ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

GelMA ヒドロゲルベースのバイオニクスは、3D バイオプリンティングで非常に人気があります。しかし、低粘度は、その印刷可能性を制限します。ここでは、他の研究者と私たちの研究室でGelMAを印刷するための戦略を共有しています。

このビデオでは、この生体材料の特殊な特性を十分に活用し、さらに生物医学の応用に貢献できる異なる3D構造のためのいくつかの印刷方法を提案する。例えば意味を示す臓器損傷を取るためには、埋め込みまたは印刷されたGelMA構造をトレースすることによって対応する治療に使用される可能性がある。凍結乾燥したGelMAを短時間で完全に溶解することは容易ではありません。

溶解プロセスをスピードアップするために、渦ミキサーを使用することができます。すべての生体材料はGelMAの親密な特別な特性を使用します。私は新しいケマーが印刷時にコンディショニングが重要なもののさまようべきであることを提案しました。

操作の詳細により、印刷手順の成功が決まります。他の研究者と共有する視覚的なデモンストレーションを選択するのはそのためです。微小球を作製するには、2つの金属リング電極を接地と正極に接続することから始めます。

リング電極の下の高電圧に接続された金属板と、金属板にシリコンオイルを入れたペトリ皿を液滴受信機として置きます。凍結乾燥GelMAとLAPとDPBSを溶解してバイオインクを調製し、0.22マイクロメートルフィルターで無菌性を確保し、37°Cの水浴で15分間加熱します。0.25%のトリプシンと0.02%のEDTA溶液を37°Cで3分間、MDA-MB-231細胞を取り外します。

細胞を15ミリリットルチューブに移し、100倍Gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、気泡を避けるためにゆっくりと上下にピペット処理することによって、調製されたバイオインクの1ミリリットルと細胞を混合します。バイオインクと細胞混合物の1ミリリットルを3ミリリットルの滅菌シリンジに吸引する。

圧縮空気の力によってバイオインクを供給し、フィクスチャに注射器を置きます。高電圧電源をオンにし、電圧をゼロから4キロボルトに設定します。405ナノメートルの波長光を同時にオンにして、GelMA液滴を5ミリリットルのシリコンオイルでクロスリンクします。

シリコンオイルのほとんどを取り除くためにペトリ皿をデカントし、残りの油と微小球を15ミリリットルの遠心管に移すためにスプーンを使用してください。DPBSを5ミリリットル加え、100倍Gでチューブを遠心分離し、上清を取り除きます。微小球をDMEMでペトリ皿に移し、摂氏37度、二酸化炭素5%で3日間培養します。

3日後に培地を捨て、DPBSで微小球を洗います。室温で30分間4%PFAの2ミリリットルでそれらを固定し、PFAを捨てて洗浄を繰り返します。室温で5分間0.5%非イオン性界面活性剤の2ミリリットルで細胞を透過させ、界面活性剤を捨て、DPBSで微小球を洗浄する。

次に、TRITC-ファロイジンを30分間染色し、DAPIを暗で10分間染色し、各染色後にDPBSで球体を洗浄します。共焦点蛍光顕微鏡でマイクロスフィアを画像化します。脱イオン水に殺菌したアルギン酸ナトリウム粉末を2%重量対体積比で溶解します。

先に説明したように滅菌バイオインク溶液を調製し、バイオインクとアルギン酸ナトリウムを摂氏37度の水浴で15分間加熱します。MDA-MB 231細胞に対する前述の手順に従ってトリプシン化および遠心分離bMSCを、上清液を除去し、GelMAバイオインクの2ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。バイオインク細胞混合物の2ミリリットルを10ミリリットルのシリンジに吸い込み、アルギン酸ナトリウム混合物を2ミリリットルを別のシリンジに吸引する。

1分間に50マイクロメートルの2つのシリンジポンプバイオインクと、1分間に350マイクロメートルのアルギン酸ナトリウムで溶液を供給します。405ナノメートルの波長光をオンにして透明なチューブを照射し、GelMAファイバーをクロスリンクします。ペトリ皿を使って繊維を受け取り、スプーンで集めます。

繊維をDMEM/F12の皿に移し、摂氏37度と二酸化炭素5%で3日間培養します。細胞を培養した後、共焦点蛍光顕微鏡下で繊維を観察するための前述の指示に従う。凍結乾燥したGelMAとLAPとDPBSを溶解し、マゼンタ食用顔料を溶液に加え、印刷精度を向上させます。

0.22マイクロメートルのフィルターで溶液をフィルターして無菌性を求め、37°Cの水浴で15分間加熱します。CAD ソフトウェアを使用して 3D モデルを構築し、適用された DLP バイオプリンターの上位ソフトウェアにモデル ドキュメントをインポートします。調製したバイオインクを10ミリリットルをバイオプリンターのトラフに加えます。

原稿の指示に従って印刷パラメータを設定し、印刷を開始します。完全にバイオプリンターから印刷された構造を取り外し、ペトリ皿にDPBSに浸します。先に述べたようにMDA-MB231細胞を取り外し、ペレットする。

DMEM を 2 ミリリットルで再中断し、印刷された構造にサスペンションを追加します。37°Cで細胞を培養し、炭酸ガスを5%で3日間培養し、先に述べたように共焦点蛍光顕微鏡で観察用の構造を作製する。体積GelMAに10%の重量を準備し、ボリュームLAP溶液に0.5%の重量を準備し、0.22マイクロメートルのフィルターを通してそれをフィルタリングします。

30分間のUV光の下でゼラチン粉末を殺菌し、5%の重量対体積比でGelMA LAP溶液に添加します。37°Cの水浴で15分間加熱します。準備したバイオインクで金型を満たし、30分間摂氏4度の冷蔵庫に入れます。

ブレードを使用して、部分的に架橋されたヒドロゲルシートを金型から取り除きます。2D成形ヒドロゲルシートを組み合わせ、405ナノメートルで1分間照射してGelMAと結合します。取り外しおよびペレットHUVECは、DMEMの2ミリリットルで細胞を混合し、ノズルと注射器でマイクロチャネルに懸濁液を注入します。

次の3時間は、均一で完全なセルシートを達成するために、15分ごとにチップを逆さまにします。37°CでDMEMで3日間ペトリ皿にチップを培養し、5%の二酸化炭素を形態観察のために準備します。GelMA液滴が受け取るシリコーンオイルに落ちたとき、彼らは尾なしで標準的なスフェロイド形状を保った。

高圧電界力を経験するカプセル化された細胞は、電気支援製造方法の生体適合性を検証するその拡散能力を維持した。DLPバイオプリンターは、鼻耳やマルチチャンバーなどのより複雑な形状を持つGelMA構造を製造するために選択されました。GelMA材料に取り付けられ、架橋されたGelMA構造の表面に広がった種付けされたHUVECは、このアプリケーションが組織工学の可能性を秘めていることを実証した。

GelMAベースのマイクロ流体チップを製造するために、2回の架橋戦略が使用されました。さまざまなマイクロチャネルを備えたチップは、オンデマンドで異なる金型を設計することによって構築され、HUVECはチャネルに播種され、巨視的な容器の形状を形成するチャネル壁に取り付けられました。微小球を作り出すときに高電圧源が印加される。

研究者は、前に回路を調べ、オペレータを保護する露出したミリバールに触れないか、短絡による損傷から細胞を作る必要があります。超音波水ベースは、値する速度を加速するための別の選択肢である可能性があります。間違いなくこの貢献は、私たちの研究室でGelMAの3Dバイオプリンティング方法を要約しました。

研究者は、ビデオを参照し、さらなる生物医学的要件にサービスを提供するために印刷戦略を改善または拡大することができます.