Name: 去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-19T02:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: 学ぶ 去勢耐性前立腺癌における小型非コードRNAシーケンス法。ホルマリン固定組織と血清エキソソームからRNAを抽出し、cDNAライブラリを最適化して次世代シーケンスを実施する。新規バイオマーカー発見に貢献する。

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この作品は、米国陸軍医学研究買収活動(USAMRAA)が、受賞番号のアイデア開発賞を通じて支援しています。W81XWH-18-1-303およびW81XWH-18-2-0013およびさらに賞番号によって。W81XWH-18-2-0015、W81XWH-18-2-0016、W81XWH-18-2-0017、W81XWH-18-2-0018、およびW81XWH-18-2-0018、およびW81XWH-18-2-0019前立腺癌バイオリポジトリネットワーク(PCBN)。国立衛生研究所の国立がん研究所(助成金番号RO1CA177984)による著者研究室への資金援助も認めされています。Rajvir Dahiyaは、BX004473退役軍人省のシニアリサーチキャリアサイエンティストであり、NIH-UO1CA199694(RD)の資金提供を受けています。意見、解釈、結論、および勧告は著者のものであり、必ずしも国防総省または米国陸軍によって承認されるものではありません。サンフランシスコVAMCの中核施設ディレクターであるジュディ・シゲナガ氏が、NextSeq 500シーケンサーの支援をいただいたことに感謝しています。

この研究は、米国共通規則の倫理指針に従って行われ、人間研究に関する機関委員会によって承認された。
1. マイクロダイセクション
注:腺癌特徴(CRPC-アデノ)またはNE分化(CRPC-NE)を有するFFPE転移性CRPC組織は、前立腺癌バイオレポジトリネットワーク(PCBN)から得られた。ガラススライド上の10ミクロンPCaセクションは、前に説明したように手動マイクロダイセクションのために調製された18.簡単に要約するには:
<ol><li>シレン(それぞれ2x、10分)にスライドを浸すことによって組織切片を脱パラフィン化する。次いで、等級エタノール(100%、95%、90%、80%、70%)でスライドを5分間インキュベートし、続いて蒸留水洗浄とヘマトキシリン(30s浸漬)で染色して切除を行った。</li>
	<li>ヘマトキシリン染色後、組織切片を水で洗浄する。次いで、等級エタノール(70%、80%90%、95%、100%)に入れて組織切片を脱水する(各5分)の後にキシレン(5分)が続く。</li>
	<li>対応するヘマトキシリンとエオシン(H&E)スライドを分析し、腫瘍領域(すなわち、腺癌またはNED)を特定し、ボード認定病理学者の助けを借りてこれらの腫瘍領域および正常隣接領域をマークします。これらのH&Eスライドをロードマップとして使用し、腫瘍と正常領域を区別するために、上記のステップで得られたヘマトキシリン染色組織をマークします。</li>
	<li>メスの刃を使用して顕微鏡の下でマークされたティッシュスライドを慎重に解剖する。</li>
	<li>静電電荷ゲルローディングピペットチップを使用して、別々のチューブ内の正常および癌領域から解剖された組織を収集します。荷電した先端は解剖されたティッシュを引き付け、解剖後の最大の組織回復を可能にする。ティッシュが荷電した先端に付い込んだら、先端を空の2 mLの採取管に切り取ります。</li>
</ol>2. 血清由来EVの分離
注:腺癌特性(CRPC-アデノ)またはNE分化(CRPC-NE)を有する転移性CRPC患者から採取された凍結患者血清サンプルを、承認されたIRBプロトコルを用いてPCBNから調達し、使用前に-80°Cで保存した。血清サンプルは、対応する組織と血清由来のEVとの比較を可能にするために、マイクロ解剖組織に使用されるものと同じ患者のセットから収集された。市販の血清EV単離試薬を用い、EVを回収した。
<ol><li>4°Cで凍結患者血清サンプルを解凍する。</li>
	<li>解凍した血清サンプルを110μL使用し、2,000 x gで30分間スピンします。</li>
	<li>その後のEV/エキソソーム分離のために上清を収集し、破片ペレットを廃棄します。上清に30μLの血清エキソソーム単離試薬を加え、4°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>10,000 x gで 10 分間スピンします。</li>
	<li>EVペレットをヌクレアーゼフリーウォーターで調製したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の70°Lで再サスペンドします。パーティクルトラッキング解析システムのアリコートを保持して、パーティクルの品質と数を評価します。さらに分析するまで、残りのサンプルを-80°Cに保管します。</li>
</ol>3. マイクロ分剖された前立腺組織およびEVからのRNA分離
注:総RNAは、いくつかの変更を加えたメーカーの指示に従って市販のキット(材料の表)を使用して、マイクロセク剖された組織および精製EVから分離された。次のセクションでは、重要な手順に特に重点を置いて、これらの手順について簡単に説明します。
<ol><li>RNAをマイクロセク剖組織から分離します。<ol>
<li>マイクロセク剖されたFFPE組織を150μLのプロテイナーゼK緩衝液に再差し込む。渦を混ぜて、先端から残留組織をピペットします。11,000 x gで 1 分間スピンします。</li>
		<li>ペレットに10μLのプロテイナーゼKを加えます。ペレットが白くなるまで2分間待ちます。ピペットは数回上下します。</li>
		<li>56 °Cで16分間渦を3分ごとにインキュベートします。</li>
		<li>サンプルを取り出し、ヒートブロックが80°Cに達します。ブロック上のサンプルを3分ごとに16分間インキュベートします。</li>
		<li>氷の上で3分間インキュベートする。</li>
		<li>20,000 x gで 15 分間スピンし、上清を新しい 2 mL チューブに移します。</li>
		<li>DNaseブースターバッファ16μLを加え、その後10°LのDNase I.ミックスを加え、チューブを穏やかに反転させ、室温(RT)で15分間インキュベートします。</li>
		<li>320 μL の赤血球 (RBC) リシス バッファーを追加します。チューブを反転して混合し、100%エタノールの1,120°Lを加えます。4 °Cで保存されたスピンカラムで直ちに転送します。30 s の場合は 8,000 x gでスピンします。</li>
		<li>カラム2xを洗浄バッファで洗浄し、カラムを20,000 x gで5分間回転させ、残留洗浄バッファを除去します。</li>
		<li>スピンカラムを2~3分間空気乾燥させ、19°LのRNaseフリー水で溶出します。分光光度計で精製されたRNAを定量し、サンプルを40ng/μLに正規化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>血清由来EVからのRNA分離。<ol>
<li>キットを使用してエキソソームRNAを分離します。精製EV懸濁液の75μLの溶解バッファーAと9.3μLの溶解バッファーBを50μLに加えます。 注:約10分間チューブを反転させてサンプルを混合し続け、EVの完全なリシスを可能にします。</li>
		<li>100%エタノールの130°Lを加え、サンプルを反転してすぐに混合します。スピンカラムで転送し、3,300 x gで1分間回転させます。</li>
		<li>カラム2xを洗浄バッファで洗浄します。カラムを1,300 x gで3分間回転させ、洗浄バッファを完全に取り除きます。</li>
		<li>カラムを2分間空気乾燥させます。 </li>
		<li>キットに含まれている溶出バッファーを使用してステップ 3.2.4 を繰り返し、サンプルからの RNA の収率を高します。</li>
		<li>分光光度計でサンプルを定量し、40 ng/μLに正規化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 小さなRNAシーケンシングのためのライブラリの準備
注:小さなRNAライブラリ準備キット(材料表)を使用して、単離されたRNAサンプルからcDNAライブラリを生成しました。シーケンサーで実行する前にライブラリを生成、浄化、および品質チェックする手順は、最終的に実行からの出力データの品質を決定するシーケンス プロトコルにとって重要です。したがって、各ステップを慎重に進める。メーカーからのガイドラインは、RNAの最低50 ngを使用することをお勧めします。通常、これら2つのサンプルソースから得られる総RNAの品質が低く、少量の低い場合、このプロトコルは100ngの低いRNA濃度に最適化されます。以下のプロトコルは、ライブラリの 1 つのサンプル用です。
<ol><li>アダプター・リゲード cDNA を生成します。<ol>
<li>正規化された(40 ng/μL)RNAサンプルの5μLを使用します。3'アダプタの1 μLを追加します。サンプルをインキュベートする前に、サーマルサイクラーを70°Cに予熱します。2分間インキュベートします。次のステップに進む前に、すぐに氷上でサンプルを移します。</li>
		<li>別のチューブに、2μLのライゲーション緩衝液、1μLのRNase阻害剤、およびT4 RNAリガーゼ2の1μLを混合し、欠失変異体である。上下にピペットで混合し、RNA/3'アダプタを使用してこのミックスの4°Lをチューブに追加します。</li>
		<li>28°Cに予熱したサーマルサイクラーに移し、1時間インキュベートする。</li>
		<li>サーマルブロックにサンプルを保持したまま、1μLのストップ溶液を追加します。さらに15分間28°Cでインキュベートする。</li>
		<li>チューブを取り外し、このステップの直後に氷の上に保ちます。</li>
		<li>別のチューブに5'アダプタの1 μLを追加します。</li>
		<li>70°Cに予熱したサーマルサイクラーに移し、2分間インキュベートする。</li>
		<li>すぐにチューブを氷の上に置き、アダプターの再焼鈍を防ぎます。</li>
		<li>変性5'アダプタのチューブに10 mM ATPの1 μLを追加します。ピペットで混合し、T4 RNAリガーゼを1μL加えます。ピペットで混合し、この混合物の3μLを3'アダプタライゲーションRNAを含むチューブに追加します。28°Cに予熱したサーマルサイクラーで転写し、1時間インキュベートします。</li>
		<li>直ちに氷に移し、サンプルをさらに進めるか、後で使用するために-20°Cで保管してください。</li>
		<li>RT-PCR を実行するには、各アダプター・リゲード RNA の 6 μL を使用し、それに 1 μL の RNA RT プライマーを追加します。70°Cに予熱したサーマルサイクラーに移す。2分間インキュベートします。</li>
		<li>別のチューブに、5xストランドバッファーの2μL、12.5 mM dNTPの0.5 μL、100 mM DTTの1μL、RNase阻害剤の1μL、および逆転写酵素の1μLを混合します。このミックスの5.5°Lをアダプター・ライゲーテッドRNAに加え、50°Cに予熱したサーマルサイクラーに移します。1時間インキュベートする。</li>
		<li>アダプター・ライゲード cDNA を直ちに氷に移します。</li>
		<li>別のチューブに、PCRミックスの25μL、RNA PCRプライマーの2°L、RNA PCRプライマー指数の2°L、およびRNaseフリー水の8.5 μLを混合します。このミックスの37.5 μLを12.5 μLのアダプター・ライゲードcDNAに加えます。98°Cに予熱したサーマルサイクラーに移す。製造元のプロトコルで提案されているように、サーマル サイクラーをプログラムし、サイクル番号を 11 ではなく 15 に変更します。 注:使用されるすべてのプライマーのシーケンスは、材料の表 の下にリストされています。</li>
		<li>完了後、サンプルを4°Cに保ちます。将来の使用のために-80 °Cでそれらを進めるか、保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>リゲードされたcDNAの品質管理を浄化し、実行します。 注:増幅されたcDNAは、以下に説明するように精製されたcDNAサンプルの品質および収量を改善するためにいくつかの変更を除いて、製造業者のプロトコルに従ってゲル精製した。<ol>
<li>6%TBEポリアクリルアミドゲルを使用して、増幅されたcDNAを精製します。高解像度ラダー(HRL)とカスタムRNAラダー(CRL)を同じ量のDNAローディング染料で希釈します。</li>
		<li>各cDNAサンプルに10μLのDNAローディング色素を追加します。各サンプルの 30 μL を、2 つの異なるサンプル間の中間空間で CRL と HRL を使用して、互いに隣接する 2 つの別々のレーンで実行します。</li>
		<li>145 V で 1x TBE バッファーで約 30~40 分間ゲルを実行します。 注:ローディング染料の下青の前面を追跡します。ゲルの底部に近づくと電気泳動を停止します。</li>
		<li>ゲルを臭化エチジウム(EtBr)を0.5μg EtBr/1 mL 1x TBEで1x TBE緩衝液で転写します。 注意:EtBrは既知の発癌物質であり、ここからゲルからの切除までの各ステップは細心の注意を払って行われるべきである。</li>
		<li>トランスイルミネーターでゲルを可視化し、145 bpと160 bpマーカーの間でゲルを正確に切断します。 注:アダプターダイマーは145 bpマーカーに非常に近い走ります。したがって、アダプターダイマーによる汚染を避けるために、145 bpマーカーの少し上のゲルをカットします。</li>
		<li>ゲルを2mLの採取管に保持されたDNA破断管に移す。20,000 x gで2分間スピンし、RNaseフリー水を300°L加え、RTでロッカーで一晩軽く回転させます。</li>
		<li>DNA沈殿を行うために、翌日にチューブの内容物を5μmフィルターチューブに移す。600 x gで 10 s 回転します。 注:ゲルがフィルターを通過する場合、チューブを10sより長く回転させないでください。</li>
		<li>溶出したDNAに2μLのグリコーゲン、3M NaOAcの30°L、0.1xペレット塗料の2°L、100%エタノールの975°Lを加えます。4°Cで17,000 x gで20分間スピン。</li>
		<li>上清を捨て、75%のエタノールを加え、ペレットを洗浄します。17,000 x gで5分間4°Cでスピンし、上清を廃棄し、37°Cでチューブをインキュベートしてエタノールを完全に蒸発させます。</li>
		<li>10 mM Tris-HCl pH 8.5の12°Lでペレットを再サスペンドします。</li>
		<li>精製したcDNAを10倍(1:10)希釈し、1μLの希釈cDNAを使用してバイオアナライザ上で実行することにより、ライブラリ品質チェックを実行します。</li>
		<li>cDNA製品のサイズがエレクトロフェログラムの小さいRNA(136−160 bp)の範囲に対応していることを確認してください。各サンプルの合計モル率を計算します。Tris-HCl pH 8.5を使用して、各サンプルを2nMに正規化します。</li>
	</ol></li>
	<li>精製されたcDNAの変性および配列。<ol>
<li>各2 nMサンプルの等量を単一の200°L PCRチューブに混合して、ライブラリをプールします。作りたての0.2 N NaOHを10°Lのプールライブラリに加えます。</li>
		<li>ボルテックスですぐに混ぜ、280 x gで1分間回転させ、RTで5分間インキュベートします。</li>
		<li>変性ライブラリーの200 mM Tris-HCl pH 7~20°Lの10μLを加えます。ボルテックスで混ぜ、280 x gで1分間回転させます。</li>
		<li>970°Lのプレチルドハイブリダイゼーションバッファをライブラリに追加し、ボルテックスでよく混ぜます。図書館は20pMの濃度にある。最終的に希釈されるまで氷の上に置いておきなさい。 注:最終的な希釈は、シーケンサーで実行する直前に行われます。</li>
		<li>変性ライブラリーの117 μLを、プレチルドハイブリダイゼーションバッファーの1,183°Lに加えます。チューブとパルス遠心分離機を反転して混ぜます。図書館の最終的な濃度は現在1.8 pMです。</li>
		<li>最終ライブラリの1.3 mLにPhiXの1.3 μLを追加します。シーケンサーでの実行を開始するには、ソフトウェア インターフェイスの画面の手順に従って、読み取りタイプ (単一読み取り)、読み取り長 (読み取りごとにサイクル数)、ライブラリ ID、および [開始]を含む実行パラメータを確認します。</li>
	</ol></li>
</ol>5. データ分析
<ol><li>シーケンサーの実行の最後に、結果のシーケンス データを fastQ ファイルとして取得します。適切なソフトウェアを使用して、結果として得られるシーケンスデータを分析します。</li>
	<li>fastQ ツールキット アプリケーションを開き、[起動]ボタンを押します。</li>
	<li>ソフトウェアのサンプルのリストからファイルを選択し、データを保存する場所を選択します。</li>
	<li>トリミングされた各シーケンスに適用される文字列名を追加します。ストリンジェンシーを 0.9 に保ちます。アダプター・シーケンスを、各シーケンス・サンプルの 3' 末端から「TGGAATTCTCGGGTGTCAAGG」としてトリムするように入力します。[読み取りフィルタ]タブを展開し、最小読み取り長 "5" を選択します。[確認]ボックスを選択し、[続行]ボタンを押してトリミングを開始します。トリミングされたファイルは、解析の終了時にプロジェクト フォルダに保存されます。</li>
	<li>ソフトウェアで小さなRNA v.1.0アプリケーションを開き、起動ボタンを押します。</li>
	<li>解析後にファイルを保存して送信するプロジェクトを選択します。</li>
	<li>アプリケーションで新規ミルおよび差動ミル機能を選択します。差分分析のためにグループを "制御"および"Test"として分離し、分析するトリミングされたファイルをそれぞれのグループに追加します。</li>
	<li>分析を開始するための[起動]ボタンを選択します。解析に従って、結果のファイルをダウンロードします。</li>
</ol>

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著者は宣言する利害の対立を持っていません。

この記事では、単離されたRNAの収率と品質を高めるために最適化されたキットを使用して、FFPE組織および血清由来EVからRNAを分離するプロトコルについて説明します。さらに、精製されたRNAを用いて、小型RNAシーケンシング用のcDNAライブラリーを生成した。リストされている両方のステップは、実行24からの最終結果であるシーケンス読み取りの品質と深さを決定する際に不可欠です。したがって、これらの重要な手順を最適化することは、シーケンス実行を成功させるために不可欠です。
FFPE由来RNAの単離における重要なステップは、組織からの架橋ホルマリンの除去を可能にするプロテイナーゼKによる消化である。このステップは、サンプルを55°Cおよび80°Cで約16−18分間インキュベートすることによって最適化された。これは、260/280比の増加によって単離されたRNAの品質の効果的な増加をもたらした。読み取りの順序付けは、多くの場合、複数のサンプルを含む実行の変数です。したがって、ライブラリー調製の開始時に RNA 入力の量を制御すると、ライブラリ...

前立腺癌は、ARシグナル伝達を介して作用するアンドロゲンによって駆動される。従って、AR経路を標的とすることは、疾患1の主力治療法である。しかし、耐性は、標的療法の結果としてしばしば起こり、疾患は進行性転移性CRPC2に進行する。CRPCは、エンザルタミドとアビラテロン2、3を含む第2世代のAR療法によって治療され、最初は生存を改善する。しかし、NEPCのような致死的な変異体は、治療オプションが限られている治療CRPC症例の25~30%に出現することが多く、死亡率3の増加につながる。NEPCは、NEDとして知られる可逆的トランス分化プロセスを介して生じ、ここでPCa細胞は腺癌からの系統スイッチを受け、ARの発現の減少およびエノラーゼ2(ENO2)、クロクロニンA(CHGA)、およびシナプトフィシン(SYP)4を含むNE系統マーカーの発現の増加を示す。これらの耐性変異体が治療介入の結果として生じることを考えると、PCaの治療が困難なこの致命的な、治療が困難な生成につながる経路を解読することが不可欠である。
NEPCのゲノムは最近、Beltranらによって行われた徹底的な研究で解読され、それによってコピー数の変化、突然変異、単一ヌクレオチド多型(SN)、および患者由来転移組織からのDNAメチル化が分析された5。この積極的な形態のPCaのゲノムの理解が著しく進歩しているにもかかわらず、CRPC-腺癌からNEPCへの移行に関与する小さな非コードRNA(microRNA)を含むエピジェネティックな要因についてはほとんど知られていない。マイクロRNA(miRNA)は、コグネイトmRNA標的6の3'-非翻訳領域(UTR)との配列特異的相互作用によって主に転写後の遺伝子発現を抑制することによって作用する22bp長い、二本鎖RNAである。いくつかの腫瘍および腫瘍抑制剤が同定され、疾患発症および転移を調節するその役割は、異なる癌6、7においてよく研究されている。これらの小さな非コーディングRNAは、多くの場合、疾患死亡率6、8、9を制御する上で非常に重要なターゲットとして機能します。最近の研究は、エキソソームのようなEVにおける輸送を介した癌転移におけるmiRNAのパラクリン効果を理解することに焦点を当てており、その血流中を流れ、腫瘍細胞がこれらの二次メッセンジャーをヌクレアーゼフリー環境10、11、12の転移位置に送ることを可能にする。EVは、宿主細胞12から形容作用を伝達するために腫瘍細胞からmiRNAを運ぶ。したがって、腫瘍細胞の二次メッセンジャーとしてのEVの同定は、疾患重症度の非侵襲的検出に有用である可能性がある。
miR-1246は、積極的なPCaからEVで高度にアップレギュレーションされ、疾患重症度13を示す。これらのEV関連miRNAは、疾患の非侵襲的バイオマーカーとして機能するだけでなく、腫瘍形成を駆動する上で機能的に重要な役割を果たす。したがって、非侵襲的バイオマーカーとその機能的意義をより良く同定できるように、PCaの耐性形態に関連するmiRNAレパートリーの意義を理解することが不可欠です。
次世代シーケンシングの出現は、突然変異、染色体転位、染色体上昇、メチル化などのゲノムの変化を含む腫瘍景観の詳細を研究するための最も包括的なプラットフォームを提供し、そのすべてが癌14、15、16の形態および性質に大きく寄与する。同様に、腫瘍細胞で起こり、疾患重症度17の重要なプレーヤーであることが多い膨大なエピゲノム変化を理解することも不可欠なツールです。NEPCの生成に関連するmiRNAレパートリーを理解することを目的として、FFPE転移CRPC組織およびそれに対応する血清由来EVに対して小さなRNAシーケンシングを行った。これら2つのサンプル源のいずれかに由来するRNAは、(1)収率が低く、(2)ホルマリン固定およびEV分離のためにしばしば起こる劣化による悪品質である。さらに、cDNAライブラリの生成は、シーケンス実行の重要ですが、面倒なステップです。したがって、これらのRNAを分離し、それらを使用して小さなRNAシーケンシング用のライブラリを生成する方法は、正確で信頼性の高いデータを生成するための最適化が必要です。
RT-PCR、マイクロアレイ、インシトゥハイブリダイゼーション(ISH)など、さまざまなサンプルでmiRNA発現をプロファイリングする方法がいくつかあります。FFPE組織由来RNAを用いてRT-PCRおよびISHによるmiRNA発現を評価するプロトコルが最近公開された18.最近の技術は、サンプルでmiRNA発現をプロファイリングするためのより包括的で包括的なプラットフォームを提供します。NanoString nCounterは、感度の高いmiRNA検出プラットフォーム19を提供していますが、検出は、多くの場合、アレイで利用可能なmiRNAの数(〜2,000)によって制限されます。このようなシナリオでは、次世代シーケンシングのようなより敏感で網羅的なプラットフォームは、異なるサンプル20におけるmiRNA同定および同時プロファイリングのはるかに広い深さを提供する。この方法は、PCa患者21、22、23からの尿または血漿中のmiRNAシグネチャを決定するために使用されている。現在の記事では、FFPE組織と血清由来EVRNAを使用して積極的なCRPCに関連するmiRNAプロファイルを研究するために、次世代シーケンシングプラットフォームを使用するプロトコルが提示されています。

<table><tbody><tr><td>3 M NaOAc pH 5.5</td><td>USBコーポレーション</td><td>75897 100 mL</td><td></td></tr><tr><td>5 & マイクロ;mフィルターチューブ</td><td>ISTエンジニアリング株式会社</td><td>5388-50</td><td></td></tr><tr><td>6% TBE ポリアクリルアミドゲル</td><td>Novex</td><td>EC6265BOX</td><td></td></tr><tr><td>BaseSpace</td><td>Illumina</td><td></td><td>分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>バイオアナライザー</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAローディング色素</td><td>Novex</td><td>LC6678</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Thermostat plus</td><td>Eppendorf 1.5 mL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtBr</td><td>Pierce</td><td>17898</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール 200プルーフ</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>エキソソーム RNA 単離キット</td><td>Norgen</td><td>58000</td><td></td></tr><tr><td>ゲル破砕チューブ</td><td>IST Engineering Inc.</td><td>3388-100</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン 分子生物学グレード</td><td>Thermo Scientifc</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン セレク</td><td>ト スタット ラボ</td><td>SL401</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-676</td><td>accuSpin Micro 17R</td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE kit</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientifc</td><td>Nano Drop 1000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NTA</td><td>Malvern</td><td>LM14</td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500 Sequencer</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2 (150 cycles)</td><td>Illumina</td><td>FC-404-2001</td><td></td></tr><tr><td>Pellet paint</td><td>Millipore</td><td>70748-3</td><td></td></tr><tr><td>Superscript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitogen</td><td>18064014</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA Ligase 2 Deletion Mutant</td><td>Lucigen</td><td>LR2D11310K</td><td></td></tr><tr><td>TBE ランニングバッファー (5x)</td><td>Novex</td><td>LC6675</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>MJ Research</td><td>PTC100</td><td></td></tr><tr><td>全エキソソーム単離試薬 (血清由来)</td><td>Invitrogen</td><td>4478360</td><td></td></tr><tr><td>TrueSeq small RNA library Prep kit-Set A (Indexes 1-12)</td><td>Illumina</td><td>RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisherサイエンティフィック</td><td>X3P- 1GAL</td><td></td></tr><tr><td>RNA 3' プライマー</td><td></td><td></td><td>GUUCAGAGUUCUACAGUCCGACGAUC</td></tr><tr><td>RNA 5' プライマー</td><td></td><td></td><td>TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG</td></tr><tr><td>ストップ オリゴ</td><td></td><td></td><td>GAAUUCCACCACGUUCCCGGGG</td></tr><tr><td>RNA RT プライマー</td><td></td><td></td><td>GCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td></tr><tr><td>RNA PCR プライマー</td><td></td><td></td><td>AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGA</td></tr><tr><td>RNA PCR Index Primer</td><td></td><td></td><td>CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[6 塩基]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA</td></tr><tr><td>-</td><td>-</td><td></td><td>アダプター</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー 1</td><td></td><td></td><td>CGTGAT</td></tr><tr><td>RNA PCR Index Primer 2</td><td></td><td></td><td>ACATCG</td></tr><tr><td>RNA PCR Index Primer 3</td><td></td><td></td><td>GCCTAA</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー 4</td><td></td><td></td><td>TGGTCA</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー 5</td><td></td><td></td><td>CACTGT</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー 6</td><td></td><td></td><td>ATTGGC</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー 7</td><td></td><td></td><td>GATCTG</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー 8</td><td></td><td></td><td>TCAAGT</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー 9</td><td></td><td></td><td>CTGATC</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー10</td><td></td><td></td><td>AAGCTA</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー 11</td><td></td><td></td><td>GTAGCC</td></tr><tr><td>RNA PCR インデックスプライマー 12</td><td></td><td></td><td>TACAAG</td></tr></tbody></table>

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードrnaのシーケンシング

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

アンドロゲン剥奪によるアンドロゲン受容体(AR)シグナル伝達のアブレーションは、最初に癌の退行をもたらす前立腺癌の治療の最初のラインの目標です。しかし、かなりの数の症例において、疾患は進行した去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)に進行し、治療の選択肢が限られており、しばしば攻撃的である。遠い転移は、主に攻撃的な疾患のこの段階で観察される。CRPCは、最初は生存を改善する第2世代のAR経路阻害剤によって治療され、その後、治療抵抗性の出現が続く。神経内分泌前立腺癌(NEPC)は、しばしば神経内分泌分化(NED)として知られているトランス分化プロセスを介して治療抵抗性の結果として発症する前立腺癌(PCa)の稀な変異体であり、PCa細胞は系統スイッチを受ける腺癌から、神経内分泌(NE)系統マーカーの発現の増加を示す。NEPCへの進行とトランス分化を促進するゲノム変化に加えて、エピジェネティックな要因と微小環境の手掛かりは、疾患の進行を促進する上で不可欠なプレーヤーと考えられています。この原稿は、高度なPCaに関連するエピジェネティックドライバ(すなわち、小さな非コーディングRNA)を識別するための詳細なプロトコルを提供します。ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)転移組織および対応する血清由来細胞外小胞(EV)からの精製マイクロRNAを使用して、プロトコルはシーケンシングのための適切な品質管理を備えたライブラリを準備する方法を記述するこれらのサンプルソースからのマイクロRNA。FFPE と EV の両方から RNA を分離することは、ほとんどの RNA が劣化しているか、または量が制限されているため、多くの場合困難です。このプロトコルでは、RNA入力とcDNAライブラリを最適化して、シーケンス時に最も具体的な読み取りと高品質のデータを得るためのさまざまな方法について詳しく説明します。

ライブラリは、RNA分離後に調製し、品質チェックを行った。マイクロセク剖組織および血清由来のEVから単離されたRNAから調製した増幅cDNAライブラリーのゲル精製を図1および図2に示す。アダプター・リゲード miRNA の製品サイズは、サンプルごとに約 136−160 bp に対応しました。図1A-Bは、小さなRNAライブラリー調製のために正確に取除化されるべきゲルの範囲を示すためにマークされている。図2A-Bは、マイクロセク剖組織および血清由来EVに対するゲル電気泳動およびエレクトロフェログラムを示す。補足図1は、電気泳動機からの代表的な結果とモルラリティを算出する方法を示す。
シーケンサーで実行する前にライブラリ メトリックを取得する手順を実...

治療抵抗性は進行前立腺癌の患者で発症することが多く、場合によっては、癌は神経内分泌前立腺癌と呼ばれる致死的なサブタイプに進行する。この遷移を促進する小さな非コーディングRNA媒介分子変化を評価することは、神経内分泌前立腺癌の発症につながる因果メカニズムのより良い疾患階層化および同定を可能にするであろう。

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

このプロトコルの使用によって研究者は、進行前立腺癌のための新しいエキソームまたは細胞外小胞ベースおよび組織ベースの微小細胞を同定することができる。F-F-B組織と細胞外小胞の両方からRNAを分離することは、そのほとんどが作成されているか、限られた量であるため、多くの場合、次世代シーケンシングのための最も特異的な自由で高品質なデータを生成するためにR-N-A入力およびC-D-N-Aライブラリを最適化するためのさまざまな方法について詳しく説明します。次世代シーケンシングは、この粒子が前立腺癌臨床サンプルで最適化された腫瘍進行の根底にある腫瘍の分子変化を理解するための最も包括的なプラットフォームを提供し、進行した積極的な前立腺癌の基礎生物学に関する新しい洞察を提供することができる。低入力材料からC-D-N-Aライブラリを最適化することは、正しい結果を得るために高品質のC-D-N-Aライブラリを生成することが非常に重要であるため、シーケンス実行を成功させるための重要なステップです。先に行われたように組織の微細解剖を行った後、血清由来E-Vの患者血清サンプルの解凍列を摂氏4度で分離する。解凍した血清サンプルの110マイクロリットルをチューブに移し、2000回Gで30分間回転します。その後のE-Vまたはエキソソーム分離のためにスーパーナデンを選び、デブレペレットを捨てます。スーパーナテントに血清エキソソーム分離試薬の30マイクロレターで。摂氏4度を30分間インキュベートします。10分間Gの1万倍のスピン。E-Vスーパーネートを慎重に選び、別の1.5ミリリットルチューブにペレットを邪魔することなく、将来の分析のためにマイナス80°Cを保存します。その後、ヌクレアーゼフリー水で調製した70マイクロリットルのP-B-SでE-Vペレットを再懸濁する。マイクロ解剖組織から総R-N-Aを分離した後、精製されたE-Vの市販キットを使用して、3つのプライムアダプターの1マイクロリットルで1マイクロリットルR-N-Aサンプル当たり5マイクログラムにライブラリ調製を行います。サーマルサイクラーを摂氏70度に予熱し、サンプルを2分間インキュベートします。すぐに氷の上にサンプルを移す。別のチューブでは、2マイクロリットルのライゲーションバッファー、RNase阻害剤の1マイクロリットル、T4 RNAリガーゼ2の1マイクロリットルを混合し、欠失変異体を含む。バイパイの寝具を上下に混ぜます。その後、氷の上にR-N-A 3プライムアダプターでチューブにミックスの4マイクロリットルを追加します。サーマルサイクラーを摂氏28度に予熱します。そして、1時間インキュベートするためにサーマルサイクラーにチューブを置きます。その後、サンプルをサーマルサイクラーに入れたままチューブに1マイクロリットルのストップ液を加えます。摂氏28度でさらに15分間インキュベートします。その後、すぐにチューブを取り外し、氷の上に保ちます。別のチューブに5つの素数アダプターの1マイクロリットルを追加します。摂氏70度に予熱されたサーマルサイクラーに移します。そして2分間インキュベートします。すぐにチューブを氷の上に置き、アダプターの再焼を防ぎます。Dネイチャー5素数アダプタのチューブに10ミリモールA-T-Pの1マイクロリットルを追加します。さようならパイのおしっこを混ぜ、ミックスにT4 R-N-Aリガーゼの1マイクロリットルを追加します。さようならパイのおしっこを混ぜます。この混合物の3マイクロリットルを、R-N-Aを結紮した3つの素数アダプタを含むチューブに移します。28°Cに予熱したサーマルサイクラーにチューブを置き、1時間インキュベートします。その後すぐに氷にチューブを転送し、サンプルでさらに進むか、将来の使用のためにマイナス80°Cで保存します。R-T-P-C-Rを実行するには、各アダプタの6つのマイクロライガーをR-N-Aに結び付け、R-N-A R-Tプライマーのマイクロライガーを1個追加します。チューブを摂氏70度に予熱したサーマルサイクラーに移し、2分間インキュベートします。チューブを氷に移します。別のチューブには、2マイクロリットルの5X、ストランドバッファー、12.5ミリモラーDNTPの5マイクロリットル、100ミリモルDTTの1マイクロリットル、R-N-A阻害剤の1マイクロリットル、および1マイクロリットルの逆転写酵素を混合する。この混合物の5マイクロリットルをアダプターの連結RNAに加え、50°Cに予熱されたサーマルサイクラーに移して1時間インキュベートします。1時間後、アダプターは、すぐに氷に無料のDNAを結び付けた。別のチューブには、25マイクロリットルのPCRミックス、2マイクロリットルのRNA PCRプライマー、2マイクロリットルのRNA PCRプライマー指数、および8.5マイクロリットルのRNAの遊離水を混合します。このミックスの37.5マイクロリットルを、CDNAを結び付けるアダプターの12.5マイクロリットルに加えます。チューブを摂氏98度に予熱されたサーマルサイクラーに移します。サイクル番号を 15 に変更して、製造元のプロトコルで提案されているようにサーマルサイクラーをプログラムします。完了後、サンプルを摂氏4度に保ちます。今後の使用のためにマイナス80°Cで進むか、保存してください。結紮された無料DNAを精製するには、10マイクロリットルのDNAローディング色素を各無料のDNAサンプルに加えます。そして、後者の高解像度とカスタムRNAの10マイクロリットルに。6%TBEポリアクリルアミドゲルで互いに隣接する2つの別々のレーンで各サンプルの30マイクロリットルを実行します。カスタムRNA後者と高解像度後者では、2つの異なるサンプル間の中間空間。1X TBEバッファー内でゲルを145ボルトで約30~40分間実行します。ローディング色素の下の青い前面を追跡します。ゲルの底に近づくと電気泳動を停止します。ゲルを1つのX TBEバッファーに1ミリメートル当たり5マイクログラムの臭化エチジウムで移動します。トランスイルミネーションでゲルを視覚化し、145ベースペアと160ベースペアマーカーの間でゲルを正確にカットし、145ベースペアマーカーのわずかに上に切り取り、アダプタダイマーによる汚染を避けます。重要なステップは、アダプターダイマーが望ましいブランドに非常に失われるように正確にゲルを切断することによって行われる精製合体CDNAです。ゲル片を2ミリメートルの回収チューブに保管されたDNA破断チューブに移します。2分間Gの20,000倍でスピンします。そして、RNaseフリーの水の300マイクロリットルを追加し、室温で一晩ロッカー上で穏やかに回転させます。翌日にDNA沈殿を行うために、チューブの内容物を5ミクロンのフィルターチューブに移した。厳密に10秒間600回Gをスピンします。次に、3つの酢酸モルナトリウム、1Xペレット塗料、975マイクロリットルの100%エタノールのグリコーゲン30マイクロリットルを2マイクロリットル加え、DNAを溶出させます。摂氏4度で17,000倍のGで20分間スピンします。上清を捨て、75%エタノールを加え、ペレットを洗浄します。4°Cで17千倍Gで5分間回転した後、上清を捨て、熱ブロック上で37°Cでチューブをインキュベートし、エタノールを完全に蒸発させます。再び12マイクロリットルの10ミリモルトリシダークロリドをPH8.5で懸濁します。次に、精製された無料のDNAを10回希釈し、希釈したCDNAの1マイクロリットルを使用してバイオアナライザー上で実行することにより、ライブラリ品質チェックを実行します。無料のDNA製品サイズが、136と160塩基対の間のエレクトロフェログラム内の小さなRNAの範囲に対応していることを確認してください。各サンプルの総モルシティを計算します。PH8.5で塩酸トリ酸塩を使用して、各サンプルを2ナノモルに正規化します。200マイクロリットルの各ナノモルサンプルの等量を1つの200マイクロリットルPCRチューブに混合してライブラリを保持します。原稿に記載されている手順に従って変性および順序を変性する。本研究では、RNAの単離後にライブラリを作成し、品質チェックを行った。アダプターの連結されたマイクロRnaseの製品サイズは、各サンプルの約136〜160塩基対に対応した。強調表示されたセクションは、調製の小さなRNAライブラリーのために正確に切除されたゲルの範囲を示しています。この図は、精製された無料DNAライブラリー用のゲル電気泳動とエレクトロフェログラムを示しています。マイクロ解剖されたFFPE組織および血清由来EV.小さなRNAシーケンシングランからの代表的な指標は、予想されるクラスター密度、Qスコア、クラスター通過フィルタパーセンテージ、およびマイクロ解剖されたFFP組織および血清由来EVの推定収量および誤差率を示す。両方のサンプルのQスコアは、ベースコール精度の99.9パーセントを示す3つ以上の値を示した。そして、エラー率はすべて1を下回っていました。ライブラリの準備の各ステップは慎重に実行する必要があり、チューブは、各インキュベーション後すぐに氷に移す必要があります。プロトコルの重要なステップは、アダプターダイマーフリーで純粋なCDNAライブラリを持っていることを確認するためにゲルを正確に切断することです。CDNAライブラリを生成するには、高品質のシーケンス実行を最適化する必要があります。このプロトコルを理解することは、限られたソースサンプルからの他のシーケンシングライブラリの準備にこれらの微細な詳細を外挿する視聴者が血清および細胞外小胞を示唆するのに役立ちます。この技術は、転移性前立腺癌患者における腫瘍化アグレッシブおよび治療抵抗性に関連する新しいミクロナーゼを同定するのに役立った。これらの技術は、新規バイオマーカー発見に役立つ他の疾患タイプに外挿することができる。この技術は、ストリオン由来の血清や組織サンプルなどの生物学的材料を使用するので、適切な予防措置を講じる必要があります。さらに、臭化エチジウムは既知の発がん性物質であり、このプロトコルを使用して非常に慎重に取り扱う必要があります。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（定量PCR）は、腫瘍サンプル中の様々なマイクロRNA（miRNA）分子の発現レベルを調査するために迅速かつ高感度な方法です。異なるmiRNA分子の何百ものこのメソッド式を使用して、増幅定量化し、同じcDNAをテンプレートから分析することができます。...

定量的リアルタイムPCR（定量PCR）による前立腺腫瘍におけるマイクロRNAの検出

ヒトゲノムの8％を占めるヒト内在性レトロウイルス（HERV）は、希少なコーディング能力が、10万末端反復配列（LTR）を保持する。カスタムアフィメトリクスマイクロアレイは、個々のHERV遺伝子座発現を同定するために設計されており、今後の臨床研究のための概念の証明として、前立腺癌組織で使用された。...

前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

このプロトコルは、ヒト血清から低分子RNAを抽出するための方法が記載されている。私たちは、DNAアレイで使用するために、がん血清からマイクロRNAを分離してもシングルプレックス定量PCRするために、このメソッドを使用している。プロトコルは、高品質のRNAを得るために変更を加えてフェノール及びグアニジニウムチオシアネート試薬を利用する。...

ヒト血清から小非コードRNAの分離

ここでは、定量的リアルタイムPCR(RT-PCR)およびin...

前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

このプロトコルの目標は、下流のRNA分析のために不均一な前立腺組織から純粋な細胞型の集団を分離する効果的な方法として、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを使用することです。...

RNA分析のためのヒト前立腺上皮のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

このプロトコルは、循環するmiRNAの汚染を回避し、NSCLCにおけるそれらのバイオマーカーの特徴を評価するために、プロテイナーゼKおよびRNAse処理を含む市販のエキソソーム単離キットを通じて、NSCLC患者の血漿中に放出されるエクソソームにおけるmiRNAプロファイリングの実施可能性を説明しています。...

定量PCRを通じて非小細胞肺癌（NSCLC）患者の血漿中のエキソソームのmiRNA解析：実行可能な液体生検ツール

この修​​正された抽出プロトコルは、組織病理学的組織ブロックへの関心をより正確に対象地域からのRNAとDNA収量を向上させます。...

RNA及びDNA抽出の両方のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織コアの調製

本稿では、血清または血漿 dna のリアルタイム PCR...

血清およびリアルタイム PCR を用いたプラズマ コピー数検出

ホルマリン固定パラフィン包埋標本を表す人間の病気の分子バイオ マーカーの貴重な情報源。実験に基づく cDNA ライブラリの準備プロトコル、最初に新鮮な冷凍 RNA をデザインおよび最適化組織からアーカイブされたマイクロ Rna の解析に格納された 35...

ホルマリン固定パラフィン包埋 RNA 試料を用いた回顧マイクロ Rna シーケンス: 相補的な DNA ライブラリの準備のプロトコル

このプロトコルは、小さな RNA ライブラリーの構築と次世代シーケンシングのための細胞培養媒体からマイクロ Rna は細胞を浄化する方法を示します。さまざまな品質管理のチェックポイントは、exRNAs...

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

本手法はホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)RNAサンプルから得ることができる配列データの質と量を改善するステップを説明する。我々は、FFPE-RNAサンプルの品質をより正確に評価し、シーケンシングライブラリを準備し、FFPE-RNAサンプルからのデータを分析するための方法論を説明する。...

分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化

学ぶ 去勢耐性前立腺癌における小型非コードRNAシーケンス法。ホルマリン固定組織と血清エキソソームからRNAを抽出し、cDNAライブラリを最適化して次世代シーケンスを実施する。新規バイオマーカー発見に貢献する。

去勢耐性前立腺癌患者からのホルマリン固定組織および血清由来エキソソームからの小型非コードRNAのシーケンシング

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