Name: マウスの好中球の遊走と浸潤の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: 学ぶマウスの好中球遊走と浸潤の検出法。エアポーチアッセイと関節炎モデルを用いて炎症部位での好中球動態を評価し、関節炎や炎症性腸疾患の治療開発への応用可能性を示します。

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この研究は、中国自然科学財団(助成金番号81430099および31500704)、国際協力交流プロジェクト(助成金番号2014DFA32950)、北京中国医学大学の研究プログラム(中国) によって支援されました(補助金番号BUCM-2019-JCRC006および2019-JYB-TD013)。

すべての実験手順は、北京中華医学大学動物ケアおよび使用委員会によって審査され、承認されました.
注:C57BL/6マウス(7〜8週齢)を使用した。
1. 好中球の分離
<ol><li>腹膜滲出細胞の取得<ol>
<li>ddH2Oで新鮮な10%プロテオースペプトン溶液を準備し、マウスの数に応じて必要な量を計算します。 注:マウスの数をN、(2N+1)mLの溶液をあらかじめ溶解し、濾過する必要があります。</li>
		<li>70%エタノールでワークスペースをスプレーします。インスリンインジェクターを使用して、1 mLのペプトン溶液と排出気泡を描画します。</li>
		<li>マウス1回につき1mLのペプトン溶液の最初の腹腔内注射を行う。<ol>
<li>片手でマウスを頭下の位置につかみます。アルコール漬けの綿球で注射スポットを消毒します。 注:好ましい注射位置は、腹部の左下または右象限の側面にあります。</li>
			<li>試薬を迅速に注入する。インスリンインジェクターを使用して各マウスの腹腔に1 mLを注入する。 注:針と皮膚の間の角度は、腸や他の臓器を傷つけられないように、約15〜30°でなければなりません。</li>
		</ol>
</li>
		<li>炎症反応を一晩で発症させる。12時間後、第1の注射と同様に第2の注射を行う。</li>
		<li>2回目の注射の3時間後、ガス麻酔室で5分間5分間のイソフルランを2L/分の速度で完全に麻酔し、麻酔したマウスをチャンバーから取り出し、子宮頸部脱臼によって犠牲にした。 注:十分な深さの麻酔は、マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前につま先をつまむことによって保証される。つま先をつまむときに足は動かないようにする。 注: 以下のすべての手順は、組織培養フードで処理する必要があります。</li>
		<li>マウスに70%エタノールを噴霧する。無菌プラスチックパッドの上にマウスを置き、針で手足を固定します。</li>
		<li>下腹部の真ん中に水平切開(約1cm)を作るために外科用具の無菌セットを使用する。上腹部の皮膚を鉗子で持ち上げ、腹部の正中線に沿って切断し、無傷の腹膜を露出させる。</li>
		<li>30 G x 1/2 インチ針で 5 mL の無菌 RPMI-1640 完全培地を腹腔に注入します。針の縁を上に向けて腹膜を通して針を挿入し、ボリューム全体を注入します。</li>
		<li>パッドを左右に振って5分間、腹部を数回やさしくマッサージします。</li>
		<li>腹部の横のスペースに23 G x 1 1/4インチの針を注入します。腹部の液体(~5mL)を抽出し、50mLの遠心管に回収します。 注:好中球が活性化した場合は、できるだけ早くチューブを氷の上に置きます。</li>
		<li>完全な培地の別の5 mLを注入し、腹皮から残りの細胞を除去するために手順を繰り返す。50 mL遠心管で腹膜液をプールします。</li>
		<li>プールされた腹膜液を室温(RT)で10分間400 x gで遠心します。</li>
		<li>上清を捨てます。RPMI-1640完全培地の1 mLで細胞を再懸濁します。 注:好中球の活性化を避けるために渦を起かないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>好中球の単離<ol>
<li>作製した70.2%濃度勾配培地(例えば、パーコール)の4 mLを15mL遠心管に加える。</li>
		<li>慎重に15 mL遠心管の鋭いピペットの先端と管の端に沿って70.2%の密度勾配媒体に作製した54.8%の密度勾配媒体の4 mLを重ね合わせなさい。 注: 54.8% 密度勾配媒体と 70.2% 密度勾配媒体の間のインターフェースを乱さないように注意してください。</li>
		<li>54.8%密度勾配培地層の上に1mLの腹膜細胞懸濁液を慎重に重ね、鋭利なピペットチップを用いてゆっくりと重ねられます(図1A)。 注: セルサスペンションと54.8%密度勾配媒体との間のインターフェースを乱さないように注意してください。</li>
		<li>1,500 x gでの遠心分離機(ブレーキをかけずに22°Cで30分間)</li>
		<li>54.8% 密度勾配媒体の界面で好中球を集め、70.2% 密度勾配培地層 (図 1B) を新しいチューブに集めます。</li>
		<li>採取した細胞にRPMI-1640完全培地1mLを加え、数回穏やかにピペットで細胞を慎重に再懸濁させる。RTで10分間100xgで遠心分離し、慎重に上清を取り除きます。 </li>
		<li>洗浄手順(ステップ1.2.6)を1回繰り返します。</li>
		<li>ペレットに0.5 mLの培養培地を加え、数回穏やかにピペットで細胞を再懸濁します。50 μLのアリコートを使用して、自動血液分析装置を使用して細胞をカウントします。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 好中球移動アッセイ
<ol><li>トランスウェルアッセイ9またはジグモンドチャンバーアッセイによる好中球移行を、前述の10,11で測定する。</li>
</ol>3. エアポーチアッセイ
<ol><li>初のエアインジェクション<ol>
<li>0日目、ガス麻酔室で3分間のイソフルランを5%のマウスを2L/分の速度で完全に麻酔し、2%のイソフルランを0.5L/分の速度で1回の呼吸単位で各マウスの麻酔を維持する。 注:十分な深さの麻酔は、マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前につま先をつまむことによって保証される。つま先をつまむときに足は動かないようにする。</li>
		<li>5 mLシリンジに取り付けられた0.22μmのフィルターを使用して、3 mLの殺菌空気を得ます。</li>
		<li>麻酔マウスの背中の皮膚をピンセットで持ち上げ、26 G x 3/8インチ針を使用して3 mLの滅菌空気を皮下に注入します。</li>
		<li>治療後、マウスを呼吸ユニットから取り出す。マウスが動き始めるまで、マウスが生きていることを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>第2空気注入<ol>
<li>3日目に、セクション3.1で説明したように、エアポーチを維持するために、以前に確立されたエアポケットに殺菌空気の追加3 mLを注入します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>治療<ol>
<li>6日目、6時間前に、エアポーチに異なる治療を注入する。陰性コントロールとして1 mLのリン酸緩衝生理食塩基(PBS)を注入する。1 μg/mL LPS の 1 mL を、局所炎症を誘発する陽性コントロールとして注入します。</li>
		<li>ガス麻酔室で5%のイソフルランを2L/分の速度で3分間完全に麻酔し、各マウスの麻酔を2%のイソフルランを2%の速度で単一の呼吸単位に維持する。 注:十分な深さの麻酔は、マウスをチャンバーから単一の呼吸ユニットに移動する前につま先をつまむことによって保証される。つま先をつまむときに足は動かないようにする。</li>
		<li>各エアポーチについて、1 mLの洗浄バッファーでエアポーチを洗浄し、15 mL遠心管で炎症性の滲出液を回収します。2 mLの洗浄バッファー2xでエアポーチを洗浄し、同じ遠心管内に炎症性滲出液を回収する。</li>
		<li>RTで10分間100xgで遠心分離し、上清を捨て、1 mLの洗浄バッファーに細胞を再懸濁します。 自動血液分析装置を用いて細胞を数えて好中球比を定量化する。 注 : 図2の代表的な結果を参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. アジュバント誘発性関節炎(AA)マウスモデルの誘導
<ol><li>少なくとも5秒の渦を引くことによってフロイントのアジュバント(CFA)を中断し、インスリンインジェクターに100μLの懸濁液を引き込む。 注:私たちは、無菌性を確保するために実験で完全に新しいCFAを使用することをお勧めします。</li>
	<li>ステップ3.1.1で説明したマウスを麻酔する。</li>
	<li>選択した足にマークを付け、20 μLのCFAを足首の関節空間に注入します。選択した足の4つの関節のスポット(合計で80μL)に20 μLの懸濁液を注入します。</li>
	<li>マウスを呼吸ユニットから取り出し、処理したマウスを新しいチャンバーに入れます。マウスを監視して、動く能力を取り戻すまで呼吸していることを確認します。</li>
	<li>3日毎に、ポケット厚さゲージを用いて足首関節径を測定して関節径を評価する(図3A)。</li>
	<li>3日ごと、関節炎の採点基準により関節炎の重症度を評価する(図3C):0、正常、紅斑および腫脹の証拠はない。1、最も軽度の関節炎、紅斑および軽度の腫脹は、眼底または足首関節に限定;2、中等度の関節炎、紅斑および軽度の腫脹は、足首から眼底に及ぶ;3、重度の関節炎、紅斑および中等度の腫脹は、足首から中足関節に及ぶ;4、最も重度の関節炎、紅斑および重度の腫脹は、四肢の足首、足および数字、またはアンキローシスを包含する。</li>
</ol>5. 関節部の免疫学的染色
<ol><li>共同分離<ol>
<li>イソファフルランで麻酔後の子宮頸部脱臼を用いてセクション4でマウスを屠殺する。マウスに70%エタノールを噴霧する。</li>
		<li>後ろ足から皮と筋肉の一部をピンセットとハサミで取り除きます。70%エタノールで関節をスプレーし、ペーパータオルを使用して筋肉の残りの部分を削除します。</li>
		<li>RTで2日間4%パラホルムアルデヒドで足首関節を固定し、RTで1ヶ月間10%EDTAで関節を脱灰し、毎週培地を交換します。</li>
		<li>組織をパラフィンに埋め込み、4μmの厚さの組織切片を準備します。<ol>
<li>液体パラフィンの特定のボリュームでマークされた金型に組織を配置します。簡単に冷却します。</li>
			<li>厚さを4μmに設定し、マイクロトームでスライスをカットします。43°Cの水浴でフロートセクション。</li>
			<li>セクションをスライドに取り付け、スライドをオーブンのオーブンに2時間2時間置きます。今後の使用のために、-20 °Cでスライドを保存してください。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>サフラニンOと関節部の高速緑色染色 メモ:RTでは、次の染色手順を実施しています。<ol>
<li>ステップ5.1.4.3のスライドをラックに入れ、RTで水分補給するために次の洗浄を行います:5分(3x)のキシレン、2分(2x)の100%エタノール、2分の95%エタノール、2分の70%エタノール、3分間の水道水の50%エタノール。</li>
		<li>0.1%の速いグリーン溶液で5分間のグリーン溶液を染色し、10sの1%酢酸でリンス。</li>
		<li>0.1%のサフラニンO染色液で20分間染色します。スライドを2分間95%エタノール(2x)、100%エタノール2分(2x)、キシレンを2分(2x)に浸します。</li>
		<li>組織切片を取り付け、顕微鏡下で組織を観察する。 注 : 図4Aの代表的な画像を参照してください。</li>
	</ol></li>
	<li>好中球を可視化する免疫体化学的染色<ol>
<li>パラフィンの部分を78°Cで2時間焼きます。スライドをラックに入れ、RTで水分補給するために次のワッシュを行います:15分(2x)のキシレン、5分(2x)の100%エタノール、5分間の95%エタノール、5分間の80%エタノール、3分間のH2O、3分間のPBS。 注: この手順の実行中は、スライドを乾かさないで下します。</li>
		<li>浸透性バッファーの 1 滴を加えます。37 °Cの湿度制御トレイにセクションをインキュベートします。</li>
		<li>PBSで3分間(3倍)のスライドをすすいでください。組織を直接すすぐいは避けてください。</li>
		<li>圧力ボイラーを使用して熱誘導抗原エピトープの検索を行います。<ol>
<li>ラック内にスライドを配置します。取得バッファで満たされた圧力ボイラーにスライドを浸します。</li>
			<li>電子レンジに圧力ボイラーを置きます。電子レンジを600Wに設定し、スライドを10分間加熱します。</li>
			<li>沸騰後、90°Cに冷却するためにボイラー内のスライドを保ちます。スライドを取り出し、PBSで3分間(3倍)すすいでください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>クエンチ内因性ペルオキシダーゼ活性を、RTで3%H2O2で15分間RTで調製し、PBS中の3分間(3x)のリンススライドを行った。</li>
		<li>疎水性ペンでサンプルの周りに大きな円を輪郭を描き、サンプルに触れないようにします。湿度制御チャンバー内の3%ウシ血清アルブミン(BSA)を37°Cで60分間ブロックします。</li>
		<li>ブロックソリューションを削除します。各セクションに50μLのPBS希釈一次抗体を素早く加える。次いで、湿度制御されたトレイ内のスライドを一晩4°Cでインキュベートする。 注: 異なる抗体に対しては、異なる希釈率が使用されます(MPO の場合は 1:25、NE の場合は 1:20)。</li>
		<li>2日目にトレイを取り出し、RTに30分間放置します。次いで、3分間PBSでスライドを3分間リンスする。</li>
		<li>50 μLのPBS希釈二次抗体を組織に加える。 注: MPO の場合は 1:1,000、NE の場合は 1:1,500 という異なる希釈率が適用されました。</li>
		<li>37 °Cの湿度制御トレイで30分間滑り込みます。次いで、3分間PBSでスライドを3分間リンスする。</li>
		<li>希釈3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液で5分間開発。暗い色が生まれた場合は反応に目を光らせておく。蒸留水でスライドをすすいでください。</li>
		<li>10分間ヘマトキシリンのスライドをカウンターステインし、スライドを水道水で5分間リンスします。</li>
		<li>3sの酸性アルコール超高速分化溶液中でリンス。その後、水道水で10分間すすいます。</li>
		<li>RTで次のワッシュにスライドを浸す:5分間80%エタノール、5分の95%エタノール、5分間の100%エタノール、15分(2x)のキシレン。取り付けソリューションでカバースリップを修正します。顕微鏡で組織を観察する。 注 : 図4Bの代表的なイメージを参照してください。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

末梢血7、骨髄および組織18からの高度に精製された好中球の詳細なプロトコルは、長い間利用可能であった。ここでは、成熟した好中球がさらなる抗炎症および抗酸化研究のために不活性化されたままである腹膜液19から好中球を分離する方法を採用する。
空気ポーチ実験を用い、LPSによる好中球のインビボの浸潤を調べた。この方法は、生体内の一般的な炎症環境における細胞浸潤を直接測定する電位の方法として提案されている。
エアポーチアッセイは、好中球の機能を器官非特異的な方法でしか示すだけで、白血球のリクルートカスケードのいくつかのステップを取り除くのは注目に値する。特定の臓器への好中球の採用は、異なる器官特性、接着分子、およびケモカインに依存することができるので、臓器特異的な状態で好中球の機能状態を探索することは、好中球が特定の疾患において潜在的に果たす役割を研究するために非常に重要である<sup cla...

好中球は最も豊富な白血球であり、ヒト1の白血球集団全体の50〜70%を占める。好中球は、急性炎症時の主要な応答者の1つである。好中球は、組織常駐細胞2、3、4によって放出されるサイトカインおよびケモカインの誘導を介して炎症部位にリクルートすることができるが、これは好中球と血管内皮細胞5の表面上の細胞接着分子との相互作用によって媒介される。好中球は、防御をホストする基礎であり、活性酸素種(ROS)および他の組織損傷分子3、6の放出を介して組織に損傷を与える強力な能力のために、病理的炎症反応の役割を果たす。
これまでの研究では、マウスまたはヒトからの好中球分離プロトコルをいくつか記載している。Ohら、ヒト好中球を全ヒト血液7から単離する密度勾配分離法を実証した。しかし、マウスの血液から十分な好中球の分離は、血液量が少ないため困難である。あるいは、マウス腹膜液から多数の純粋で生存可能なマウス好中球を引き出し、これらの精製された好中球は、好中球浸潤、移行、走化、酸化バースト、サイトカインおよび好中球細胞外トラップ(NET)産生を含む細胞機能エクスビボのいくつかの側面を調べるためにex vivoを使用することができる。トランスウェルアッセイ9またはジグモンドチャンバーアッセイ10,11は、インビトロで好中球移行を評価するために使用することができる。エアポーチモデルは、生体内の好中球の移動および浸潤を評価するために使用されます。皮下エアポーチモデルは、炎症性細胞の遊散を研究するのに便利な生体内動物モデルである。
従来、好中球は炎症の急性期における病原体排除物質と考えられていた。しかし、最近の知見は、好中球が特殊な機能のかなりの多様性を実行する複雑な細胞であることを示しています。好中球は、急性損傷および修復、腫瘍形成、自己免疫応答、および慢性炎症12、13などの多くのプロセスを調節することができる。好中球はまた、適応免疫応答を調節し、B細胞およびT細胞14、15を調節することができる。好中球の大幅な不足は、ヒトの死亡率または重度の免疫不全をもたらし、マウスの好中球の枯渇は死亡につながるが、臓器中の好中球の過剰な活性化または募集は、関節リウマチ(RA)および全身性エリテマトーシス(SLE)6などのいくつかの免疫疾患を引き起こす。好中球は、RA患者の滑液中で最も豊富な細胞である。好中球は、軟骨侵食を悪化させる分解を介して、骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)および好中球エラスターゼ(NE)の過剰な量を生成します。MPOは、主に好中球16の顆粒に発現するペルオキシダーゼ酵素である。NEは、関節軟骨破壊17に関連している。MPOおよびNEは、RA患者の組織における好中球移動および浸潤の状態を評価するために使用することができる。
本稿は、インビボとインビトロの両方で誘導される正常な好中球の移動を評価する3つの従来の方法と、マウス関節特異的炎症モデルにおける病理学的好中球の浸潤を提供する。

<table><tbody><tr><td>0.1% Fast Green Solution</td><td>Solarbio</td><td>8348b</td> 1 <td>つのバイアル中の 20 mg の高速グレン FCF を別の 100 mL ビーカーに移します。20 mL の H2O をビーカーに加え、攪拌して染色液を溶解して 0.1% 高速緑色溶液を作り、Nalgene PES 75mm フィルター</td></tr><tr><td>0.1% サフラニン O 染色液</td><td>Solarbio</td><td>8348a</td><td>1 バイアル中の 20 mg のサフラニン O 染色液を 100 mL ビーカーに移します。20 mL の H2O をビーカーに加え、攪拌して染色液を溶解して 0.1% サフラニン O 染色液を作り、Nalgene PES 75mm フィルター</td></tr><tr><td>0.5 M エチレンジアミン四酢酸溶液 (EDTA)、pH 8.0</td><td>シグマ</td><td>324506</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>100% エタノール</td><td>北京化学工業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% メタノール</td><td>北京化学工業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL円錐形ポリプロピレン遠心分離機チューブ</td><td>ファルコン</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 "針</td><td>BD</td><td>305120</td><td></td></tr><tr><td>26 G x 3/8 "針</td><td>BD</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>3%ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td></td><td></td><td>0.3 g BSAを10 mL PBSに溶解</td></tr>します3<tr><td>%H2O2</td><td></td><td></td><td>1 mL 30% H2O2 をメタノールと 9 mL メタノールと混合</td></tr>します <tr><td>3,3'-ジアミノベンジジン (DAB) キット</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9018</td><td></td></tr><tr><td>30 G x 1/2" ニードル</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Beijing Chemical Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>Z683574</td><td></td></tr><tr><td>50 mL円錐ポリプロピレン遠心分離チューブ</td><td>Falcon</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>50%エタノール</td><td></td><td></td><td>ミックス 500 mL 100%エタノールと500 mL dH2O</td></tr><tr><td>54.8% Percoll</td><td></td><td></td><td>Mix 2.74 mL SIP with 2.26 mL 1&times;PBS、静止</td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td></td><td></td><td>ミックス 700 mL 100% エタノール with 300 mL dH2O</td></tr><tr><td>70.2% Percoll</td><td></td><td></td><td>Mix 3.51 mL SIP with 1.49 mL 1&times;PBS、静止</td></tr><tr><td>80% エタノール</td><td></td><td></td><td>ミックス 800 mL 100% エタノール with 200 mL dH2O</td></tr><tr><td>95% エタノール</td><td></td><td></td><td>ミックス 950 mL 100% エタノール with 50 mL dH2O</td></tr><tr><td>酸性アルコール 超高速分化ソリューション</td><td>Beyotime</td><td>C0165S</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗ミエロペルオキシダーゼ抗体</td><td>アブカム</td><td>ab208670</td><td></td></tr><tr><td>抗好中球エラスターゼ抗体</td><td>Abcam</td><td>ab21595</td><td></td></tr><tr><td>自動血液分析装置</td><td>Sysmex</td><td>XS-800i</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>完全フロイントのアジュバント、10 mg/ml</td><td>シグ</td>マ <td>1002036152</td><td></td></tr><tr><td>カバー スリップ</td><td>CITOGLAS</td><td>10212432C</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤル厚さ計</td><td>ミツトヨ</td><td>7301</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ マイクロチューブ、1.5 mL</td><td>シグマ</td><td>Z606340</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清 (FBS) プレミアム</td><td>PAN</td><td>P30-1302</td><td></td></tr><tr><td>ガス麻酔システム</td><td>ZS Dichuang</td><td>ZS-MV-IV</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ IgG H&L (HRP)</td><td>PPLYGEN</td><td>C1309</td><td>免疫組織化学染色に用いる二次抗体です。</td></tr><tr><td>ハンクスバランスソルトソリューション(HBSS)</td><td>バイオロジカルインダストリーズ、ベスハエメック、イスラエル</td><td>02-016-1A</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン染色液</td><td>ZSGB-BIO</td><td>ZLI-9609</td><td></td></tr>リ<tr><td>ポ多糖(LPS)</td><td>シグマ</td><td>L3012</td><td></td></tr><tr><td>メディアとサプリメント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>修飾サフラニンO-fastグリーンFCF軟骨染色キット</td><td>Solarbio</td><td>G1371</td><td></td></tr><tr><td>N-ホルミル-メット-ロイ-PHE(fMLP)</td><td>シグマ</td><td>47729</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン溶液、100回;</td><td>Invitrogen</td><td>1514022</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>10245207</td><td>密度勾配培地</td></tr><tr><td>透過化バッファー</td><td></td><td></td><td>ミックス 100 &mu;L Triton X-100 と 1 L dH2O で 0.01% Triton X-100</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1&times;</td><td></td><td></td><td>90%ddH2Oと10%(v / v)を10回混合します。PBS、オートクレーブ滅菌</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、10回;</td><td></td><td></td><td>NaCl 16 g、KCl 0.4 g、Na2HPO4&middot;2H2O、0.48 g KH2PO4 (無水) 200 mL ddH2</>sub (無水)、pH 7.4 を調整、オートクレーブ滅菌プラスチック</td></tr><tr><td>製品および機器粉末</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロテオース ペプトン</td><td>オキソイド</td><td>1865317</td><td></td></tr><tr><td>回収バッファー</td><td></td><td></td><td>18 mLの回収緩衝液Aと82 mLの回収緩衝液Bを混合し、dH2Oを1000 mLに加え、pHを6.0に調整</td></tr>します <tr><td>IHC</td><td></td><td></td>用回収緩衝液Aのストック<td>4.2 gのクエン酸(C6H5O7&middot;200 mL dH2O) H<>sub2O)</td></tr><tr>IHC<td></td><td></td><td>用回収緩衝液Bストック</td><td>5.88 g クエン酸三ナトリウム二水和物 (C6H5Na3O7&middot;2H20) in 200 mL dH2O</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Complete Medium</td><td></td><td></td><td>RPMI-1640 培地には、10% FBS と 1% ペニシリン/ストレプトマイシンが添加されています。</td></tr><tr><td>Shu Rui U40 ディスポーザブル滅菌インスリン注射針 1 mL</td><td>BD</td><td>328421</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>CITOGLAS</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>SOLUTION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストック アイソトニック パーコール (SIP)</td><td></td><td></td>パー<td>コールの 90% (v/v) と 10% (v/v) を 10&times;PBS、</td></tr><tr><td>エアポーチアッセイ</td><td></td><td></td>中の洗浄バッファーを20分間静止させ、HBSS Xylene Beijing Chemical Works<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>で0.5M EDTAを10mMに希釈します</tbody></table>

マウスの好中球の遊走と浸潤の検出

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

好中球は、自然免疫系の主要なメンバーであり、病原体および病理的炎症反応に対する宿主防御において極めて重要な役割を果たす。好中球は、サイトカインとケモカインの指導を介して炎症部位にリクルートすることができます。好中球の圧倒的な浸潤は、関節リウマチ(RA)のような無差別組織損傷を引き起こす可能性があります。腹膜滲出物から単離された好中球は、規定の化学誘引剤、N-ホルミル-メット・レウフェ(fMLP)、インビトロイントランスウェルまたはジグモンドチャンバーアッセイに応答する。空気袋実験は、生体内のリポ多糖(LPS)に対する好中球の走化力を評価するために使用することができる。アジュバント誘発性関節炎(AA)マウスモデルはRA研究で頻繁に使用され、抗骨髄ペルオキシダーゼ(MPO)または抗好中球エラスターゼ(NE)抗体を有する関節切片の免疫組織化学的染色は、十分に確立された測定方法である好中球浸潤。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療法を発見するために使用することができる。

腹膜滲出細胞はマウスの洗浄液から採取した。細胞をRPMI-1640完全培地の1 mLで再懸濁し、2段階(54.8%/70.2%)に重ね合わせた不連続な密度勾配(図1A)、および30分間の1,500 x gで遠心分離し(≥95%、~1 x107好中球/マウス)下界面から回収した(図1B)。
空気パウチ実験を行い、LPSin vivoによって刺激された好中球のリクルートメントを調べた(図2A)。エアポーチの白血球サブセットを滲出物で測定した(図2B)。</stron...

ここでは、インビボとインビトロの両方で好中球の移動および浸潤を評価する3つの方法を紹介する。これらの方法は、好中球移行を標的とする有望な治療薬を発見するために使用することができる。

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...

この方法は、生体内およびインビトロにおける正常な好中球の移動と、マウス関節炎モデルにおける病理学的好中球の浸潤を評価するために、よく使用される3つの方法を記述しようとする。この方法は、この分野の他の研究者にとって有用であると考えています。このプロトコルには、エアパウチアッセイおよびアジュバント誘発性関節炎を用いて炎症部位における好中球の移動能力を評価するための方法論的詳細が含まれています。この技術の意味は、モデル群と治療群を比較することによって関節炎療法に向かって広がる。この方法は、炎症性疾患に関する洞察を提供し、炎症性腸疾患に適用することができる。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生である青平LuとHaixu Jiangです。ゼロ日目にマウスを麻酔した後、5ミリリットルのシリンジに取り付けられた0.22ミクロンフィルターを使用して、3ミリリットルの滅菌空気を得る。麻酔マウスの背中の皮膚をピンセットで持ち上げ、皮下に3/8インチの針で26ゲージを使用して3ミリリットルの滅菌空気を注入します。治療後、マウスを呼吸単位から取り出し、よくセットされたケージに入れます。マウスが動き始めるまで生きていることを確認するために、マウスを監視します。3日目には、以前に確立されたエアポケットに3ミリリットルの殺菌空気を注入して、エアポーチを維持します。6日目には、エアポーチに異なる治療を注入します。陰性コントロールとしてPBSの1ミリリットルを注入し、局所炎症を誘発する陽性対照として、1ミリリットルLPSあたり1マイクログラムの1ミリリットルを注入する。6時間後、マウスを犠牲にする。各エアポーチに対して、1ミリリットルの洗浄バッファーを注入してエアポーチを洗浄し、15ミリリットルの遠心分離管に炎症性滲出液を回収します。その後、2ミリリットルの洗浄バッファーでエアポーチを2回洗浄し、同じ遠心分離管に炎症性滲出液を採取します。室温で10分間100回gで遠心分離機。上清を捨て、細胞を1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁します。細胞を数えて、自動血液学分析装置を用いて好中球比を定量化します。少なくとも5秒間ボルテックスを行い、100マイクロリットルの懸濁液をインスリン注入器に引き込んで、完全なフロイントアジュバントを中断する。麻酔後、選択した足に印を付け、インジェクターから完全なフロイントアジュバントの20マイクロリットルを足首関節スペースの4つの垂直スポットに注入します。処理されたマウスを新しいチャンバーに入れます。マウスを監視して、動く能力を取り戻すまで呼吸していることを確認します。3日ごとに、ポケット厚さゲージを使用して足首の関節直径を測定します。また、関節炎のスコアリング基準によって関節炎の重症度を評価する。ゼロは正常です。紅斑や腫れの証拠はありません

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

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生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

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培養された膀胱上皮を越えるヒト好中球の移行の定量的評価

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炎症の好中球を介したイベントの検出で使用するムバーラク40ペプチド

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インビタル顕微鏡で評価されたマウスにおけるクレマスター筋の白血球浸潤

好中球の移動は、化学誘引物質とその細胞外微小環境との相互作用に応答した原形質膜の急速かつ連続的なリモデリングに依存しています。本明細書に記載されるのは、麻酔マウスの耳に注入された好中球における膜リモデリングの動態を調査するための生体内細胞内顕微鏡法に基づく手順である。...

生理条件下での細胞内膜リモデリングを調査するためのマウス皮膚における好中球移動のイメージング

学ぶマウスの好中球遊走と浸潤の検出法。エアポーチアッセイと関節炎モデルを用いて炎症部位での好中球動態を評価し、関節炎や炎症性腸疾患の治療開発への応用可能性を示します。

マウスの好中球の遊走と浸潤の検出

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