個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ
2019年12月13日
このプロトコルは、リポソームの作製と、蛍光顕微鏡を用いて表面上に固定化し、個々に画像化する方法について説明します。これにより、集団の単一リポソーム間のサイズおよび組成不均一性の定量が可能になる。
リポソームを用いたほとんどの研究は、本質的にすべてのリポソームが同一であると仮定する大胆な技術に依存しています。単一のリポソームを研究することによって、有意な不均一性が観察され得る。ここで紹介する単一のリポソーム技術は、我々は同時にリポソームの数百を研究し、そのサイズと組成の不均一性を検出することができます。
この方法は、タンパク質膜相互作用などの単一のリポソームレベルで他のシステムを研究するように容易に調整することができる。必要なのは、蛍光標識を受けるために研究する化合物です。このビデオでは、研究者が単一のリポソーム研究を行う方法に関するツールを提供します。
アッセイを簡単に修正して、他の科学的なトピックの範囲を研究できることを願っています。まず、準備された脂質ストック138マイクロリットルのPOPCと120マイクロリットルのコレステロールを新鮮なガラスバイアルに混ぜます。次に、蛍光標識脂質2個とDSPE-PEGビオチン50マイクロリットルをそれぞれ500マイクロリットル加えます。
ガラスバイアルの蓋を緩め、1〜2分間液体窒素でバイアルを凍結します。凍結した脂質混合物を凍結乾燥機で一晩凍結乾燥して凍結乾燥する。朝、乾燥した脂質に200ミリモルDソルビトールバッファーの1ミリリットルを追加します。
混合物を摂氏45度に加熱し、少なくとも1時間磁気攪拌にさらします。次に、バイアルを液体窒素に浸して脂質懸濁液を凍結し、懸濁液が完全に凍結するまで待つ。次に、冷凍懸濁液を冷暖房浴で55°Cで完全に解凍するまで浸します。
混合物を合計 11 回の凍結融解サイクルに公開します。その後、ミニ押出キットを使用して、リポソーム懸濁液を800ナノメートルポリカーボネートフィルターを通して一度押し出す。BSAビオチンの1、200マイクロリットルおよび120マイクロリットルを混合する。
8ウェルスライドで各ウェルに300マイクロリットルの混合物を加え、室温で20分間インキュベートします。わずかにスライドを傾け、各の端から培地を吸引します。速やかに300マイクロリットルのHEPESバッファーを各ウェルに加えて洗浄します。
各井戸を全部で8回洗います。ストレプトアビジンを250マイクロリットル加え、室温で10分間インキュベートします。前述のとおり、8回の打ち上がを繰り返します。
スライドを顕微鏡に置き、顕微鏡ジョイスティックを調整してチャンバーの表面に焦点を合わせます。これは、ガラスバッファインターフェースからの増加したレーザー反射信号をガイドとして使用して簡単に行うことができます。マイクロ遠心チューブに、20マイクロモル全脂質を含む希釈リポソームストックの10マイクロリットルを加える。
100マイクロリットルのバッファーをチャンバからマイクロ遠心チューブに移し、適切に混合し、110マイクロリットルをチャンバーに戻します。チャンバーを顕微鏡の下に置き、リポソームフルオロフォアからの信号を検出できる初歩的な顕微鏡設定を使用して、表面に固定化されているリポソームを観察する。原稿に記載されているように顕微鏡を設置します。
リポソーム内のドープATTO488とDOPE ATTO655フルオロフォアの両方を画像化するには、複数のチャンネルを画像化します。クロス励起を避けるために、各チャンネルが連続してイメージ化されていることを確認します。例えば、最初に488ナノメートルで励起し、495〜590ナノメートルで発光を読み取ることによって1つの画像を撮ります。
その後、設定を変更し、633ナノメートルでエキサイティングな別の画像を撮るが、660〜710ナノメートルでのみ発光を読み取る。分析。画像メニューでカラーを選択し、マージチャネル機能を使用して2つのチャンネルの合成を作成します。2つの異なるチャンネルで画像化されたリポソームが良好な共局在化を示しているか、可視ドリフトが発生したかどうかを確認します。
パーティクルを検出するには、プラグインメニューを開き、「ComDet」を選択して「パーティクルを検出」をクリックします。ComDet で、設定が正しいことを確認し、[OK] をクリックします。解析を実行した後、結果と概要を表示する 2 つのポップアップ ウィンドウ。結果表には、2 つのチャンネル間の強度比が含まれています。
共ローカリゼーション データを含むデータ テーブルの結果をエクスポートします。強度比ヒストグラムをガウス関数でフィットさせ、平均と標準偏差を抽出します。平均と標準偏差は、不均一性の程度を計算するために使用することができます。
50ナノメートルフィルターを介して数回押し出されたリポソーム製剤を調製する。蛍光強度とDLSからのサイズデータを比較することにより、リポソームのサイズを較正します。以前と同じ実験顕微鏡設定で、キャリブレーションリポソームを画像化します。
キャリブレーションリポソームの蛍光強度の平方根強度ヒストグラムをプロットする。ヒストグラムを対数正規分布に適合させ、キャリブレーションリポソームの平均蛍光強度を幾何平均として抽出します。平方根強度とリポソームサイズの関係を求めるには、動的光散乱測定から得られた平均リポソーム径を平方根強度の幾何平均で割って補正係数を算出する。
組成不均一性実験でリポソームの平方根強度値を計算し、補正係数を掛けてこれらの2つの直径を変換します。リポソームの組成不均一性の直径の関数として強度比値をプロットし、およそ50ナノメートルから800ナノメートルに及ぶリポソームの集団に対するリポソームサイズの関数として不均一性を達成する。このプロトコルにおいて、リポソームの表面固定化が成功したのは、回折限度合いのスポットによって示されるチャンバへのリポソーム溶液の添加時にすぐに明らかであった。
フレームあたり300〜400リポソームの密度を達成するのに十分なリポソームを固定することをお勧めします。密度が低いとデータ分析に時間がかかり、密度が高いと単一のリポソームを区別するのが難しくなります。視野全体が適切に焦点を合わせていない場合は、サンプルプレートが傾いている可能性があります。
また、リポソームが大きく、ぼやけているように見える場合、これはチャンバー内の緩衝液が蒸発し、表面が乾燥している可能性があることを示している。強度比ヒストグラムは、通常、平均比値の周りのガウス分布を明らかにします。ガウス分布からの強い偏差が観察された場合、それは弱いシグナルを示すリポソームのサブセットが除外されたことを示唆する検出感度の問題を示している。
強度比ヒストグラムをガウス関数でフィッティングした後、不均質度値0.23の程度は、アンサンブルの平均モル比から23%以上異なる人口の32%に翻訳された。実験の不確実性の定量化は0.1であることが判明した。アッセイは、高品質のユニラミナルリポソームが不可欠であるため、使用する材料よりも良くなることはありません。
したがって、これらを準備するときは、フリーズ解凍サイクルを残すなどのコーナーをカットしないでください。貧弱な画像は、高い実験の不確実性をリードし、不均質性を過大評価させるので、時間をかけて焦点を合わせる画像を取得します。アッセイが基本的に行うことは、蛍光標識の表面密度を研究することです。
この蛍光標識がパーコレート脂質上にある場合、このアッセイは、薬物送達のためのリポソームの品質検査に使用することができる。セットアップは、ペプチドが膜に結合し、曲率を感知する方法を研究するために適用されています。これは、研究者にペプチドが細胞内でソートされる方法を支配する分子手がかりにユニークな洞察を与えました。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルは、単一のリポソームを研究するための方法を説明しており、サイズと組成の顕著な不均一性の観察を可能にします。蛍光顕微鏡を使用すると、研究者は個々のリポソームを並行して画像化し、定量化することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 生物物理学
- 蛍光顕微鏡
- ナノテクノロジー
背景
- 従来の研究では、リポソームは同一であると仮定されています。
- 単一のリポソーム研究は不均一性を明らかにします。
- この技術には蛍光マーキングが不可欠です。
- この方法は様々なシステムに適応できます。
研究の目的
- 単一のリポソームを研究するためのプロトコルを提供すること。
- サイズと組成の違いを定量化すること。
- 研究者がタンパク質膜相互作用を探索できるようにすること。
使用される方法
- リポソームの製造。
- 表面への固定化。
- 蛍光顕微鏡を使用した大規模な並行画像化。
- リポソームの特徴の定量化。
主な結果
- リポソーム集団における顕著な不均一性が観察されました。
- この方法により、数百のリポソームを同時に研究することができます。
- 他の蛍光マーキングされた化合物にも適応可能です。
- この分野の研究者に新しいツールを提供します。
結論
- 単一のリポソーム技術は、リポソームの挙動の理解を深めます。
- 複雑な生物学的相互作用の研究への道を開きます。
- 研究者は、これまでにないレベルでリポソームの多様性を調査できるようになりました。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Ensuring batch-to-batch consistency in liposomal drug formulations is critical for predictable pharmacokinetics and regulatory compliance. This single-particle fluorescence microscopy assay enables direct detection of size and compositional inhomogeneities that bulk methods miss, supporting mechanistic de-risking in early formulation development. By quantifying heterogeneity at the individual liposome level, the method improves predictive confidence in lipid nanoparticle performance and informs go/no-go decisions in preclinical screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates lipid formulation hypotheses by revealing compositional variance that may impact drug encapsulation efficiency.
- Operational Value: Enables functional validation of lipid excipient ratios through direct single-liposome readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, characterized liposome populations for downstream protein-membrane interaction or peptide binding assays.
- Operational Value: Delivers quantitative fluorescence intensity ratios as reproducible readouts for assay standardization across labs.
- Scientific Value: Supports scalable screening of lipid variants by enabling parallel imaging of hundreds of liposomes per field.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links liposome physicochemical properties to functional outcomes in drug delivery models through correlative size-composition analysis.
- Operational Value: Provides a disease-relevant system for evaluating how formulation changes affect liposome uniformity prior to in vivo testing.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling lipid formulation screening after initial design and before cellular efficacy testing, supporting data-driven progression decisions.
- Discovery Biology: Tests lipid composition hypotheses by measuring inhomogeneity as a function of size, clarifying structure-property relationships in membrane models.
- Screening: Generates intensity ratio histograms that serve as quantitative outputs for comparing lipid formulations under identical imaging conditions.
- Analytics: Extracts mean and standard deviation from Gaussian-fitted intensity ratio histograms to calculate degree of inhomogeneity, enabling statistical comparison of batches.
- Translational Research: Connects nanoscale lipid variability to macroscale performance by correlating single-liposome data with dynamic light scattering size calibration.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for lipid nanoparticle characterization that can be adapted to study protein binding, peptide sorting, or membrane curvature sensing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in lipid-drug interactions by exposing hidden population heterogeneity.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized immobilization, washing, and multi-channel imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying non-uniform batches early, reducing failure risk in later-stage development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lipid formulations based on quantified compositional uniformity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy, lipid handling, and image analysis plugins such as ComDet for particle detection.
- Depends on access to a microscope capable of sequential multi-channel imaging and freeze-thaw extrusion equipment for liposome preparation.
- Necessitates standardization of lipid stock preparation, extrusion cycles, and surface immobilization timing across users.
- Must account for buffer evaporation and focus drift, which can artificially inflate size measurements or reduce signal-to-noise.
- Performance is limited by fluorophore brightness and labeling efficiency; suboptimal labeling increases experimental uncertainty and risks overestimating inhomogeneity.
