Name: 個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-13T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶ 定量的蛍光顕微鏡を用いた単一リポソームアッセイにより、リポソーム集団における組成とサイズの不均一性を検出する方法です。数百個のリポソームを同時に解析し、膜タンパク質相互作用の研究にも応用可能です。

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この作品はデンマーク独立研究評議会(補助金番号5054-00165B)によって資金提供されました。

<ol><li>Chan, Y. H. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model+membrane+systems+and+their+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li>
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<li>Bhatia, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipathic+motifs+in+BAR+domains+are+essential+for+membrane+curvature+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing.</a> EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).</li>
<li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+curvature+enables+N-Ras+lipid+anchor+sorting+to+liquid-ordered+membrane+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane curvature enables N-Ras lipid anchor sorting to liquid-ordered membrane phases.</a> Nature Chemical Biology. 11 (3), 192(2015).</li>
<li>Larsen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Curvature+and+Lipid+Composition+Synergize+To+Regulate+N-Ras+Anchor+Recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane Curvature and Lipid Composition Synergize To Regulate N-Ras Anchor Recruitment.</a> Biophysical Journal. 113 (6), 1269-1279 (2017).</li>
<li>Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+intermediates+in+SNARE-induced+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (52), 19731-19736 (2006).</li>
<li>Fix, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+single+membrane+fusion+events+mediated+by+SNARE+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (19), 7311-7316 (2004).</li>
<li>Hatzakis, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Enzyme+Studies+Reveal+the+Existence+of+Discrete+Functional+States+for+Monomeric+Enzymes+and+How+They+Are+%22Selected%22+upon+Allosteric+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Single Enzyme Studies Reveal the Existence of Discrete Functional States for Monomeric Enzymes and How They Are "Selected" upon Allosteric Regulation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (22), 9296-9302 (2012).</li>
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<li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryotic+P-type+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct observation of proton pumping by a eukaryotic P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1469-1473 (2016).</li>
<li>Tonnesen, A., Christensen, S. M., Tkach, V., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrical+Membrane+Curvature+as+an+Allosteric+Regulator+of+Membrane+Protein+Structure+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Geometrical Membrane Curvature as an Allosteric Regulator of Membrane Protein Structure and Function.</a> Biophysical Journal. 106 (1), 201-209 (2014).</li>
<li>Kristensen, K., Ehrlich, N., Henriksen, J. R., Andresen, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Vesicle+Detection+and+Analysis+of+Peptide-Induced+Membrane+Permeabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Single-Vesicle Detection and Analysis of Peptide-Induced Membrane Permeabilization.</a> Langmuir. 31 (8), 2472-2483 (2015).</li>
<li>Christensen, S. M., Bolinger, P. Y., Hatzakis, N. S., Mortensen, M. W., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixing+subattolitre+volumes+in+a+quantitative+and+highly+parallel+manner+with+soft+matter+nanofluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Mixing subattolitre volumes in a quantitative and highly parallel manner with soft matter nanofluidics.</a> Nature Nanotechnology. 7 (1), 51-55 (2012).</li>
<li>Eliasen, R., Andresen, T. L., Larsen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PEG-Lipid+Post+Insertion+into+Drug+Delivery+Liposomes+Quantified+at+the+Single+Liposome+Level%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials+Interfaces%22%5BJournal%5D)">PEG-Lipid Post Insertion into Drug Delivery Liposomes Quantified at the Single Liposome Level.</a> Advanced Materials Interfaces. 6 (9), 1801807(2019).</li>
<li>Münter, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+fluorescently+labeled+lipids+from+liposomes+in+biological+environments+challenges+the+interpretation+of+uptake+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Dissociation of fluorescently labeled lipids from liposomes in biological environments challenges the interpretation of uptake studies.</a> Nanoscale. 10 (48), 22720-22724 (2018).</li>
<li>Traikia, M., Warschawski, D. E., Recouvreur, M., Cartaud, J., Devaux, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+unilamellar+vesicles+by+repetitive+freeze-thaw+cycles%3A+characterization+by+electron+microscope+and+P-31-nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal+with+Biophysics+Letters%22%5BJournal%5D)">Formation of unilamellar vesicles by repetitive freeze-thaw cycles: characterization by electron microscope and P-31-nuclear magnetic resonance.</a> European Biophysics Journal with Biophysics Letters. 29 (3), 184-195 (2000).</li>
<li>Nele, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Formulation+Method%2C+Lipid+Composition%2C+and+PEGylation+on+Vesicle+Lamellarity%3A+A+Small-Angle+Neutron+Scattering+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Effect of Formulation Method, Lipid Composition, and PEGylation on Vesicle Lamellarity: A Small-Angle Neutron Scattering Study.</a> Langmuir. 35 (18), 6064-6074 (2019).</li>
<li>Kunding, A. H., Mortensen, M. W., Christensen, S. M., Stamou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-based+technique+to+construct+size+distributions+from+single-object+measurements%3A+Application+to+the+extrusion+of+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-based technique to construct size distributions from single-object measurements: Application to the extrusion of lipid vesicles.</a> Biophysical Journal. 95 (3), 1176-1188 (2008).</li>
<li>Hughes, L. D., Rawle, R. J., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choose+Your+Label+Wisely%3A+Water-Soluble+Fluorophores+Often+Interact+with+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Choose Your Label Wisely: Water-Soluble Fluorophores Often Interact with Lipid Bilayers.</a> PLoS One. 9 (2), e87649(2014).</li>
</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

単一のリポソームアッセイを使用して個々のリポソーム間の組成不均質性を研究する方法を詳細に説明することは重要ですが、プラットフォームは非常に汎用性があります。導入で既に示したように、このプロトコルは、膜膜融合、タンパク質膜相互作用、またはリポソーム薬物担体特性評価の側面を研究するために容易に適応することができる。取り組まれている科学的な質問については、単一のリポソームアッセイの力は、アンサンブルの個々の成分を検出する能力にあり、したがって、アンサンブル平均効果によって偏らない定量的な読み出しを有する。
単一リポソームアッセイは、全内部反射や共焦点顕微鏡などの表面イメージングモダリティに最適に適し、Z方向の断面により、リポソーム層の上の溶液から不要な背景蛍光を排除できます。しかし、この側面は、ペプチド、タンパク質、または他のリポソームなどの蛍光標識化合物が溶液に添加され、イメージング中にそこに残る研究において最も重要です。例えば、ここで詳しく説明する形式でアッセイを使用する場合、蛍光色素が固定化されたリポソームに制限されている場合、アッセイは原則として、より広く利用可能な広視野顕微鏡を...

リポソームは、基礎研究と応用研究の両方で頻繁に使用されている球状リン脂質ベースの小胞です。それらは優れた膜モデルシステムとして機能し、その生理化学的性質は、リポソーム1、2を構成する脂質成分を変化させることによって容易に操作することができるのでである。また、リポソームは、最も使用される薬物送達ナノキャリアシステムを構成し、改善された薬物動態および薬力学ならびに高い生体適合性3を提供する。
長年にわたり、リポソームは主にバルク技術を使用して研究され、アンサンブル平均読み出し値にのみアクセスを与えてきました。これは、アンサンブル内のすべてのリポソームが同一であると仮定するために、これらの研究の大半を導いています。ただし、このようなアンサンブル平均値は、基になるデータセットが平均値の周りに均一に分布している場合にのみ正しいですが、データセットに複数の独立した母集団が含まれている場合など、誤った偏った結論を表すことができます。さらに、集団全体を表すアンサンブル平均を仮定すると、リポソーム間の不均一性の中で収容される情報を見落とすことができます。最近になってようやく単一のリポソームをプローブできる定量アッセイが出現し、リポソームサイズ4、脂質組成5、6、および封入効率7を含む重要な物理化学的性質に関して個々のリポソーム間の大きな不均一性を明らかにし、単一のリポソームレベルでリポソームを研究することの重要性を強調した。
リポソーム特性のアンサンブル平均がバイアス結果に示されている研究領域は、リポソームサイズ依存性タンパク質膜相互作用8、9を研究している。伝統的に、このようなプロセスを研究している研究者は、異なる細孔サイズ9を有するフィルターを通して押し出すことによって、異なるアンサンブル平均直径を有するリポソームを調製することに制限されてきました。しかしながら、単一リポソームアッセイを用いて個々のリポソームの直径を抽出すると、大きな集団の重複が明らかになり、リポソームは100nmおよび200nmフィルタを用いて押し出され、そのサイズ分布4において最大70%の重なりを示す。これは、リポソームサイズ依存性タンパク質膜相互作用10のバルク測定に大きく偏る可能性がある。単一のリポソームアッセイを用いて膜タンパク質相互作用研究を行い、研究者は代わりにサンプル内のサイズ多分散性を利用し、各実験内で広範囲のリポソーム直径を研究することができ、膜曲率および組成物が膜4、11、12にタンパク質のリクルートにどのように影響するかを新たに発見することを容易にした。単一リポソームアッセイの適用が実証された別の分野は、タンパク質媒介膜融合13、14の機械的研究である。このような運動学的測定では、個々の融合イベントを研究する能力により、融合プロセスの実験的同期の必要性が緩和され、バルクアンサンブル測定で行われた時空間平均で失われた新しい機械的洞察が可能になります。さらに、単一のリポソームは、膜足場として使用され、個々のタンパク質の測定を可能にし、膜貫通タンパク質構造ダイナミクス15、16に関する新しい知識を提供する。さらに、このようなプロテオオリポソームベースのセットアップにより、個々の膜貫通トランスポーター17および細孔形成タンパク質複合体18の機能ならびに生理活性膜透過性ペプチド19の機構を研究することができた。単一リポソームはまた、10−19Lの容積における酵素反応のためのチャンバーとして機能する表面固定化単一リポソームを有する軟質物質ナノ流体剤として使用されており、最小限の製品消費量20でスクリーニングアッセイのスループットおよび複雑さを増加させる。
近年、単一のリポソームアッセイは、以前は先行した詳細レベルでの薬物送達リポソームの特徴付けに用いられている。研究者は、個々のリポソーム21の表面に付着したポリマーの量において有意な不均一性を定量することができた。単一のリポソームアッセイはまた、血漿などの複雑な媒体における薬物送達リポソームの測定を可能にし、脂質アンカーを介してリポソーム表面に固定された元素が生体内循環22中に経験したものを模倣する条件にさらされると解離しやすいことを明らかにした。全体として、単一のリポソームアッセイの汎用性と有用性は、これらのセットアップが取り組むために採用されてきた多種多様な問題によって実証されており、方法論は引き続き開発され、新しい科学分野での使用を見つけることを想定しています。
ここでは、個々のリポソームを高スループットで研究することを可能にする蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイについて説明する(図1)。この方法を説明するために、アンサンブル内の個々のリポソーム間のサイズと組成の不均一性を定量化するために使用します。アッセイは、不動態ガラス表面に固定化された単一リポソームの蛍光顕微鏡イメージングを採用している。まず、適切な蛍光リポソーム標識と固定化を保証するリポソーム製造プロセスにおける重要なステップについて説明します。次に、適切なリポソーム表面密度を確保するための手順を概説する前に、リポソーム固定化を容易にするために必要な表面調製物について説明する。高品質の画像を取得するために重要な顕微鏡パラメータについて議論し、簡単なデータ分析を行う方法を説明し、リポソームサイズと組成不均一性の抽出を可能にします。この一般的なプロトコルは、興味のある研究者が彼または彼女の特定の研究の関心のためにさらにアッセイを開発するための良い基礎を提供する必要があります。

<table><tbody><tr><td>8ウェル顕微鏡スライド(&マイクロ;スライド)</td><td>同上</td><td>80827</td><td>ガラス底付き顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>Avanti Mini 押出キット</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td>消耗品(Whatmanフィルター)は、GEヘルスケアBSA</td></tr><tr><td></td><td>シグマ</td><td>A9418BSA</td><td></td></tr><tr><td>-ビオチン</td><td>シグマ</td><td>A8549</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Avanti Polarから取得できますLipids</td><td>700000</td><td>Traded trough Sigma</td></tr><tr><td>Computer with FIJI (Fiji Is Just ImageJ)</td><td></td><td></td><td>ComDet プラグインがインストールされている必要があります。また、データをプロットするには、.txtファイルを読み込めるデータ処理ソフトウェア(Excel、MatLab、OpenOffice、GraphPad Prismなど)が必要になります</td></tr><tr><td>DOPE-Atto488</td><td>Atto-Tech</td><td>AD488-165</td><td></td></tr><tr><td>DOPE-Atto655</td><td>Atto-Tech</td><td>AD655-165</td><td></td></tr><tr><td>DOPE-PEG-Biotin</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>880129</td><td>Traded trough Sigma</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma</td><td>S-6021</td><td></td></tr><tr><td>Labogene</td> Glassバイアル<td>のScanVac Coolsafeなどの</td>凍結乾燥機 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ブラウンクロマトグラフィー</td><td>150903</td><td>液体窒素中のスナップ凍結に耐えることができるガラスバイアル。バイアルの8 mLバージョンは、押出キット</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Honeywell Fluka</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Heatingバス</td><td></td><td></td>のシリンジにも適合するサイズを持っています<td>。</td></tr><tr><td>C マグネット攪拌</td><td></td><td></td>式加熱プレート <td>最小65°Cまで加熱可能。C</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Σ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>液体窒素</td><td></td><td></td><td>ゴムバス</td></tr><tr><td>磁気攪拌バー</td><td>VWR</td><td>442-4520 (EU)</td><td></td></tr> <tr><td>微量遠心チューブ 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 120.086 (EU)</td><td></td></tr> <tr><td>顕微鏡</td><td></td><td></td><td>このプロトコルの画像には、ライカSP5共焦点顕微鏡があります使用されている</td></tr><tr><td>Na HEPES</td><td>Σ</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Σ</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Honeywell Fluka</td><td>71686</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td>850457 Σ Σ</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Σ</td><td>S4762</td><td></td></tr><tr><td>tert-Butanol (2-methyl-2-propanol)</td><td>Honeywell Riedel-de Ha&euml;n</td><td>24127</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td></td><td></td><td>例:MilliQ</td></tr></tbody></table>

個々のリポソーム間の組成不均一性を検出するための定量的蛍光顕微鏡ベースの単一リポソームアッセイ

A Quantitative Fluorescence Microscopy-based Single Liposome Assay for Detecting the Compositional Inhomogeneity Between Individual Liposomes

膜モデルシステムまたは薬物送達キャリアとしてリポソームを採用するほとんどの研究は、バルク読み出し技術に依存しているため、本質的にアンサンブルのすべてのリポソームが同一であると仮定します。しかし、単粒子レベルでリポソームを観察できる新しい実験プラットフォームにより、個々のリポソームに対するタンパク質膜相互作用または薬物担体特性に関する高度かつ定量的な研究を行うことが可能となり、したがって、アンサンブル平均からエラーを回避します。ここでは、蛍光ベースの顕微鏡アッセイを用いて単一リポソームを調製、検出、分析し、単粒子測定などを容易にするプロトコルを紹介する。セットアップは、大規模な並列方法で個々のリポソームをイメージングすることを可能にし、サンプル内のサイズと組成の不均一性を明らかにするために使用されます。さらに、このプロトコルは、単一のリポソームレベルでリポソームを研究することの利点、アッセイの限界、および他の研究問題を研究するためにそれを変更する際に考慮すべき重要な特徴を記述する。

説明したプロトコルに従うと、単一のリポソームを大規模な並列的に画像化することが可能になります(図1)。リポソームの表面固定化が成功すると、リポソーム溶液をチャンバに添加した直後に明らかにされるべきである(プロトコルではステップ3.6)、回折限りの強度スポットが画像に現れるはずです(図1Bおよび図1C)。
良好な統計を達成し、アッセイの高スループット能力を利用するために、数千のリポソームを画像化する必要があります。合理的な数の画像でこれを行うには、フレームあたり300-400リポソームの密度を達成するのに十分なリポソームを固定化することをお勧めします。密度を低くするとデータ解析に時間がかかり、密度が高いほど画像...

このプロトコルは、リポソームの作製と、蛍光顕微鏡を用いて表面上に固定化し、個々に画像化する方法について説明します。これにより、集団の単一リポソーム間のサイズおよび組成不均一性の定量が可能になる。

Most research employing liposomes as membrane model systems or drug delivery carriers relies on bulk read-out techniques and thus intrinsically assumes ...

リポソームを用いたほとんどの研究は、本質的にすべてのリポソームが同一であると仮定する大胆な技術に依存しています。単一のリポソームを研究することによって、有意な不均一性が観察され得る。ここで紹介する単一のリポソーム技術は、我々は同時にリポソームの数百を研究し、そのサイズと組成の不均一性を検出することができます。この方法は、タンパク質膜相互作用などの単一のリポソームレベルで他のシステムを研究するように容易に調整することができる。必要なのは、蛍光標識を受けるために研究する化合物です。このビデオでは、研究者が単一のリポソーム研究を行う方法に関するツールを提供します。アッセイを簡単に修正して、他の科学的なトピックの範囲を研究できることを願っています。まず、準備された脂質ストック138マイクロリットルのPOPCと120マイクロリットルのコレステロールを新鮮なガラスバイアルに混ぜます。次に、蛍光標識脂質2個とDSPE-PEGビオチン50マイクロリットルをそれぞれ500マイクロリットル加えます。ガラスバイアルの蓋を緩め、1〜2分間液体窒素でバイアルを凍結します。凍結した脂質混合物を凍結乾燥機で一晩凍結乾燥して凍結乾燥する。朝、乾燥した脂質に200ミリモルDソルビトールバッファーの1ミリリットルを追加します。混合物を摂氏45度に加熱し、少なくとも1時間磁気攪拌にさらします。次に、バイアルを液体窒素に浸して脂質懸濁液を凍結し、懸濁液が完全に凍結するまで待つ。次に、冷凍懸濁液を冷暖房浴で55°Cで完全に解凍するまで浸します。混合物を合計 11 回の凍結融解サイクルに公開します。その後、ミニ押出キットを使用して、リポソーム懸濁液を800ナノメートルポリカーボネートフィルターを通して一度押し出す。BSAビオチンの1、200マイクロリットルおよび120マイクロリットルを混合する。8ウェルスライドで各ウェルに300マイクロリットルの混合物を加え、室温で20分間インキュベートします。わずかにスライドを傾け、各の端から培地を吸引します。速やかに300マイクロリットルのHEPESバッファーを各ウェルに加えて洗浄します。各井戸を全部で8回洗います。ストレプトアビジンを250マイクロリットル加え、室温で10分間インキュベートします。前述のとおり、8回の打ち上がを繰り返します。スライドを顕微鏡に置き、顕微鏡ジョイスティックを調整してチャンバーの表面に焦点を合わせます。これは、ガラスバッファインターフェースからの増加したレーザー反射信号をガイドとして使用して簡単に行うことができます。マイクロ遠心チューブに、20マイクロモル全脂質を含む希釈リポソームストックの10マイクロリットルを加える。100マイクロリットルのバッファーをチャンバからマイクロ遠心チューブに移し、適切に混合し、110マイクロリットルをチャンバーに戻します。チャンバーを顕微鏡の下に置き、リポソームフルオロフォアからの信号を検出できる初歩的な顕微鏡設定を使用して、表面に固定化されているリポソームを観察する。原稿に記載されているように顕微鏡を設置します。リポソーム内のドープATTO488とDOPE ATTO655フルオロフォアの両方を画像化するには、複数のチャンネルを画像化します。クロス励起を避けるために、各チャンネルが連続してイメージ化されていることを確認します。例えば、最初に488ナノメートルで励起し、495〜590ナノメートルで発光を読み取ることによって1つの画像を撮ります。その後、設定を変更し、633ナノメートルでエキサイティングな別の画像を撮るが、660〜710ナノメートルでのみ発光を読み取る。分析。画像メニューでカラーを選択し、マージチャネル機能を使用して2つのチャンネルの合成を作成します。2つの異なるチャンネルで画像化されたリポソームが良好な共局在化を示しているか、可視ドリフトが発生したかどうかを確認します。パーティクルを検出するには、プラグインメニューを開き、「ComDet」を選択して「パーティクルを検出」をクリックします。ComDet で、設定が正しいことを確認し、[OK] をクリックします。解析を実行した後、結果と概要を表示する 2 つのポップアップ ウィンドウ。結果表には、2 つのチャンネル間の強度比が含まれています。共ローカリゼーション データを含むデータ テーブルの結果をエクスポートします。強度比ヒストグラムをガウス関数でフィットさせ、平均と標準偏差を抽出します。平均と標準偏差は、不均一性の程度を計算するために使用することができます。50ナノメートルフィルターを介して数回押し出されたリポソーム製剤を調製する。蛍光強度とDLSからのサイズデータを比較することにより、リポソームのサイズを較正します。以前と同じ実験顕微鏡設定で、キャリブレーションリポソームを画像化します。キャリブレーションリポソームの蛍光強度の平方根強度ヒストグラムをプロットする。ヒストグラムを対数正規分布に適合させ、キャリブレーションリポソームの平均蛍光強度を幾何平均として抽出します。平方根強度とリポソームサイズの関係を求めるには、動的光散乱測定から得られた平均リポソーム径を平方根強度の幾何平均で割って補正係数を算出する。組成不均一性実験でリポソームの平方根強度値を計算し、補正係数を掛けてこれらの2つの直径を変換します。リポソームの組成不均一性の直径の関数として強度比値をプロットし、およそ50ナノメートルから800ナノメートルに及ぶリポソームの集団に対するリポソームサイズの関数として不均一性を達成する。このプロトコルにおいて、リポソームの表面固定化が成功したのは、回折限度合いのスポットによって示されるチャンバへのリポソーム溶液の添加時にすぐに明らかであった。フレームあたり300〜400リポソームの密度を達成するのに十分なリポソームを固定することをお勧めします。密度が低いとデータ分析に時間がかかり、密度が高いと単一のリポソームを区別するのが難しくなります。視野全体が適切に焦点を合わせていない場合は、サンプルプレートが傾いている可能性があります。また、リポソームが大きく、ぼやけているように見える場合、これはチャンバー内の緩衝液が蒸発し、表面が乾燥している可能性があることを示している。強度比ヒストグラムは、通常、平均比値の周りのガウス分布を明らかにします。ガウス分布からの強い偏差が観察された場合、それは弱いシグナルを示すリポソームのサブセットが除外されたことを示唆する検出感度の問題を示している。強度比ヒストグラムをガウス関数でフィッティングした後、不均質度値0.23の程度は、アンサンブルの平均モル比から23%以上異なる人口の32%に翻訳された。実験の不確実性の定量化は0.1であることが判明した。アッセイは、高品質のユニラミナルリポソームが不可欠であるため、使用する材料よりも良くなることはありません。したがって、これらを準備するときは、フリーズ解凍サイクルを残すなどのコーナーをカットしないでください。貧弱な画像は、高い実験の不確実性をリードし、不均質性を過大評価させるので、時間をかけて焦点を合わせる画像を取得します。アッセイが基本的に行うことは、蛍光標識の表面密度を研究することです。この蛍光標識がパーコレート脂質上にある場合、このアッセイは、薬物送達のためのリポソームの品質検査に使用することができる。セットアップは、ペプチドが膜に結合し、曲率を感知する方法を研究するために適用されています。これは、研究者にペプチドが細胞内でソートされる方法を支配する分子手がかりにユニークな洞察を与えました。

a-quantitative-fluorescence-microscopy-based-single-liposome-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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