Name: 角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学ぶ Nd:YAGレーザーを用いた角膜内皮細胞剥離法により、水疱性角膜症の早期病態モデルを構築する手法です。豚眼を用いた非侵襲的アプローチで、細胞動態の理解と新規治療開発に貢献します。

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クリスティーン・オリュンとヤン・A・M・ソチュレックの実験方法に対する支援に感謝します。

動物組織に関するすべての手順は、地元の動物管理倫理委員会のガイドラインに従います。
1. 臓器培養とレーザー治療の準備
<ol><li>地元のアバトワールから新鮮なブタの目を得る。Lグルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン(1%)、血清(10%)を添加した高グルコースを有するダルベックコの改変Eagle培地(DMEM)で冷却(4°C)を保ち、今後この記事ではフル培地と呼ばれる。</li>
	<li>はさみで細胞外組織を取り除き、5%ポビドネヨウ素眼球溶液に目を浸し、使用するまで殺菌されたリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に入れます。</li>
	<li>角膜瘢痕化、浮腫、およびスペクトル領域光学コヒーレンス断層撮影装置を有する他の不透明度などの主要な前部セグメント病理のためのスクリーン目 (材料表)</li>
	<li>波長1,064nm、焦点の直径10μmのNd:YAGレーザー(材料表)を搭載したスリットランプユニットの前に目を置きます。 注:最適な位置に3Dプリント保持装置が使用され、眼をしっかりと保持するように設計されており、あまり圧力をかけない(図1)。</li>
	<li>12xの倍率を使用し、個々の角膜層を視覚化するために照明をそらす。</li>
	<li>内皮細胞の選択的切り出しのためにパルスエネルギー(例えば、1.6 mJ)とフォーカスポイント(例えば、0.16mm)を設定します。</li>
	<li>手足の近くに透明な角膜パラセンテーゼを置き、前房を安定させるために粘弾性(材料表)を注入します。</li>
	<li>レーザー処理された中央角膜を8mmトレフィンで物品切りする。</li>
	<li>切除した角膜を12ウェルプレートのウェルに入れ、内皮部位を上向きにして、37°Cのフル培地で3mLで最大3日間培養します。 注: 潜在的な細胞保護剤は、このステップ中に培地に添加することができます。</li>
</ol>2. ヒストロジーの準備
<ol><li>19.6 mL の 19.6 mL 133 mM KH2PO4および 80.4 mL の 133 mM Na2HPO4を含む 7.4 の pH でソレンセンのバッファーを準備します。</li>
	<li>角膜含有ウェルから培地を取り出し、メタノールフリーパラホルムアルデヒド(4%)を使用して室温(RT)で20分間組織を固定するソレンセンのバッファに入っています。</li>
	<li>組織が沈むまでPBSで20%スクロースに組織を入れ(1時間)、次いでRTで一晩PBSで30%スクロースに組織を入れる。気泡や空気表面の界面との接触を避けるように注意してください。最適な切断温度(OCT)化合物に組織を埋め込み、-80 °Cで保存します。</li>
	<li>-27°Cのクライオスタットを使用して、厚さ10μmのセクションをカットします。 注意:ラクダのヘアブラシは、ナイフブレードの上に新興セクションを導くのに役立ちます。</li>
	<li>切削した1分以内にスライドを組織に触れ、組織の凍結乾燥を避けて、切り落としを行い、切り替え用のスライドに切り替えます。スライドは-80°Cで保管してください。</li>
</ol>3. ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色
<ol><li>空気乾燥した切片は、湿気を除去するために数分間乾燥します。</li>
	<li>50 mLチューブで10分間、0.1%マイヤーヘマトキシリンを濾過したステイン。</li>
	<li>コプリンの瓶では、クールランニングddH2Oで5分間リンスし、0.5%のエオシン10倍に浸します。</li>
	<li>eosinがストリーキングを停止するまでddH2Oに浸し、50%(10倍)と70%(10倍)のEtOHに浸します。</li>
	<li>エチレンに数回浸漬する前に95%EtOH(30 s)および100%EtOH(60 s)で平衡化する。</li>
	<li>最後に、光顕微鏡を使用して画像を撮る前に、標本を取り付け、カバースリップします。</li>
</ol>

<ol><li>DelMonte, D. W., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+physiology+of+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cataract+and+Refractive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Anatomy and physiology of the cornea.</a> Journal of Cataract and Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).</li>
<li>Edelhauser, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+balance+between+corneal+transparency+and+edema%3A+the+Proctor+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The balance between corneal transparency and edema: the Proctor Lecture.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (5), 1754-1767 (2006).</li>
<li>Tuft, S. J., Coster, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corneal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The corneal endothelium.</a> Eye. 4, London, England. Pt 3 389-424 (1990).</li>
<li>Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+the+corneal+endothelium+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Biology of the corneal endothelium in health and disease.</a> Eye. 17, 912-918 (2003).</li>
<li>He, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+map+of+the+human+corneal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3D map of the human corneal endothelial cell.</a> Scientific Reports. 6, 29047(2016).</li>
<li>Gain, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Survey+of+Corneal+Transplantation+and+Eye+Banking%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking.</a> JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).</li>
<li>Schwartzkopff, J., Bredow, L., Mahlenbrey, S., Boehringer, D., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelium+following+complete+endothelial+cell+loss+in+rat+keratoplasty%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelium following complete endothelial cell loss in rat keratoplasty.</a> Molecular Vision. 16, 2368-2375 (2010).</li>
<li>Bredow, L., Schwartzkopff, J., Reinhard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+corneal+endothelial+cells+following+keratoplasty+in+rats+with+bullous+keratopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Regeneration of corneal endothelial cells following keratoplasty in rats with bullous keratopathy.</a> Molecular Vision. 20, 683-690 (2014).</li>
<li>Bartakova, A., Kunzevitzky, N. J., Goldberg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Cell+Therapy+for+Corneal+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Ophthalmology+Reports%22%5BJournal%5D)">Regenerative Cell Therapy for Corneal Endothelium.</a> Current Ophthalmology Reports. 2 (3), 81-90 (2014).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+organ+culture+model+for+corneal+wound+healing+and+corneal+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional organ culture model for corneal wound healing and corneal transplantation.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (7), 2840-2846 (2006).</li>
<li>Aron-Rosa, D., Aron, J. J., Griesemann, M., Thyzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+neodymium-YAG+laser+to+open+the+posterior+capsule+after+lens+implant+surgery%3A+a+preliminary+report%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+-+American+Intra-Ocular+Implant+Society%22%5BJournal%5D)">Use of the neodymium-YAG laser to open the posterior capsule after lens implant surgery: a preliminary report.</a> Journal - American Intra-Ocular Implant Society. 6 (4), 352-354 (1980).</li>
<li>Vogel, A., Hentschel, W., Holzfuss, J., Lauterborn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cavitation+bubble+dynamics+and+acoustic+transient+generation+in+ocular+surgery+with+pulsed+neodymium%3A+YAG+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Cavitation bubble dynamics and acoustic transient generation in ocular surgery with pulsed neodymium: YAG lasers.</a> Ophthalmology. 93 (10), 1259-1269 (1986).</li>
<li>Vogel, A., Schweiger, P., Frieser, A., Asiyo, M. N., Birngruber, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Nd%3AYAG+laser+surgery%3A+laser-tissue+interaction%2C+damage+range%2C+and+reduction+of+collateral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Journal+of+Quantum+Electronics%22%5BJournal%5D)">Intraocular Nd:YAG laser surgery: laser-tissue interaction, damage range, and reduction of collateral effects.</a> IEEE Journal of Quantum Electronics. 26 (12), 2240-2260 (1990).</li>
<li>Zhu, Q., Zhu, Y., Tighe, S., Liu, Y., Hu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Engineering of Human Corneal Endothelial Cells In Vitro.</a> International Journal of Medical Sciences. 16 (4), 507-512 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotinamide+inhibits+corneal+endothelial+mesenchymal+transition+and+accelerates+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Nicotinamide inhibits corneal endothelial mesenchymal transition and accelerates wound healing.</a> Experimental Eye Research. 184, 227-233 (2019).</li>
<li>Pescina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+convenient+ex+vivo+model+for+the+study+of+the+transcorneal+permeation+of+drugs%3A+histological+and+permeability+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Development of a convenient ex vivo model for the study of the transcorneal permeation of drugs: histological and permeability evaluation.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (1), 63-71 (2015).</li>
<li>Smeringaiova, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+Wound+Repair+of+the+Organ-Cultured+Porcine+Corneas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Endothelial Wound Repair of the Organ-Cultured Porcine Corneas.</a> Current Eye Research. 43 (7), 856-865 (2018).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rabbit+Corneal+Endothelial+Dysfunction+Model+Using+Endothelial-Mesenchymal+Transformed+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rabbit Corneal Endothelial Dysfunction Model Using Endothelial-Mesenchymal Transformed Cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16868(2018).</li>
<li>Schubert, H. D., Trokel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+repair+following+Nd%3AYAG+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelial repair following Nd:YAG laser injury.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 25 (8), 971-976 (1984).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+Model+of+Corneal+Endothelial+Injury+Established+Using+the+Nd%3A+YAG+Laser%5BTitle%5D)+AND+%22Cornea%22%5BJournal%5D)">Rabbit Model of Corneal Endothelial Injury Established Using the Nd: YAG Laser.</a> Cornea. 36 (10), 1274-1281 (2017).</li>
<li>McCally, R. L., Bonney-Ray, J., de la Cruz, Z., Green, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+endothelial+injury+thresholds+for+exposures+to+1.54+micro+m+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Physics%22%5BJournal%5D)">Corneal endothelial injury thresholds for exposures to 1.54 micro m radiation.</a> Health Physics. 92 (3), 205-211 (2007).</li>
<li>Nash, J. P., Wickham, M. G., Binder, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corneal+damage+following+focal+laser+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Corneal damage following focal laser intervention.</a> Experimental Eye Research. 26 (6), 641-650 (1978).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

この試験試験研究の結果は、エネルギー線量および焦点点位置に適切なパラメータが選択された場合に、Nd:YAGレーザーを使用して角膜内皮細胞を選択的にアブレートできることを示している。
内皮機能は角膜の透明性と角膜浮腫からの保護にとって重要であるため、内皮機能不全のモデルは抗浮腫薬または外科的処置の開発において重要な役割を果たす。インビボシチュエーション,10、14、15,14を模倣するためのいくつかの確立されたインビトロモデルがありますが、一般的に知られているように、in vitroモデルは酵素およびサイトカインの影響または細胞細胞相互作用の影響を完全に模倣することはできません。15対照的に、この新しく開発された内皮細胞喪失のex vivoモデルは、自然環境における疾患および角膜脱代償の異なる状態を監視する可能性を提供する。
我々のモデルの角膜...

角膜の透明性は、光をレティナおよびその光受容体1に伝達するために不可欠である。この点に関して、脱水の相対的な状態は、角膜間質内のコラーゲン線維を正しく整列させるために重要である。この恒常性は、デセメットの膜(DM)2に位置する角膜内皮細胞(CEC)によって維持される。内皮は最も内側の角膜層である。それは重要な障壁およびポンプ機能を有し、角膜の透明性3にとって極めて重要である。上皮とは対照的に、内皮は自己更新できない4.したがって、疾患または外傷によって引き起こされる細胞損傷は、残りの内皮細胞を刺激して拡大および移動し、生じる欠陥をカバーし、角膜機能を維持する5。しかし、CEC密度が臨界閾値を下回ると、内皮の代償不全が浮腫につながり、視力がぼやけ、不快感や重度の痛み4を生じる。症状を緩和する薬剤が利用可能であるにもかかわらず、現在、これらの症例における唯一の決定的な治療法は角膜移植であり、これは全厚移植片または薄膜内皮移植の形で行うことができる。後者の手順は、デシェメットの膜内皮角膜形成術(DMEK)ならびにデスセメットのストリッピング自動内皮角膜形成術(DSAEK)6として利用可能である。6しかし、残りのCECの保護とその生存率の向上は、潜在的な治療薬をテストするのに十分な疾患モデルを必要とする代替ターゲットとなり得る。
現在のCEC損失疾患モデルは、前房への毒性物質(例えば、塩化ベンザルコニウム)の注入を介した内皮の破壊に焦点を当てるか、侵襲的なデセメトヘキシス法77,88を用いて細胞の機械的摩耗によって。これらのモデルは十分に確立されていますが、一般的な炎症反応や不正確な担保損傷などの欠点があります。したがって、これらのモデルは、上記の外科的選択肢が避けられない場合に、疾患の最終段階を表す可能性が高い。
幹細胞や遺伝子治療などの細胞治療戦略の進歩に伴い、これらの細胞療法の適用はCEC損失9の初期段階で有用であり得る。その後、これらの疾患の初期段階をより適切に表すモデルが必要です。この点で、細胞培養モデルは過去10年間で改善されたが、インビトロの細胞が角膜10内の異なる細胞型間で起こる複雑な相互作用を複製することに近づくことができないため、その有効性は依然として制限されている。したがって、ex vivoおよびin vivo疾患モデルは依然として高い需要があり、既存のものを改善することは最大の関心事です。
ネオジムを用いた光破壊による非侵襲的な眼内手術:YAG(Nd:YAG)レーザーは、1970年代後半11年に導入されて以来、世界中の眼科医にとって日常的な処置となっている。光破壊は、液体環境12に位置する場合は常に、プラズマの形成、音響衝撃波の発生、およびキャビテーション気泡の生成につながる非線形光吸収に依存する。一般に、これらのプロセスは、正確な組織切断の意図された効果に寄与する。しかし、それらはまた、レーザー手術13の局所的な閉じ込めを制限する不必要な担保損傷の源であり得る。
衝撃波伝搬とキャビテーションコースの特性評価により、機械的効果の予測が大幅に向上しました。私たちの目標は、CECの損失の初期段階のための非侵襲的な、レーザー支援実験疾患モデルを提供するために、周囲の組織への損傷をできるだけ少なくしてCECを標的にすることです。そのためには、レーザーの焦点スポットの最適なパルスエネルギーと位置を決定する必要があります。

<table><tbody><tr><td>バロン真空トレフィン</td><td>カテナ</td><td>K20-2058</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM 3050S</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'のモディファイドイーグル」s 中高血糖</td><td>PAA</td><td>E-15009</td><td></td></tr><tr><td>アイホルダー</td><td>セルフ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMI 6000 B</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>529568</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Merck</td><td>1065860500</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG レーザー</td><td>Zeiss Meditec</td><td>visuLAS YAG II plus</td><td></td></tr><tr><td>OCT Tissue Tek</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td></td></tr><tr><td>豚血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12736C</td><td></td></tr><tr><td>スペクトル領域光干渉断層撮影装置</td><td>Heidelberg Engineering</td><td>Spectralis</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート 12ウェル</td><td>Sarstedt</td><td>833921</td><td></td></tr><tr><td>2 光子顕微鏡</td><td>JenLab</td><td>DermaInspect</td><td></td></tr><tr><td>粘弾性</td><td>OmniVision</td><td>Methocel</td><td></td></tr></tbody></table>

角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発

Development of a Noninvasive, Laser-Assisted Experimental Model of Corneal Endothelial Cell Loss

Nd:YAGレーザーは、数十年前からカプロートミーなどの非侵襲的な眼内手術を行うために使用されてきました。切開効果は、レーザーフォーカスでの光学的破壊に依存します。音響衝撃波とキャビテーション気泡が発生し、組織が破裂する原因となります。バブルサイズと圧力振幅は、パルスエネルギーと焦点の位置によって変化します。本研究では、生核ブタの目を市販のNd:YAGレーザーの前に配置した。可変パルスエネルギーならびに角膜後方の焦点スポットの異なる位置が試験された。結果として生じる病変を2光子顕微鏡および組織学によって評価し、最小の副次的損傷を伴う角膜内皮細胞(CEC)の排他的剥離に対する最良のパラメータを決定した。この方法の利点は、CECの正確な切り取り、担保損傷の減少、そして何よりも非接触治療です。

ここで示した手順を用いて、Nd:YAGレーザーで眼を処理し、異なるパルスエネルギー(1.0-4.6 mJ)と焦点の位置(角膜後面からの距離:0.0-0.2mm)を評価し、最適なパラメータを見つけました。複数の反復(n=3)を、レーザーパラメータの各星座について評価した(12 x 21)。
上記のプロトコルに加えて、試料を、固定およびH&amp;E染色前に2光子顕微鏡で分析した。2光子顕微鏡は、690-1b040 nmのチューニング範囲と800nmの平均レーザ出力&gt;900 mWの固体モードロック80 MHz Ti:サファイアレーザーを光源として使用しました。それはサンプルにおよそ150 fsの幅の脈拍を送達した。画像は、730 nmおよび30 mWのレーザーパワーの波長で顕微鏡目的(20x/0.95)で撮影した。
2光子画像と光顕微鏡画像は、実験設定に目がくらみ、(1)損傷なし、(2)損傷が多すぎる、または(3)適切な損傷量(図2および<strong class=...

ここでは、腫瘍性角質症(BK)のエクスビボ病モデルとして、ネオジム:YAG(Nd:YAG)レーザーを用いて、デセメットの膜(DM)から角膜内皮細胞(CEC)を剥離するプロトコルを提示する。

Nd:YAG lasers have been used to perform noninvasive intraocular surgery, such as capsulotomy for several decades now. The incisive effect relies on the ...

角膜内皮細胞喪失の現在の疾患モデルは、内皮の破壊に焦点を当て、角膜移植が避けられない疾患の最終段階を表す可能性が高い。しかし、幹細胞や遺伝子治療を使用した新しい治療法は、病気の初期段階、欠けているモデルのためにより有用である可能性があります。Nd:YAGレーザーを用いた光破壊による非侵襲的眼内手術は、眼科医にとって日常的な処置となっている。地元のアバトワールから新鮮なブタの目を得た後、サンプルを摂氏4度のフル培地に入れます。はさみを使って細胞外組織を取り除き、5%ポビトンヨウ素眼科溶液に5分間目を浸します。次に、消毒したサンプルを滅菌PBSに室温で置く。スペクトル領域光学コヒーレンス断層撮影装置を使用して、角膜瘢痕、浮腫、およびその他の不透明度などの主要な前部セグメント病理について眼をスクリーニングする。スクリーニング後、波長1,064ナノメートルのレーザーと10マイクロメートルの焦点点直径を備えたスリップランプユニットの前に目を置きます。12倍の倍率を選択し、照明をそらして個々の角膜層を視覚化します。パルスエネルギーとフォーカスポイントを角膜内皮細胞の選択的切り出しに適切なパラメータに設定した後、組織にいくつかのレーザーショットを適用する。次に、解剖顕微鏡の下に、透明な角膜パラセンテーゼを四肢の近くに置き、粘弾性を注入して前房を安定させる。その後、8ミリメートルトレフィンを使用してレーザー処理中央角膜を切除し、単離した角膜を12ウェルプレート内皮側の1つの井戸に入れる。すべての角膜が採取されたら、各サンプルに3ミリメートルのフル培地をよく加え、37°Cで最大3日間培養します。インキュベーションの終了時に、各ウェルの培地をソレンセンの緩衝液中のメタノールフリー4%パラホルムアルデヒドに交換し、室温で20分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、角膜が沈むまで約1時間PBSで20%スクロースに固定サンプルを入れます。サンプルをPBSで一晩30%スクロースに移し、組織をマイナス80°Cで貯蔵するための最適な切断温度に埋め込みます。氷頭をマイナス27度に設定して、取得してから1分以内に顕微鏡スライド上の各セクションを採取する凍結組織の厚さ10マイクロメートルの部分を得ます。その後、スライドを染色するまでマイナス80度で保存します。ヘマトキシリンとエオシン染色の場合、凍結した切片を数分間乾燥させてから、50ミリリットルチューブで10分間濾過した0.1%のメイヤーのヘマトキシリンで染色する前に水分を取り除きます。インキュベーションの終わりに、キュベットでスライドを二重蒸留水で5分間すすぐります。次に、スライドを0.5%eosinに10回浸し、続いて、エオシンがストリーキングを止めるまで二重蒸留水でディップリンスを行います。リンススライドを50%エタノールで10回、70%エタノールで10回浸します。最後の70%エタノールディップ後、95%エタノールで30秒間平衡化し、その後に100%エタノールで60秒後にキシレンで数回浸出する。次に、光顕微鏡で画像を取得する前に、カバースリップで標本を取り付けます。2つの光子顕微鏡画像は、損傷なし、多すぎる損傷、または損傷の正確な量として独立して評価する必要があります。これらの評価に基づいて、ヒートマップを計算して、周囲の組織への損傷を最小限に抑えた角膜内皮細胞の選択的切り落としのためのレーザーパラメータの正しい星座を選択することができます。以前の分析では、レーザーの焦点は、テストされた最も低いパルスエネルギーのために角膜内皮の少なくとも0.15ミリメートル後ろになければならないと判断しました。パルスエネルギーが2.9ミリジュールより高い場合、テストされた最も長い焦点距離はまだ内皮に近すぎます。切除された標本が培養中である間、種々の細胞保護剤を試験することができる。成功した場合、それらは治療のための洗浄液に加えることができる。

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ウシ角膜内皮細胞の初代培養は、角膜内皮間葉移行のメカニズムを調べるために使用しました。さらに、ラット角膜内皮cryoinjuryモデルは、in vivoで角膜内皮間葉移行を示すために使用されました。...

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

次の記事では効果的に輪部幹細胞欠損（LSCD）の持続可能なマウスモデルを作成する簡単な、再現可能な技術を提供します。この動物モデルで試験し、輪部幹細胞疾患の治療の有効性を比較するのに有用です。...

マウスで輪部幹細胞欠損を作成するための単純な機械的手順

マウスのレーザー誘発脈絡膜新生血管の形態学的変化のフォロー...

生体内でマルチ モーダル イメージングとマウス レーザー誘発脈絡膜新生血管モデルの解析

ここでは、ブタ分割角膜ボタンの調製および栽培のためのステップバイステップのプロトコルが提示される。このオルガノ典型的に栽培された臓器培養モデルは、ヒトドナー角膜に匹敵する15日以内の細胞死亡率を示すので、有毒なデキストランを添加することなく非ヒト角膜の長期培養を可能にする最初のモデルを表す。...

分割角膜ボタンを用いてのブタ角膜内皮器培養モデル

デスメのストリッピングのみは、フックス内皮角膜ジストロフィーに起因する中枢角膜ガッタを有する患者が、末梢細胞が内皮層を再生するためにデスメの膜を剥離する実験手順である。我々は、eFGF1(NM141)によって刺激された治癒の促進を伴うジストロフィー性ヒト角膜 エクスビボ におけるDSOをシミュレートする新規方法論を提示する。...

操作された線維芽細胞増殖因子によって刺激された加速治癒を伴うデスメのストリッピングのみのヒト角膜器官培養モデル1

マウスモデルにおけるパンチトレフィン法を用いた角膜および辺縁部のアルカリ損傷誘導

ここでは、角膜を神経支配する感覚線維を損傷する3つの異なる方法を提案します。これらの方法は、マウスの軸索再生の研究を容易にします。これら3つの方法は、他の動物モデルにも適応可能であり、角膜神経支配の生理学と再生の研究に最適です。...

マウス角膜の神経栄養性角膜炎と神経再生を誘導する3つの戦略

学ぶ Nd:YAGレーザーを用いた角膜内皮細胞剥離法により、水疱性角膜症の早期病態モデルを構築する手法です。豚眼を用いた非侵襲的アプローチで、細胞動態の理解と新規治療開発に貢献します。

角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発

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