Name: ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: 学ぶ 生体微粒子マイクロアレイを用いたヒト好中球群れの化学的・分子解析法。定量的イメージングで遊走パターンとサイトカイン放出を解析し、免疫応答メカニズムの解明に貢献します。

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この研究は、ウィリアム・G・ロウリー化学・生体分子工学科とオハイオ州立大学総合がんセンターからの資金提供によって支えられた。このレポートで示されたデータは、オハイオ州立大学キャンパス顕微鏡イメージング施設で利用可能なイマリスx64(9.3.0ビットプレーン)を使用して処理された画像から来ました。この施設は、助成金P30 CA016058、国立がん研究所、ベセスダ、MDによって部分的にサポートされています。

著者らは、親切に献血した健康なボランティアを認めている。血液検体は、オハイオ州立大学の生物医学委員会によって審査#2018H0268機関審査委員会(IRB)プロトコルに従って、インフォームド・ボランティアの同意の後に得られました。
1. バイオ粒子マイクロアレイの微細加工
<ol><li>標準的なフォトリソグラフィ手順を使用して、マスターシリコンウエハを生成します。<ol>
<li>コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアを使用して目的の設計の証明を生成し、フォトマスクの製造者に送って、クロームフォトマスクを作ります。ここで使用される設計は、150 μmの中央から中央の間隔で円で満たされた直径30μmの4ミリメートルの長方形配列です。この設計は、さまざまなアプリケーションに合わせて変更できます。</li>
		<li>シリコンウェーハ上に40μmの厚い層の陰性フォトレジストをスピンコートします。ウェハを65°Cで5分間、95°Cで10分間焼きます。</li>
		<li>150~160 mJ/cm2のクロムフォトマスクを通してウエハをUV光に露出させる(図1A)。</li>
		<li>65°Cで5分間、95°Cで10分間焼き、フォトレジスト現像で10分間、イソプロピルアルコールでリンスします。この段階では、パターンがウエハ上に表示されているはずです(図1B)。</li>
	</ol></li>
	<li>ポリジメチルシロキサンプレポリマーと硬化剤の10:1の比率(すなわち、プレポリマー20gおよび硬化剤2g)を十分に混合し、未硬化ポリジメチルシロキサン(PDMS)混合物をペトリ皿のマスターウエハ上に注ぐ(図1C)。</li>
	<li>真空は、マスターウェーハ上に気泡が存在しなくなるまで、未硬化のPDMS混合物を処理します。65°Cで一晩硬化する。</li>
	<li>メスを使用してウエハーのパターンセクションの外側をカットし、硬化したPDMSスラブをゆっくりと取り除きます。パターン化された側面を上に向けて、PDMSスラブを清潔なまな板に置きます(図1D)。</li>
	<li>PDMSスラブから8mmの生検パンチ(図1E)で個々のスタンプをパンチアウトします。1枚のガラススライドには、8枚の切手が必要です。</li>
	<li>各スタンプを粘着テープの上に下に置き、破片を取り除きます。</li>
	<li>あらかじめ、水にCPの1.6mg/mL溶液を調製します。<ol>
<li>CP粉末の適正量を水に加えます(例:0.8g~500mL)。</li>
		<li>室温で一晩かき混ぜ、またはすべての固体が水に溶解するまで混ぜる。CP溶液は、室温で6ヶ月間保存することができる。</li>
		<li>必要に応じて、蛍光灯を発するポリL-リジンを蛍光(PLL-FITC)で標識した蛍光を発します。<ol>
<li>CP溶液のアリコート約10mL。少量のPLL-FITC(0.05 mg)を分量に加えます。量は、所望に応じて蛍光の明るさを調整するように変更することができる。</li>
			<li>20 sのFITCで標識されたCP溶液をボルテックス、または溶液が均一な、淡い黄色になるまで。光から保護し、最大1ヶ月間4°Cで保管してください。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>スタンプを上にして、CPの1.6mg/mL溶液の100 μLで各スタンプをプライムし、CP溶液とスタンプの間に気泡が形成されないようにします(図1F)。</li>
	<li>CP溶液の層にスタンプを反転します(図1G)。</li>
	<li>CP溶液から1時間後にスタンプを取り外します。</li>
	<li>濡れたスタンプを、きれいなガラスのスライド6~8xに下に下にして、余分な液体を取り除きます。</li>
	<li>1~2分の切手を真空処理します。</li>
	<li>きれいなガラスのスライドの上に8つの井戸、9 mmの直径のイメージ投射スペーサーを押印の配置のためのガイドとして付着する。このスペーサーを使用すると、各ガラススライドは8つのマイクロアレイを持つことができます。</li>
	<li>イメージスペーサーの各ウェルの中央にあるスライドガラスの上にスタンプを下に置きます(合計で8枚のスタンプを使用します)。</li>
	<li>各スタンプの上に5.6 ±0.1 gのバランスの取れた重さを置き、スタンプを10分にします(図1H)。バランスの取れた重量は、スタンプがガラススライドに均等に押し込まれ、CPをガラススライドに均等に移すために必要です。</li>
	<li>ガラススライドから重みとスタンプを取り外します(図1I)。CP層を、ステップ1.17で説明したように、バイオ粒子を加える前に24時間室温で乾燥させます。CPにFITCタグが付けられている場合、この時点で488nmの蛍光顕微鏡でスタンプの有効性を確認してから、ステップ1.17(図1M)に進むことができます。</li>
	<li>空のPDMSスラブをイメージングスペーサーのサイズにカットし、8mmの生検パンチを使用して、イメージングスペーサーの井戸に合わせた井戸をPDMSに作成します。PDMSスラブをイメージングスペーサ(図1J)でガラススライドに付着させます。</li>
	<li>バイオ粒子(例えば、大腸菌またはzymosan)の溶液を解凍し、注射用水(WFI)で500μg/mLに希釈します。 注:バイオ粒子はオプソン化する必要はありません。好中球表面受容体は、これらの生体粒子19、20、21上の分子を直接認識する。</li>
	<li>各PDMSウェルに100 μLのバイオ粒子溶液をグラススライドで加えます(図1K)。</li>
	<li>グラススライドを30分間揺らす。</li>
	<li>井戸を水で十分に洗い流します。バイオ粒子マイクロアレイは、4°Cのダストフリー環境に最大3ヶ月間保存できます。この時点で、パターンは、ステップ2.1(図1N)に進む前に、594 nmの蛍光顕微鏡でチェックする必要があります。</li>
</ol>2. サンプルの準備
<ol><li>目的のドナーからK2-EDTAチューブに少なくとも2 mLの新鮮な血液を集める。好中球の期待される収量は、1~2 x 106細胞/1 mL全血です。イメージングアッセイには約1.5 x 105の好中球が必要であり、上清の分析には1 x 106好中球が必要です。血液を4時間以内に使用します。</li>
	<li>赤血球(RBCs)を分離し、全血に対して1:5の比率で赤血球凝集剤を添加する。RBCの層から分離するために、半透明の層(バフィーコート)が45分待ちます。</li>
	<li>バフィーコートを取り出し、1 mLバフィーコート(9 mL PBS)を使用してリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗います。</li>
	<li>遠心分離機は190×gおよび20°Cで5分間。 </li>
	<li>上清を吸引し、ペレットを5 x 107細胞/mLで再懸濁します。</li>
	<li>負の免疫磁気選択キットを使用して好中球を分離します。<ol>
<li>50 μLの抗体カクテル/1 mL細胞懸濁液を添加します。10分待ちます。</li>
		<li>100 μLの磁気ビーズ/1 mLセルサスペンションを追加します。10分待ちます。</li>
		<li>丸底チューブにセルサスペンションを追加し、円筒形の磁石に入れ.10分待ちます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遠心分離管に上清を注ぎます。最大 10 mL の PBS を追加します。遠心分離機は190×gおよび20°Cで5分間。 </li>
	<li>吸海上清。0.4%のヒト血清アルブミンを用いてIMDM中の白いペレットを再懸濁する。</li>
	<li>37 °Cで10分間、20 μg/mLのホーチスト33342を有する染色核。</li>
	<li>0.4%のヒト血清アルブミンをリンスにIMDMの5 mLを加える。遠心分離機は190×gおよび20°Cで5分間。 </li>
	<li>0.4%のヒト血清アルブミンを用いてIMDM中の7.5 x 10 5細胞/mLで細胞を再懸濁する。</li>
	<li>バイオ粒子マイクロアレイを含むPDMSウェルに細胞懸濁液を100μL加える。セル懸濁液がPDMSの上部に凸で覆われ、泡が含まれていないことを確認します。</li>
	<li>直径12mmのカバースリップでシール。PDMSの開口部を直径12mmのカバースリップでうまく覆います。余分な細胞懸濁液がウェルの端に逃げないように、ピンセットでカバースリップにそっと押し下げます。組織を使用して、余分な細胞懸濁液を除去する。</li>
</ol>3. アッセイと画像解析の実行
<ol><li>37°C、5%CO2、および90%相対湿度に設定されたケージインキュベーターを備えた顕微鏡を備えた顕微鏡を用いて、生きた細胞イメージングステーションに細胞を搭載した微粒子アレイをロードします。</li>
	<li>タイムラプス蛍光および明視野顕微鏡を使用して、405 nm、594 nm、およびブライトフィールドで10sごとに10倍の倍率で画像を記録します。典型的な実験では、画像は最大2時間収集されます。</li>
	<li>自動化された細胞追跡ソフトウェアを使用して、バイオ粒子クラスターに向かう個々の好中球の移動を追跡します。<ol>
<li>スポット検出セルトラッキングソフトウェアの自己回帰モードを使用します。スポット半径を 5 μm (好中球核のおおよそのサイズ) に設定します。最小トラック長を 120 s に設定し、最大ギャップサイズを 1 フレームに設定します。</li>
		<li>細胞追跡ソフトウェアによって生成されたデータから、好中球の位置および速度を含むファイルを抽出する。これらのファイルは、好中球移動トラック(図2C)と速度対時間のヒートマップ(図2D)を生成するために、グラフ化ソフトウェアと共に使用することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>405 nm 蛍光画像を使用して、選択した画像解析ソフトウェアで時間の経過とともに群れのサイズを追跡します。<ol>
<li>好中球が群がる各バイオ粒子クラスターの周辺の関心領域(ROI)を定義します。各バイオ粒子クラスターを分析するために同じサイズのROIを維持します。</li>
		<li>各ROI内の405nm画像の平均蛍光強度を経時に分析します。</li>
		<li>0 μm2から最大群サイズまでのさまざまな群れサイズで手動で測定を行い、平均蛍光強度の較正曲線を生成して群れサイズを測定します。このキャリブレーションを使用して、時間の経過に合った群れのサイズを計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 上清の収集とタンパク質の検出
<ol><li>37°Cでのバイオ粒子マイクロアレイを含むウェル内の好中球をインキュベートし、3時間の5%CO2で。希望の時間にサンプルを取ります。通常、サンプルは 0、0.5、1、および 3 h で取得されます。タンパク質アレイアッセイの検出限界を克服するために、単一ウェルの上清の全容積(200μL)を各時点に用いた。各時点を三重で分析した。</li>
	<li>明視野顕微鏡を使用して、マイクロアレイ上に群れが形成されていることを確認します。</li>
	<li>上清を200μLピペットで吸引し、0.45μm遠心フィルターチューブに負荷を入れられます。</li>
	<li>上清を190×g、20°Cで5分間遠心分離し、濾過容を収集します。</li>
	<li>サンプルは、処理時間まで-80°Cで保存します。</li>
	<li>サンプルを処理するために、さまざまなヒトタンパク質を検出するマイクロアレイキットを使用します。<ol>
<li>キットに付属の透析チューブに各サンプルの200 μLを加えます。</li>
		<li>透析管を少なくとも500 mLのPBS(pH= 8.0)を含むビーカーに入れる。4°Cで少なくとも3時間、かき混ぜ皿の上で軽くかき混ぜます。ビーカーの PBS を変更し、この手順を繰り返します。</li>
		<li>各サンプルをきれいな遠心分離管に移し、9,000 x gで5分間遠心分離し、沈殿物を除去します。各上清を清潔なチューブに移します。</li>
		<li>ビオチン化したサンプルは、透析サンプル中の全タンパク質1mg当てキットから36μLの1x標識試薬を180μLの透析試料に添加する。20°Cで30分間インキュベートし、5分ごとに穏やかに混ぜます。</li>
		<li>キットに付属の3μLの停止溶液を各サンプルチューブに加えます。各サンプルを新鮮な透析チューブに移し、ステップ4.6.2~4.6.3を繰り返します。この段階では、サンプルは、続行する準備ができるまで-20 °Cまたは -80 °Cで保存できます。</li>
		<li>キットに付属のガラススライドは-20°Cで保存されます。室温に戻すことを許可します。組み立てられたガラススライドを、室温で1~2時間の層流フードに入れます。</li>
		<li>組み立てられたガラススライドの各ウェルに、キット付属のブロッキングバッファを400μLずつ加えます。室温で30分間インキュベートします。</li>
		<li>調製したサンプルを9,000 x gで5分間遠心分離し、沈殿物または微粒子を除去する。ブロッキングバッファーで5倍希釈します。</li>
		<li>各ウェルからブロッキングバッファを削除します。希釈したサンプルを400μLを適切なウェルに加えます。ロッキングしながら室温で2時間インキュベートします。</li>
		<li>各井戸からサンプルをデカントします。1xウォッシュバッファの800μLで3xを洗浄し、ロッキングしながら、それぞれ5分間室温でキットを用意しました。</li>
		<li>きれいな容器に、組み立てられたガラスのスライドを1xウォッシュバッファI.5分間室温で洗い流し、揺らしながら2xを洗います。</li>
		<li>各サブアレイに、1x Cy3-conjugated streptavidinの400 μLを追加します。プラスチック製の接着剤ストリップで覆います。プロトコルの残りの部分のために光から保護します。</li>
		<li>ロッキングしながら室温で2時間インキュベートします。</li>
		<li>溶液をデカントし、サンプルチャンバーからガラススライドを分解します。</li>
		<li>キットに付属の30 mL遠心チューブに、ガラススライドと十分な1x洗浄バッファIを慎重に追加して、ガラススライドをカバーします。ロッキングしながら室温でそれぞれ10分間3倍洗います。</li>
		<li>30 mL遠心管内で、1x洗浄バッファー II で 2x を洗浄し、ロッキングしながら室温でそれぞれ 5 分間洗浄します。</li>
		<li>30 mLのddH2Oで5分間洗い流し、遠心管からガラススライドを取り出し、層流フードで20分間乾燥させます。準備したガラススライドは、スキャンの準備ができるまで-20°Cで保存することができる。</li>
		<li>555 nmの蛍光発光でマイクロアレイスキャナーでガラススライドをスキャンします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Dumic, J., Dabelic, S., Flögel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-3%3A+An+open-ended+story%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Galectin-3: An open-ended story.</a> Biochimica et Biophysica Acta - General Subjects. 1760 (4), 616-635 (2006).</li>
<li>Padmanabhan Iyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinase-9-dependent+mechanisms+of+reduced+contractility+and+increased+stiffness+in+the+aging+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+-+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinase-9-dependent mechanisms of reduced contractility and increased stiffness in the aging heart.</a> Proteomics - Clinical Applications. 10 (1), 92-107 (2016).</li>
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著者らは利益相反を宣言していない。

インビトロ好中球群を刺激するバイオ粒子の均一な配列を生成するマイクロスタンププラットフォームを開発しました。私たちのプラットフォームのインビトロの性質は、私たちはin vivo群れの実験、すなわち群れの好中球5によって放出されるメディエーターを分析する能力が低い、で生じる合併症を回避することを可能にします。さらに、in vivoモデルは、通常、げっ歯類11、12、13、15、22、23、またはゼブラフィッシュ11、12、15、23...

好中球は、血流1で最も豊富な白血球であり、潜在的な診断および治療標的として注目を集めている2,3は、色あさ4、敗血症、外傷5、6、癌1、7、8、および様々な自己免疫疾患5,9を含む様々な病状に関与する可能性があるためである。好中球の群れは、多段階で厳しく調節されたプロセスであり、複雑さを伴う複雑性を有し、研究5、10、11の特に興味深い焦点となっている。群れの間、好中球は周囲の健康な組織5、10、11から炎症部位を単離する。好中球群れの適切な調節は創傷治癒を促進するために不可欠であり、最終的には炎症解決5、12。好中球の群れは、主にげっ歯類12、13、14、15およびゼブラフィッシュ10、11、12、15モデルで生体内で研究されている。しかし、これらのin vivo動物モデルの性質は、制限5を生じさせる。例えば、群れの間に好中球によって放出されるメディエーターは、分析5のために容易にアクセスできない。さらに、インビボで与えられたメディエーターには多くの潜在的な情報源があるので、インビボ実験は、所定のプロセス13におけるそのメディエーターの役割を調査するために細胞産生および/または相互作用を阻害する遺伝的欠乏を導入しなければならない。インビトロ実験は、追加の細胞のコンテキストなしで好中球観察を可能にすることによって、この合併症を回避する。さらに、ヒト好中球協調移動を記述する研究は限られた16である。インビトロの群れプラットフォームでは、ヒト好中球を直接分析することができます。インビトロの群れのプラットフォームは、in vivo研究の限界によって残されたギャップを埋める機会を提供することによって、インビボ研究から得られた知識を拡大する可能性がある。
インビボ好中球群れを模倣するインビトロプラットフォームの必要性に対処するために、好中球の群れを空間的に制御した方法でバイオ粒子マイクロアレイをパターン化できるマイクロスタンププラットフォームを開発しました。2段階のプロセスで、ガラススライド上にバイオ粒子マイクロアレイを生成します。まず、マイクロスタンプを使用して、カチオン性多電解質(CP)スポットのマイクロアレイを生成します。次に、静電気相互作用を介してCPスポットに付着するバイオ粒子の溶液を添加します。まずCP層をパターン化することにより、負に帯電したバイオ粒子を選択的にパターン化して、所望の好中球群れパターンを生成することができる。正に荷電した層は、CPを持たないガラススライド上の領域から生体粒子を取り除く精力的な洗浄ステップを経て負に荷電した生体粒子を保持する。これは、ガラススライドにミクロンサイズのバイオ粒子を固定化する非常に高い表面電荷を有し、したがって、ガラススライド上のパターン化された位置から粒子を除去することから好中球を阻害する。これは、マイクロアレイに配置されたバイオ粒子クラスターをもたらす。マイクロアレイに好中球を加えたところ、バイオ粒子クラスターの周りに安定した群れを形成しました。好中球の移動を追跡すると、群れの好中球が積極的にバイオ粒子クラスターに向かって移動することがわかりました。さらに、このプラットフォームを使用して、群れの間に好中球が放出する特定のメディエーターを分析しました。群れの間に差を出して表現される16のメディエーターを見つけました。彼らの濃度は、時間の経過とともに3つの一般的な傾向に従います: 増加, 減少, またはスパイク.私たちのインビトロ好中球群れプラットフォームは、空間的に制御されたヒト好中球群れの分析、ならびに好中球群れによって放出されるメディエーターの収集と分析を容易にする。以前の出版物では、特定の病状(外傷、自己免疫疾患、敗血症)を有する患者が、健康なドナーからの患者とは異なる機能を有する好中球を有することを実証した5。今後の研究では、当社のプラットフォームを使用して、さまざまな患者集団の中で好中球機能を分析することができます。このプラットフォームは、好中球群れの複雑な配位を定量的に分析することができる。特定の患者集団の好中球機能または目的の病原体に対する好中球応答に関する洞察を提供するために、追加の研究を行うことができる。

<table><tbody><tr><td>"ビッグイージー" EasySep</td>マグネット <td>STEMCELL Technologies</td><td>18001</td><td>好中球単離キットで使用するマグネット</td></tr><tr><td>セルインキュベーター</td><td>Okolab</td><td>777057437 / 77057343</td><td>Okolabケージインキュベーター(温度とCO2制御用</td></tr>) <tr><td>EasySep Human Neutrophil Isolation Kit</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>17957</td><td>ヒト好中球</td></tr><tr>の免疫磁気陰性選択用キット<td>Eclipse Ti2</td><td>Nikon Instruments</td><td>MEA54010 / MEF55037</td><td>倒立研究用顕微鏡</td></tr><tr><td>大腸菌 (K-12株) BioParticles テキサスレッドコンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>E2863</td><td>Bioparticle 粉末、Zetag&reg; アレイ</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core 8-mm 生検パンチ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z708925</td><td>PDMSスタンプをカットする</td></tr><tr><td>HetaSep</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7906</td><td>新鮮ヒト血液中の赤血球からバフィーコートを分離するための赤血球凝集剤</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>核蛍光染色</td></tr><tr><td>ヒトL1000アレイ</td><td>Raybiotech Inc.</td><td>AAH-BLG-1000-4</td><td>1000 ヒトタンパク質を検出する高密度アレイ</td></tr><tr><td>ヒト血清アルブミン (HSA)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A5843</td><td>低エンドトキシン HSA、単離好中球の IMDM で 2 % 溶液を調製</td></tr><tr><td>イスコーブの修飾ダルベッコス培地 (IMDM)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12440053</td><td>単離された好中球</td></tr><tr><td>K2-EDTA チューブ</td>を再懸濁するには <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-657-32</td><td>採血用チューブ</td></tr><tr><td>低反射クロームフォトマスク</td><td>フロントレンジフォトマスク</td><td>N/A</td><td>寸法 5インチ x 5インチ x 0.09インチ (長さ x 幅 x 奥行き)</td></tr> <tr><td>マイクロアレイスキャナー</td><td>パーキン・エルマー</td><td>ASCNGX00</td><td>タンパク質パターンマイクロドメインの蛍光リーダー</td></tr><tr><td>顕微鏡画像 Analsysis ソフトウェア - Imaris</td><td>Bitplane</td><td>9.3.0</td><td>自動細胞追跡分析</td></tr><tr><td>用ソフトウェアNiS Elements Advanced Research Software Package</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td>自動ライブセルイメージングおよびスウォームサイズ計算用ソフトウェア</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジンフルオレセインイソチオシアネート (PLL-FITC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3069-10MG</td><td>30,000 - 70,000 MW PLL with FITCで標識、CP溶液の蛍光標識に使用</td></tr><tr><td>SecureSeal 8ウェルイメージングスペーサー</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>8ウェル、直径9mm、接着イメージングスペーサー</td></tr><tr><td>Silicon Wafer</td><td>University Wafer</td><td>590</td><td>Silicon 100 mm N/P (100) 0- 100 Ohm-cm 500 &mu;m SSPテスト</td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td>ローレル</td><td>WS-650MZ-23NPPB</td>スピン<td>コートに使用 40-&micro;シリコンウェーハ上のフォトレジストのm層</td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td>2025</td><td>シリコンマスターウェーハを作るためのネガフォトレジスト</td></tr><tr><td>SU-8 Developer</td><td>MicroChem</td><td>Y020100</td><td>フォトレジスト現像液。シリコンウェーハから非架橋SU-8 2025を取り外す</td></tr><tr><td>Sylgard 184 (ポリジメチルシロキサン、PDMS)</td><td>ダウ</td><td>1673921</td><td>マイクロスタンプとPDMSウェルを作るための2部構成シリコーンエラストマーキット</td></tr><tr><td>UV露光マスキングシステム</td><td>Klo&eacute;</td><td>UV-KUB 2</td><td>UV光でクロムマスクを介してシリコンウェーハ上のフォトレジストを架橋するために使用されます</td></tr><tr><td>水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A1287303</td><td>バイオ粒子を希釈するための高品質の水</td></tr><tr><td>Zetag 8185</td><td>BASF</td><td>8185</td><td>カチオン性高分子電解質(CP)、粉末、アクリルアミドと四級化カチオン性モノマーの共重合体は、水</td></tr><tr><td>に溶解するとマイクロスタンピング用の「インク溶液」を形成しますZymosan A S. cerevisiae BioParticles Texas Red conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>Z2843</td><td>Bioparticle 粉末、Zetag アレイに添加する前に水に溶解</td></tr></tbody></table>

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

Bioparticle Microarrays for Chemotactic and Molecular Analysis of Human Neutrophil Swarming in vitro

好中球の群れは、好中球が感染部位を封鎖し、組織の再編成を促進する協調プロセスである。群れの特徴を示す動物モデルにおいて、細胞移動の特徴的なパターンを示す動物モデルにおいて、古典的に生体内で研究されている。しかし、in vivoモデルには、アクセスと分析が困難な細胞間メディエーター、およびヒト好中球を直接分析することができないなど、いくつかの制限があります。これらの制限のため、ヒト好中球で群りを研究し、群れの間に生成される分子信号に容易にアクセスできるin vitroプラットフォームが必要です。ここでは、多段階マイクロスタンププロセスを使用して、生体内感染を模倣して群れを刺激するバイオ粒子マイクロアレイを生成します。バイオ粒子マイクロアレイは、制御された安定した方法で群れを作る好中球を誘導する。マイクロアレイでは、好中球は速度が上昇し、バイオ粒子クラスターの周りに安定した群れを形成します。さらに、好中球によって生成された上清が分析され、16個のタンパク質が群れの過程で異なって発現されていたことが発見された。このインビトロ・ストウォーミング・プラットフォームは、再現性のある空間的に制御された方法で好中球の移動およびタンパク質放出を直接分析します。

好中球をバイオ粒子マイクロアレイに添加すると、バイオ粒子クラスターに接触する好中球が活性化し、群れ応答を開始します。バイオ粒子マイクロアレイは、タイムラプス蛍光顕微鏡法を用いて、バイオ粒子クラスターに向かう好中球の移動を追跡することを検証した(Video S1)。個々の好中球核の移動は、バイオ粒子クラスターに向かって移動する過程で追跡される。好中球がバイオ粒子クラスターに到達すると、その核はクラスター内の他の核と重なります。したがって、この方法を用いてクラスター内の好中球を正確に追跡することはできない。ザイモサンと大腸菌のバイオ粒子クラスターは、いずれも好中球群の生成をもたらす。我々の結果として、図2Bは大腸菌粒子によって生成された好中球群からのデータを使用する。図3および図2の他のパネルは、ジモサン粒子によって生成された好中球群を用いる。得られた結果は、好...

このプロトコルは、空間的に制御された好中球群を提供するバイオ粒子マイクロアレイを生成する。これは、好中球が移行中に放出するメディエーターに容易にアクセスでき、定量的な画像分析を可能にします。

Neutrophil swarming is a cooperative process by which neutrophils seal off a site of infection and promote tissue reorganization. Swarming has classically ...

このプロトコルは、好中球の群れのインビトロ分析を可能にし、現在の実験不能の多くの制限を克服するため、重要です。この技術の主な利点は、好中球が群れの間に放出し、定量的な画像分析を可能にする分泌されたサイトカインおよび脂質メディエーターへの容易なアクセスを提供することです。この技術を好中球に応用した一方で、単球やT細胞のような他の白血球の移動を分析するために拡張することができます。適切な量のCP粉末を水に加え、一晩かすべての固形物が溶解するまで攪拌板に混合することによって、1ミリリットルカチオン性ポリエレクトロライト(CP溶液)あたり1.6ミリグラムを調製することから始めます。必要に応じて、FITCで標識したポリL-リジンを添加することにより、溶液を蛍光化することができる。標準的なフォトリソグラフィ法を使用して、マスターシリコンウエハを生成します。ここで使用される設計は、直径30マイクロメートルの4ミリリットルの矩形配列で、中心間に150マイクロメートルの中心がありますが、異なる用途に合わせて変更することができます。シリコンウエハーに負のフォトレジストの厚さ40マイクロメートルの厚い層をスピンコートします。その後、ウエハースを摂氏65度で5分間焼きます。そして10分間摂氏95度。150~160ミリジュール/センチメートルのクロムフォトマスクを通してウエハーをUV光に当てよばします。ウエハースを摂氏65度で再び5分間、摂氏95度で10分間焼きます。その後、フォトレジスト開発者に10分間水没させます。そして、イソプロピルアルコールでそれをすすいでください。パターンがウエハーに表示されるようになりました。次に、ポリジメチルシロキサン、またはPDMS、プレポリマー及びその硬化剤の10対1の比率を十分に混合する。そして、ペトリ皿のマスターウエハースの上に未硬化混合物を注ぎます。真空は、気泡が存在しなくなるまで、未硬化PDMS混合物を処理します。その後、摂氏65度で一晩それを治します。翌日、メスを使ってウエハーのパターン化された部分の外側を切り回します。そして、ゆっくりと硬化したPDMSスラブを取り外し、パターン化された側面を上に向けたきれいなまな板の上に置きます。PDMSスラブから8ミリメートルの生検パンチで個々のスタンプをパンチアウトし、各スタンプを粘着テープに伏せして破片を取り除きます。これらのスタンプを上に向けて、各スタンプに100マイクロリットルの事前準備されたCP溶液を盛り付け、溶液とスタンプの間に気泡が形成されないようにします。次に、CP溶液の層にスタンプを反転し、1時間後にそれらを削除します。各濡れたスタンプを清潔なガラススライドに6〜8回下にして、余分な液体を取り除きます。その後、1〜2分間スタンプを真空処理します。スタンプ配置のガイドとして、きれいなガラススライドの上に8ウェル、直径8ミリメートルのイメージングスペーサーを付着させます。画像スペーサの各ウェルの中央にあるガラススライドの上にスタンプを下に置きます。その後、各スタンプの上に5.6グラムのバランスのとれた重量を置き、スタンプのために10分を許可します。スライドから重量とスタンプを取り除き、CP層が室温で24時間乾燥してからバイオ粒子を添加します。CPにFITCがタグ付けされている場合は、蛍光顕微鏡でスタンプの有効性を確認してください。空白のPDMSスラブをイメージングスペーサーのサイズにカットし、8ミリメートルの生検パンチを使用して、スペーサーの井戸に合わせたPDMSの井戸を作成します。次に、PDMSスラブをガラススライドに付着させます。バイオ粒子の溶液を解凍し、注射のために水で1ミリリットルあたり500マイクログラムに希釈します。ガラススライド上の各PDMSウェルに100マイクロリットルの生物粒子溶液を加え、スライドを30分間揺らします。水で井戸を十分に洗い流し、蛍光顕微鏡でスライド上のパターンを確認します。この生物粒子マイクロアレイは、最大3ヶ月間、摂氏4度のほこりのない環境に貯蔵することができます。0.4%のヒト血清アルブミンでIMDMで1ミリリットル当たり5番目の細胞に7.5倍10回で再懸濁して細胞を調製します。100マイクロリットルの懸濁液を、生物粒子マイクロアレイを含むPDMSウェルに加え、細胞懸濁液がPDMSの上部に凸状であり、気泡が含まれていないことを確認します。直径12ミリメートルのカバースリップで井戸を密封し、ピンセットで軽く押し下げて余分な細胞サスペンションが井戸の端まで脱出し、組織を使用して過剰を取り除きます。細胞を画像化するには、37°C、5%の二酸化炭素、および90%相対湿度に設定されたケージインキュベーターを装備した顕微鏡の生きた細胞イメージングステーションに細胞をマイクロ粒子アレイにロードします。タイムラプス、蛍光、明視野顕微鏡を使用して、405ナノメートル、594ナノメートル、および明るいフィールドで10秒ごとに10倍の画像を記録します。37°Cのバイオ粒子と5%の二酸化炭素をウェル内の好中球を3時間インキュベートし、所望の時点でサンプルを採取する。明視野顕微鏡を使用して、マイクロアレイ上に群れが形成されていることを確認します。単一の井戸の上清の全容を収集し、0.45マイクロメートルの遠心フィルターチューブにロードし、トリプリケート内の各時間ポイントを分析することを確認します。チューブをG190倍、摂氏20度で5分間遠心し、濾過したボリュームを集めます。次に、サンプルを処理時間までマイナス80°Cで保存します。このプロトコルを試みるとき、フォトレジストとヒュームフードの開発者と一緒に働く。人間のドナーから血液を採取する前に、IRB承認プロトコルを用意してください。ヒトの血液由来の物質はBSL2であることを覚えておいてください。好中球を微生物配列に添加すると、生物粒子クラスターに接触する好中球が活性化し、群れの応答を開始します。この生物粒子マイクロアレイは、経度経過蛍光顕微鏡を用いて、生物粒子クラスターへの好中球の移動を追跡するために検証された。安定好中球の群は、30〜60分の曝露後に各クラスターの周りに形成される。対照的に、好中球は、生物粒子クラスターがない場合に集団移動を示さない。染色された好中球核の蛍光強度を用いて、生物粒子クラスター周辺の平均群れサイズが約1490マイクロメートル平方メートルであると判定した。クラスターがない場合、対象となる特定の領域の蛍光は時間の経過とともに一定のままでした。好中球移動のトラックは、好中球が存在したときに生物粒子クラスターに収束したことを示しているが、制御系には収束は認められない。群れの速度と非活性化好中球の速度を測定し、速度分布に統計的に有意な差を見つけた。群れの好中球の平均速度は毎分20.6マイクロメートルで、対照好中球の平均速度は毎分2マイクロメートルであった。群れの間に好中球が放出する16個のタンパク質の濃度を時間をかけて分析した。10タンパク質が濃度で増加した。2人が減少した。そして、残りの4つは群れの最初の1時間の間に増加したが、その後減少した。この手順を実行している間、これらは細菌粒子のパターニングを成功させるために不可欠であるため、すべてがきれいで、スタンプが適切に乾燥していることを確認してください。この技術の開発により、研究者は、遊離メディエーターや細胞外小胞が好中球細胞間コミュニケーションにどのように関与しているかなど、好中球の群れの分野で新たな疑問を探求することができます。

bioparticle-microarrays-for-chemotactic-molecular-analysis-human

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、in vivoでの好中球走化性因子のソースに対応して好中球動員中に動的な好中球 -...

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

このビデオでは、オールオンチップ法を使用した好中球走化性アッセイを実演しています。この方法では、免疫磁気陰性選択とそれに続くマイクロ流体チップ上の走化性アッセイにより、全血から好中球を直接分離できます。...

全血を用いた迅速な好中球走化性分析のためのマイクロ流体チップベースの方法

このプロトコルは、堅牢で再現性の全血の1滴からヒト好中球走化性を測定するように設計分析について詳しく説明します。このアプローチは、好中球の分離のための必要性を回避し、アッセイ準備時間のほんの数分を要する。サンプル量が限られているマイクロ流体チップは、乳幼児や小さな哺乳類では時間の経過とともに好中球走化性の反復測定を可能にします。...

未処理の全血から好中球走化性を測定するためのマイクロ流体プラットフォーム

視覚走化性アッセイは、走化性因子媒介方向の細胞遊走を制御する方法、真核細胞のより良い理解のために不可欠です。 1）リアルタイム、複数の走化性アッセイの高解像度の監視、および2）を同時に化学誘引物質勾配を可視化し、好中球様HL60細胞内シグナル伝達事象の時空間ダイナミクス：ここで、我々はのための詳細な方法について説明します。...

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

この記事では、全血からのチップ上の好中球単離と、単一のマイクロ流体チップ上の走化性試験とを統合することにより、迅速な好中球走化性アッセイを行う詳細な方法を提供する。...

血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。...

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

ここでは、マウスモデルにおける血液単球の化学的活性を定量化し、血液単球に対する栄養、薬理学的および遺伝的介入の影響を評価し、マクロファージ由来の血液単球を特徴付けるプロトコルを提示する。単球化学集性タンパク質-1(MCP-1)装填系地下膜由来ゲルプラグを用いてマウスモデルを用いる。...

生体内における単球血球活性の定量化と血液単球由来マクロファージの特性化

このプロトコルは異なったシグナリング細道からの機能をカバーするスクリーニング方法として使用されるべき一組の好中球の機能試金を特色にする。プロトコルは好中球の細胞外トラップの細胞生存率、純度、活性酸素種の生産、実時間移動、食作用および予備の提案の初期および簡単な評価を含んでいる。...

好中球機能の概要を把握するための一連のスクリーニング技術

この定義されたプロトコルは、 in...

ヒト好中球細胞外トラップ放出のリアルタイムハイスループット顕微鏡定量とアンタゴニストの薬理学の評価

我々は、トポイソメラーゼのタンパク質を搭載した分子スケールデバイスのアセンブリとアプリケーションを示しています。構造は、その両端に二つの異なる蛍光色素を付加することにより組織切片におけるDNA切断の2つの主要なタイプを標識する生体分子センサーです。...

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学ぶ 生体微粒子マイクロアレイを用いたヒト好中球群れの化学的・分子解析法。定量的イメージングで遊走パターンとサイトカイン放出を解析し、免疫応答メカニズムの解明に貢献します。

ヒト好中球群れの化学化学および分子解析のための生体微粒子マイクロアレイ

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