリオ州研究基金とカナダ保健研究所助成金(FRN-148463)によって支援されました。我々は、ARPライブラリの拡張と組織を支援したソマー・チョウを認めたい。

1.大腸菌ライブラリーグリセロールストックの調製(寒天スラントから)
<ol><li>ARP/MARP大腸菌株を、LB寒天と適切な選択マーカーを含むペトリ皿にリソジェニーブロス(LB)寒天のスラングからストリークします(表1)。</li>
	<li>1つのコロニーで適切な選択可能なマーカーを含むLBの3 mLを接種することにより、大腸菌株の各培養物を調記する。通気(250 rpm)で37°Cで一晩成長します。</li>
	<li>800 μL の培養と 200 μL の無菌 80% グリセロールを 1.8 mL の凍結で組み合わせます。チューブを3~4回反転して混ぜ、-80°Cに保存します。</li>
</ol>2. ARP/MARP冷凍ストックライブラリプレート準備
<ol><li>セクション1で調製したグリセロールストックから、LB寒天と適切な選択可能なマーカーを含むペトリ皿の新しいセットにARP/MARP株をストリークします。37 °Cで一晩成長します。</li>
	<li>無菌技術を用いて、カチオンのピペット500μLは、無菌貯留槽から無菌96深井戸プレートの各井戸にミューラー・ヒントン・ブロス(MHB)を調整した。</li>
	<li>ステップ2.1で用意したプレートでは、アプリケータスティックを使用して、ARP/MARPマップ(補足図1および補足図2)に従って96の深い井戸板を接種します。適切な選択可能なマーカーが各ウェルに追加されていることを確認します。深い井戸板の表面に通気性シール膜を置き、37°C(250 rpm)で一晩インキュベートします。</li>
	<li>ARP/MARP マップを参照して、汚染された井戸がないことを確認します。汚染された場合は繰り返します。マルチチャンネルピペッタを使用して、深い井戸プレートの各ウェルから100μLを無菌96ウェル丸底板に移します。この手順を繰り返して、複数の凍結ストック ライブラリ プレートを作成します。 注:凍結ストックライブラリプレートが汚染された場合にステップ2.1−2.4を繰り返さないように、一度に少なくとも5枚のライブラリプレートを準備することをお知りください。</li>
	<li>無菌50%グリセロールの100μLを各ウェルにピペッティングし、上下にゆっくりとピペッティングして混ぜ合わせ、ARP/MARP冷凍ストックライブラリプレートを作り終えます。</li>
	<li>滅菌アルミニウムシールでプレートを覆い、各井戸が個別に密封されていることを確認してください。</li>
	<li>プレートに番号を付け、特定の時間に新しいテンプレートを接種するための冷凍ストックライブラリプレートを1つだけ専用します。凍結ストックライブラリプレートの汚染が発生した場合は、残りをバックアップとして保管してください。</li>
	<li>プレート蓋をアルミシールの上に置き、-80°Cに保管します。</li>
</ol>3. 種子培養・脱複製プレート調製
<ol><li>アプリケータースティックを使用して、1つの滅菌ガラスビーズを含む試験管内のストレプトマイセス系抗生物質培地(SAM)(または試験対象の他の適切な培地)の3mLを接種し、産生株を有する。デレプリケートされます。ストレプトマイセスの場合は、コロニーの表面から胞子をそっと掻き取ります。</li>
	<li>同じ木製のアプリケータースティックを使用して、ベネットの寒天を含むペトリ皿に無菌制御をストリーク。</li>
	<li>種子培養を30°Cで6日間(250rpm)通気でインキュベートし、無菌制御プレートを30°Cで6日間インキュベートします。 注:SAM とベネットのメディアレシピについては、表 2を参照してください。上記の指示は、ほとんどのアクティノマイセトに適しています。他の細菌や真菌のために必要に応じて成長培温を変更します。</li>
	<li>23 mLの暖かいベネットの寒天を血清的なピペットに吸引して脱複製プレートを準備し、長方形のペトリ皿(材料のテーブル)の表面を均等に20 mL分配し、メディアの残りの部分をピペットに残して防ぎます。気泡形成。 注:プレートを注ぐために使用される表面が水平であることを確認し、寒天があまりにも冷却する前に、この手順を実行します。平らなサーフェスは、次の段階でライブラリを固定するために不可欠です。</li>
	<li>媒体がプレートのすべての領域を覆うまでプレートをゆっくりと回転させ、寒天が完全に設定されるまで、プレートを邪魔しません。</li>
	<li>シートが脱複製プレートの表面に収まるように、長方形のペトリ皿蓋をトレーステンプレートとして使用して、ニトロセルロース膜シート(材料の表)を準備します。シーツを切り、無菌パウチでオートクレーブします。 注:この膜は、生物がその表面に胞子を可能にし、二次代謝物は、以下の媒体に排泄することができる。一度成長すると、膜が除去のためのきれいな表面を提供するために除去されます。膜紙がベネットの寒天の表面に近いほど、脱複製の結果はクリーンになります。</li>
	<li>無菌制御プレートをチェックして、インキュベーションの6日後に汚染物質が存在しないことを確認してください。汚染のない場合は、長方形のペトリ皿の蓋を取り外し、種子培養物のピペット200 μLをベネットの寒天の表面に取り外します。</li>
	<li>無菌綿棒を使用して、プレート全体の表面全体に均等に培養物を広げます。</li>
	<li>ペトリ皿の表面に培養の上にステップ3.6で調製したニトロセルロース膜を置きます。ペトリ皿の下端に膜の下端を合わせることから始め、ゆっくりとプレートの上端に膜を適用します。</li>
	<li>無菌綿棒を使用して、膜寒天界面の間に形成された気泡を滑らかにし、膜が寒天にフラッシュされることを保証します。</li>
	<li>長方形のペトリ皿に蓋を戻し、密閉されたビニール袋に逆さまに置きます。30°Cで6日間インキュベートします。</li>
</ol>4. 復位プレートMHBオーバーレイとARP/MARPライブラリプレート準備
<ol><li>6日後、30°Cインキュベーターから脱複製プレートを取り出します。滅菌ピンセット(70%エタノールでオートクレーブまたはスプレー)を使用して、ベネットの寒天の表面からニトロセルロース膜を慎重に取り除きます。 注:このステップは、脱複製のためのきれいな表面を提供するために、膜の表面に成長した疎水性胞子とmyceliaを除去し、ステップ4.2を容易にします。</li>
	<li>ステップ3.4で説明したように、作業面が水平であることを確認し、血清ピペットを使用して23 mLの暖かい陽イオン調整MHB寒天を吸引する。脱複製プレートの表面に20mLを均等に分配し、空気の泡の形成を防ぐためにピペットに媒体の残りの部分を残すことによってオーバーレイを作成します。</li>
	<li>媒体がすべての領域を覆うまでプレートを穏やかに回転させ、寒天が完全に設定されるまでそれを邪魔しません。冷却して固化したら、脱複製プレートを密閉されたビニール袋に戻し、一晩4°Cで逆さまに保管します。 注:このステップは、発酵ベネットの媒体からMHB寒天オーバーレイへの二次代謝産物の拡散を可能にする。ニトロセルロース膜が適切に調製されなかった場合、MHB寒天を撃退する疎水性特性を有するプレートの縁の周りに胞スが生育します。オーバーレイが汚染される可能性があるため、これらの胞子の上にオーバーレイを注ぎ込まないようにしてください。</li>
	<li>オーバーレイが注がれた同じ日に、100 μLの陽イオン調整MHBを96ウェルプレートの各ウェルにピペッティングして、新鮮なARP/MARPテンプレートを接種します。 注:脱複製中に汚染が広がる可能性を減らすには、単一のARP/MARPライブラリプレートを使用して、2-3脱複製プレートのみをデレプリケートします。したがって、脱複製される株の数に基づいて、十分な96ウェルARP/MARPプレートを接種します。</li>
	<li>冷凍ストックARP/MARPライブラリプレートを-80 °C冷凍庫から取り出します。結露が下側に形成され始める前にアルミニウムシールを取り除き、それによって図書館の板の近隣の井戸を汚染する可能性を減らす。</li>
	<li>無菌の96ウェルピン留めツール(または他の形態の接種装置)を使用して、冷凍ストックARP/MARPライブラリプレートから慎重にピン留めし、新鮮なMHB含有96ウェルプレートを接種します。脱複製時の汚染を最小限に抑えるには、ライブラリプレートごとに2−3のデレプリケーションプレートのみをデプリケートするために必要なARPまたはMARPライブラリプレートをいくつでも準備します。各プレートを接種する間にピン留めツールを殺菌します。</li>
	<li>冷凍テンプレートに新しい無菌アルミニウムシールを貼り、-80°C冷凍庫に戻します。密封されたビニール袋の中に接種された96ウェルプレートを入れ、18時間通気(250 rpm)で37°Cでインキュベートします。 注:新しい冷凍ストックライブラリプレートは、汚染が存在しないことを確認した後、この手順から準備することができます。ステップ2.5に記載されているように-80 °Cで保存する前にプレートにグリセロールを追加します。</li>
</ol>5. ARP/MARP を使用したリプリケートの再現
<ol><li>インキュベーターから ARP/MARP テンプレートを取り外し、汚染物質が存在しないことを確認します。常に、冷凍在庫から直接ではなく、新たに準備されたテンプレートを使用して複製を削除します。</li>
	<li>4°Cから脱複製プレートを取り出し、室温まで平衡化します。結露がある場合は、蓋を開け、無菌環境で乾燥させます。</li>
	<li>無菌ピンニングツール(またはその他の接種装置)を使用して、ARP/MARPライブラリプレートから脱複製プレートのMHB寒天オーバーレイの表面にピンをピン留めします。寒天に突き刺さらないのは注意が必要だ。各脱複製プレートを接種する間にピン留めツールを殺菌します。</li>
	<li>テンプレートを脱複製プレートの表面に固定した後、テンプレートの接種を3-5分間乾燥させます。</li>
	<li>次の日の脱複製結果を分析し、脱複製プレート上の成長を ARP/MARP マップに対応するウェルと比較します (表 3および表 4)。</li>
</ol>

<ol><li>Lo Grasso, L., Chillura Martino, D., Alduina, R. Production of Antibacterial Compounds from Actinomycetes. actinobacteria. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLo+Grasso%2C+L+%22Basics+and+Biotechnological+Applications%22">Basics and Biotechnological Applications</a>. Dhanasekaran, D., Jiang, Y. , IntechOpen. (2016).</li>
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<li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marcel+Faber+Roundtable%3A+Is+our+antibiotic+pipeline+unproductive+because+of+starvation%2C+constipation+or+lack+of+inspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Marcel Faber Roundtable: Is our antibiotic pipeline unproductive because of starvation, constipation or lack of inspiration.</a> Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 33, 507-513 (2006).</li>
<li>Baltz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+discovery+from+actinomycetes%3A+Will+a+renaissance+follow+the+decline+and+fall%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibiotic discovery from actinomycetes: Will a renaissance follow the decline and fall.</a> Archives of Microbiology. 55, 186-196 (2005).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

上記のプロトコルは、その活性を救出するために既存の抗生物質と組み合わせて使用することができる新しい抗菌化合物およびアジュバントの両方の発見に適用することができる。プラットフォームは、耐薬品抽出物内の化合物を脱複製するために、抵抗機構とその認知抗生物質の高い基質特異性を利用します。脱複製プレートの調製に要する時間は長い(~2週間)が、一晩のインキュベーション期間を経て脱複製プロセス自体が完了し、分離および特徴付けにかかる時間に比べて速い。粗抽出物からの化合物。さらに、高価な機器や高度に専門性の高い機器は不要で、このプラットフォームはアクセスしやすく、費用対効果が高くなります。
このプラットフォームのもう一つの大きな利点は、その柔軟性です。ARPは、より多くの抗生物質クラスを包含する耐性遺伝子を含むために拡張することができる。これは、新規耐性酵素の出現に関する文献をモニタリングし、基本的な分子クローニング技術を使用して大腸菌ライブラリーに遺伝子を追加することによって達成されます。さらに、デレプリケーションテンプレートは、個人が非複製時に使用する範囲または狭い範囲基板特...

1928年にペニシリンが発見されて以来、環境微生物由来の天然物は、抗菌化合物1の豊富な供給源であることが証明されている。天然物系抗生物質の約80%はストレプトマイセス属および他の多発性菌の細菌に由来し、残りの20%は真菌種1によって産生される。β-ラクタム、テトラサイクリン、リファマイシン、アミノグリコシドなどの診療所で使用される最も一般的な抗生物質足場のいくつかは、もともと微生物2から単離された。しかし、多剤耐性(MDR)細菌の増加により、現在の抗生物質のパネルは治療3、4であまり効果がなくなってきています。これらには、「ESKAPE」病原体(すなわち、バンコマイシン耐性腸球菌およびβ-ラクタム耐性黄色ブドウ球菌、クレブシエラ肺炎、シュードモナス・エルギノーサ、アシネトバクター・バウマンニ、およびエンテロバクターsp.)は、世界保健機関(WHO)3、4、5などの多くの主要な公衆衛生当局によって最も高いリスクに関連していると考えられる細菌のサブセットである。これらのMDR病原体の出現とグローバルな広がりは、新しい抗生物質3、4、5の絶え間ない必要性をもたらす。残念ながら、過去20年間で、微生物源からの新しい抗生物質の発見はますます困難であることを実証している6.創薬に対する現在のアプローチには、天然物抽出ライブラリーを含む生理活性化合物のハイスループットスクリーニングが含まれており、所定の時間2で何千もの抽出物を試験することができる。しかし、抗菌活性が検出されると、次のステップは、原油抽出物の内容物を分析して活性成分を同定し、既知または冗長化合物7、8を含むものを排除する。このプロセスは、脱複製と呼ばれ、既知の抗生物質7、9の再発見に費やされる時間を防止および/または大幅に短縮するために不可欠である。天然物創薬の必要なステップですが、脱複製は、非常に手間がかかり、リソース集約的な10.
Beutlerらは、最初に「脱複製」という用語を造語して以来、既知の抗生物質11、12の迅速な同定のための革新的な戦略を開発するための広範な努力がなされてきた。今日、脱複製に使用される最も一般的なツールには、高性能液体クロマトグラフィー、質量分析、および核磁気共鳴ベースの検出方法11、13などの分析クロマトグラフィーシステムが含まれる。残念ながら、これらの方法のそれぞれは、高価な分析機器と高度なデータ解釈の使用を必要とします。
特殊な装置なしで迅速に行うことができる脱複製法を開発する試みとして、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)10を確立した。ARPは、抗生物質アジュバントの発見、既知の耐性機構に対する新しい抗生物質化合物のプロファイリング、およびアクチノバクテリアおよび他の微生物由来の抽出物における既知の抗生物質の脱複製に使用することができる。ここでは、抗生物質の脱複製におけるその応用に焦点を当てる。ARPは、最も一般的に再発見された抗生物質14,15に対して有効である個々の抵抗遺伝子を発現する等方性エシェリヒア大腸菌株のライブラリーを利用する。大腸菌ライブラリーが二次代謝産物産生生物の存在下で成長すると、化合物の同一性は、関連する耐性遺伝子10を発現する大腸菌株の増殖によって推測されうる。ARPが最初に報告されたとき、ライブラリーは16の抗生物質クラスに対する耐性を与える>40遺伝子で構成されていました。元の脱複製テンプレートは、脱複製プロセス中に抗生物質サブクラスに関する情報を提供するために、抗生物質クラスごとの耐性遺伝子のサブセットを包含するように設計されました。今日、ARPは18の抗生物質クラスに対する抵抗性を与える>90遺伝子で構成されている。耐性遺伝子の広範なコレクションを使用して、二次脱複製テンプレートが開発され、最小抗生物質耐性プラットフォーム(MARP)として知られています。このテンプレートは、遺伝子の冗長性を排除し、単に脱複製された代謝産物が関連する一般的な抗生物質クラスに関する情報を提供するために作成されました。さらに、MARPテンプレートは、野生型と大腸菌BW25113(大腸菌BW25113ΔbamBΔtolC)の両方の肥一性/流出欠損株の両方を有し、ARPの元の化身と比較して、唯一の過透過性株を利用する。このユニークな側面は、脱複製中に追加の型を作成し、グラム陰性細菌の外膜を横断する化合物能力を示す。ここでは、ARP または MARP を使用して複製を解除する際に従うべき堅牢なプロトコルについて説明し、従うべき最も重要な手順を強調し、さまざまな可能な結果について説明します。

<table><tbody><tr><td>寒天</td>バイオ<td>ショップ</td><td>AGR003.5</td><td></td></tr><tr><td>冷蔵用AlumaSeal CSフィルム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Z722642-50EA</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム塩</td><td>バイオショップ</td><td>AMP201.100</td><td></td></tr><tr><td>BBL ミューラーヒントンIIブロス (陽イオン調整)</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>212322</td><td></td></tr><tr><td>BBLフィトン・ペプトン (ソイトン)</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>211906</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カルシウム</td><td>バイオショップ</td><td>CAR303.500</td><td></td></tr><tr><td>カサミノ酸</td><td>バイオベーシック</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>クライオピュアチューブ 1.8 mL mix.color</td><td>Sarstedt</td><td>72.379.992</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>バイオショップ</td><td>GLU501.5</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル培養チューブ、16 mm x 100mm</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-961-29</td><td></td></tr><tr><td>エチル アルコール 無水</td><td>商業アルコール</td><td>P016EAAN</td><td></td></tr><tr><td>ガラスビーズ、固体</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>11-312C</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>バイオショップ</td><td>GLY001.4</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>インスタント シーリング滅菌ポーチ</td><td>フィッシャーScientific</td><td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>鉄 (II) 硫酸塩七水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7002-250G</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩</td><td>バイオショップ</td><td>KAN201.50</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス レノックス</td><td>バイオショップ</td><td>LBL405.500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>M63-500</td><td></td></tr><tr><td>MF-ミリポア メンブレン フィルター、0.45 & マイクロ;m孔径</td>ミリ<td>ポアシグマ</td><td>HAWP00010</td><td>10 FTロール、親水性、白、プレーン</td></tr><tr><td>マイクロテストプレート96井戸、ラウンドベース</td><td>Sarstedt</td><td>82.1582.001</td><td></td></tr><tr><td>ニューブランズウィックイノーバ&nbsp;44</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0000</td><td></td></tr><tr><td>Nunc OmniTray シングルウェルプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>264728</td><td>蓋付き、滅菌済み、未処理</td></tr><tr><td>ペトリ皿 92 mm x 16 mm カム付き</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>ピン留めツール</td><td>ETH チューリッヒ</td><td>-</td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>じゃがいも澱粉</td><td>バルク納屋</td><td>279</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>硝酸ナトリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S343-500</td><td></td></tr><tr><td>ウッド・アプリケーター</td><td>デュカル・コーポレーション</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP1422-2</td><td></td></tr></tbody></table>

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

天然物抽出物からの新しい抗生物質の探索における主な課題の1つは、一般的な化合物の再発見です。この課題に対処するために、既知の化合物を同定するプロセスである脱複製が目的のサンプルに対して行われます。分析分離、質量分析などの脱複製の方法は、時間とリソースを大量に消費します。脱複製プロセスを改善するために、抗生物質耐性プラットフォーム(ARP)を開発しました。ARPは、エシェリヒア大腸菌に個別にクローニングされた約100の抗生物質耐性遺伝子のライブラリーです。この株のコレクションは、抗生物質の脱複製のための費用対効果の高い、顔の良い方法を含む多くのアプリケーションを持っています。このプロセスは、固体媒体を含む長方形ペトリ皿の表面に抗生物質産生微生物を発酵させ、それによって培地を介した二次代謝産物の分泌および拡散を可能にする。6日間の発酵期間の後、微生物バイオマスを除去し、薄い寒天オーバーレイをペトリ皿に加えて滑らかな表面を作成し、大腸菌指標株の成長を可能にします。ARP株の私たちのコレクションは、抗生物質含有ペトリ皿の表面に固定されます。プレートは、オーバーレイの表面に大腸菌の成長を可能にするために、次に一晩インキュベートされます。特定の抗生物質(またはクラス)に対する耐性を含む株のみがこの表面上で成長し、生成された化合物の迅速な同定を可能にする。この方法は、既知の抗生物質の生産者の同定と、新しい化合物を産生するものを同定する手段として正常に使用されている。

以下の結果は、ARPおよび/またはMARPを使用して抗生物質産生株のコレクションが非複製された場合に得られた。
ARP/MARP 脱複製ワークフローの図を図 1に示し、ライブラリ プレート マップを補足図 1および補足図 2 に示します。図2は、環境抽出物WAC 8921がクロラムフェニコール生産者として同定される陽性脱複製結果を示す。図3は、ARPの成長の欠如を完全に示し、これは、未知の抗生物質またはARP/MARPライブラリープレートに考慮されていないあまり一般的に見つからない抗生物質の存在を示す。図4は、野生型大腸菌BW25113と、過透過性および流出不十分な変異体大腸菌BW25113 ΔbamBΔtolC</e...

抗生物質の脱複製に対する同種抗生物質耐性エシェリヒア大腸菌のライブラリーを利用するプラットフォームについて述べる。細菌または真菌によって産生される抗生物質の同一性は、それぞれの耐性遺伝子を発現する大腸菌の増殖によって推定することができる。このプラットホームは経済的に有効で、時間効率が良い。

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

当社のプロトコルは、特殊な機器を使用せずに、既知の抗生物質の費用対効果とタイムリーな非レプリケーションの両方を可能にするため、重要です。この手法の主な利点は、テンプレートのカスタマイズです。これは、個人が広いまたは狭い基質特異性の所望のレベルに基づいて、彼らのライブラリテンプレートに含めたい抵抗遺伝子を調整できることを意味します。例えば、β-ラクタムは、β-ラクタムとその様々なサブクラスの高度に特異的な逆複製を可能にするために、大腸菌テンプレートを発現する。敗血症技術を使用して、ピペット500マイクロリットルのカチオンは、無菌貯蔵所から滅菌の各ウェルにMHBを調整し、96深いウェルプレートを調整した。準備されたARPまたはMARP歪みプレートで、ARPまたはMARPマップに従って96深いウェルプレートを接種するためにアプリケータスティックを使用してください。深いウェルプレートの表面に通気性の密閉膜を置き、摂氏37度、250 RPMで一晩インキュベートします。汚染された井戸がないことを確認します。マルチチャンネルピペットを使用して、深いウェルプレートの各ウェルから滅菌96ウェルラウンドボトムプレートに100マイクロリットルを移します。各ウェルに無菌50%グリセロールの100マイクロリットルを加え、上下に軽くピペットで混ぜます。少なくとも5つの図書館の版を準備する。滅菌アルミニウムシールでプレートを覆い、各ウェルが個別に密封されていることを確認します。プレートの蓋をアルミニウムシールの上に置き、マイナス80度で保管します。木製のアプリケータースティックを使用して、ストレプトマイセスコロニーの表面から胞子をそっと削り取り、1つの無菌ガラスビーズと3ミリリットルのストレプトマイス抗生物質培地を含む試験管に移します。試験管をキャップでゆるく閉じて、エアーレーションを可能にします。同じ木製アプリケータースティックを使用して、ベネットの寒天を含むペトリ皿に不妊手術をストリーク。250 RPMで6日間、滅菌対照プレートを摂氏30度で6日間、摂氏30度で種子培養を含むチューブをインキュベートします。次に、レベルサーフェスで、レプリケーション解除プレートを準備します。暖かいベネットの寒天の23ミリリットルを血清ピペットに吸い込み、長方形のペトリ皿の表面を均等に20ミリリットル分配し、残りの培地をピペットに残して気泡の形成を防ぎます。蓋をしてプレートを覆います。プレートの全領域にメディアが覆われ、寒天が完全に設定されるまで邪魔しないようにプレートをそっと回転させます。次に、シートがデレプリケーションプレートの表面に合うように、長方形のペトリ皿蓋をトレーシングテンプレートとして使用してニトロセルロース膜シートを調製します。シートを切り、無菌ポーチにオートクレーブします。さて、6日間のインキュベーションの後に汚染物質が存在しないように、滅菌制御プレートを確認してください。汚染のない場合は、長方形のペトリ皿とピペット200マイクロリットルの種子培養液の蓋を、長方形の皿のベネットの寒天の表面に取り除きます。滅菌綿棒を使用して、プレート全体の表面に均等に培養を広げます。ペトリ皿の表面上の培養物の上に準備されたニトロセルロース膜を配置するには、膜の下端をペトリ皿の下端に合わせ、膜を下端からプレートの上端にゆっくりと塗布します。無菌綿棒を使用して、膜寒天界面の間に形成された可能性のある気泡を滑らかにし、膜が寒天にフラッシュされるようにします。膜は、二次代謝産物が下の媒体に排泄され得る間、生物がその表面上で胞子を散発することを可能にする。蓋を長方形のペトリ皿に戻し、密閉されたビニール袋に逆さまに置きます。摂氏30度で6日間インキュベートします。6 日後、インキュベーターからデレプリケーションプレートを取り外します。滅菌ピンセットを使用して、慎重にベネットの寒天の表面からニトロセルロース膜を除去します。追加するオーバーレイを汚染する可能性を減らすには、プレートの端の周りにわずかな胞毛の成長が存在することを確認してください。作業面がレベルであることを確認し、血清学的ピペットを使用して23ミリリットルの暖かいカチエイト調整されたMHB寒天を吸引します。空気泡の形成を防ぐために、配管に寒天の残りの部分を残して、20ミリリットルを均等にデズリングして、重ね合わせを作成します。蓋をプレートに置きます。プレートを、中程度の部分が覆い、寒天が完全に設定されるまで邪魔しないようにします。冷却して固まったら、デレプリケーションプレートを密閉されたビニール袋に戻し、一晩摂氏4度で逆さまに保管し、MHB寒天オーバーレイへの二次代謝物の拡散を可能にします。同じ日に、最初に100マイクロリットルのカチオン調整MHBを96ウェルプレートの各ウェルにピペット化して、新鮮なARPまたはMARPテンプレートを接種します。氷のストックARPまたはMARPライブラリプレートをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出します。縮合が下側に形成され始める前に、アルミニウムシールを取り外します。滅菌96ウェルピン留めツールを使用して、冷凍ストックARPまたはMARPライブラリプレートから慎重にピン留めし、96ウェルプレートを含む新鮮なMHBを接種します。レプリケーション解除時の汚染を最小限に抑えるには、ライブラリプレートごとに2~3個のレプリケーション解除プレートの複製を解除するために必要なARPまたはMARPライブラリプレートを多数用意します。完了したら、冷凍テンプレートに新しい滅菌アルミニウムシールを入れ、マイナス80°C冷凍庫に戻します。緩く密封されたビニール袋の中に接種された96ウェルプレートを入れ、250 RPMで18時間揺れで摂氏37度でインキュベートします。インキュベーターから ARP または MARP テンプレートを削除し、プレートを ARP または MARP テンプレート マップと比較して汚染物質が存在しないようにします。4°Cからデレプリケーションプレートを取り外し、室温に平衡化することができます。結露がある場合は、蓋を開け、滅菌環境で乾燥させます。無菌ピン留めツールを使用して、ARPまたはMARPライブラリプレートから、複製解除プレートのMHB寒天オーバーレイの表面にピン留めします。寒天を突き刺さないでテンプレートの接種を3〜5分間乾燥させます。接種された非複製プレートを密閉されたビニール袋に逆さまに入れ、摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、デレプリケーション プレートの成長を ARP または MARP マップに対応するウェルと比較して、レプリケーションデレプリケーション結果を分析します。この ARP または MARP レプリケーション解除ワークフローでは、正のレプリケーション解除結果が得られました。ここで株WAC 8921のために調製された抽出物はクロラムフェニコール生産者として同定された。ARPの成長の欠如は、未知の抗生物質またはARPまたはMARPライブラリプレートで考慮されなかったあまり一般的に見つかった抗生物質の存在を示す。MARPに特有の成長パターンは、野生型大腸菌BW25113とハイパー透過性およびeフラックス欠損変異体E.coli BW25113 bamB tolCの両方の利用のために形成された。この結果は、無傷の外膜を超えることができなかった抗菌活性を有する化合物の存在を示唆している。この大腸菌の成長パターンは、ピン留めツールの不適切な滅菌を示唆し、その結果、未知の大腸菌株がオーバーレイ全体に伝達される。そして、ARPまたはMARP冷凍ストックライブラリプレート汚染の例は、長方形のペトリ皿表面に成長した3つの異なる大腸菌コロニーをここで示しています。この結果は、レプリケーション解除中に寒天オーバーレイがピアスされたことを示します。MHBオーバーレイ関連の汚染は、デレプリケーションプロセス中にも発生する可能性があります。このプロトコルに従うときに覚えておくべきことは、汚染のために任意のステップで抑えきれないようにするために、適切な殺菌と無菌技術を使用することです。これには、MHBオーバーレイを流す際の胞子の広がりを最小限に抑えるために、ベネットの寒天板の表面にできるだけ近づくようにニトロセルロース膜を準備することが含まれます。さらに、最もクリーンな結果を生み出すためには、ライブラリプレートを接種し、脱複製する際に適切に滅菌されたピン留め装置を使用することも非常に重要です。既知の抗生物質の脱複製に加えて、この方法は、既存の抗生物質と組み合わせて使用できる補助剤を同定して活動を救うことができる。抗生物質のデレプリケーションは新しい技術ではありませんが、リソースを大量に消費し、時間がかかることで悪名高いです。ARPおよびMARPプラットフォームは、抗生物質のデレプリケーションが大規模な生産である必要はないが、最小限の装置を使用して2週間にわたって完了できる方法に光を当てるのに役立ちます。

antibiotic-dereplication-using-the-antibiotic-resistance-platform

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

細菌性病原体診断のための簡単​​な一日のワークフロースキームの設計は、血流感染症の迅速な認識を可能にします。...

血液培養から細菌性病原体の検出および抗菌剤耐性テストのための一日のワークフロースキーム

出典: Ghadigaonkar、D.およびRath、A.水系抗生物質耐性菌の単離と同定、およびそれらの抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価。 J. Vis. 経験。...

分子分析のための水サンプルからの抗生物質耐性菌の単離

出典: Zhang, M. ら、 単一細菌における重水素取り込みの刺激ラマン散乱イメージングによる迅速抗菌薬感受性試験。J. Vis. Exp.

誘導ラマン散乱顕微鏡を用いた細菌抗生物質感受性の検出

Source: Escudero, J. A., et.al. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates how escalating cefazidime exposure is used to compare the survival of three E. coli strains with different copies of the ampicillin resistance gene. It shows that only the strain with a multicopy plasmid survives at higher drug levels, highlighting how increased gene copy number accelerates resistance evolution.

Assessing the Role of Gene Copy Number in the Evolution of Bacterial Antibiotic Resistance 

抗生物質耐性の進化でマルチコピー...

抗生物質耐性の進化のマルチコピー プラスミドのロールのテスト

蛍光タグ付き抗生物質は抗菌性の複数の側面を研究するために使用することができる強力なツールです。この記事では、蛍光タグ付き抗生物質の調製と細菌における抗生物質耐性を研究するアプリケーションについて説明します。プローブは、分光光度測定、フローサイトメトリー、顕微鏡法によって細菌耐性(例えば、流出)のメカニズムを研究するために使用することができる。...

蛍光系抗生物質プローブを用いた細菌耐性の可視化

私たちの実験的アプローチは、細菌集団における時間の経過とともにプラスミドの豊富さと抗生物質耐性に従う戦略を提供します。...

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

ここでは、水からの抗生物質耐性菌の分離と同定、およびそれらの抗生物質耐性遺伝子(ARG)の分子特性評価のための詳細なプロトコルを紹介します。培養ベースおよび非培養ベース(メタゲノム解析)技術の使用は、インドのムンバイからの淡水に存在する細菌の多様性全体とさまざまなARGの総プールに関する完全な情報を提供します。...

水系抗生物質耐性菌の単離・同定と抗生物質耐性遺伝子の分子特性評価

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

このプロトコルは、ロングリードシーケンシングプラットフォームを使用して結 核菌...

ロングリードシーケンシング技術を用いたアンプリコンシーケンシング

学ぶ抗生物質脱複製法。耐性遺伝子ライブラリをカスタマイズし、大腸菌を用いて既知の抗生物質を効率的に同定します。専門機器不要で、微生物学研究におけるコストと時間を大幅に削減できます。

抗生物質耐性プラットフォームを用いた抗生物質脱複製

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