Name: ピリミジン類似体である5-ヨード-2-デオキシウリジン(IdU)と細胞周期マーカーを使用して、マスサイトメトリープラットフォームで細胞周期相を確立します(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶマスサイトメトリーによる単一細胞レベルの細胞周期解析法。IdUを直接添加する簡便な手法で、急性骨髄性白血病の幹細胞・前駆細胞区画における細胞周期状態を調査し、臨床転帰との相関を解明します。

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著者らは、Palak Sekhri、Hussam Alkhalaileh、Hsiaochi Chang、Justin Lyebergerの実験的支援の努力に感謝したい。この作業は、ペロトニアフェローシッププログラムによってサポートされました。この資料に記載されている意見、調査結果、結論は著者のものであり、必ずしもペロトニアフェローシッププログラムの意見、調査結果、結論を反映しているわけではありません。」

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</ol>

ベベハニ博士はFluidigmから旅行サポートを受けています。Fluidigmは、ラボで使用するための試薬や材料も購入しています。

ここで紹介する例は、MCM プラットフォームを使用して細胞周期分布を分析する方法を示しています。また、細胞周期解析は時間や温度などの実験条件に敏感であることが実証されており、これは研究者が細胞周期解析にMCMを検討する際に取らなければならない重要な考慮事項です14。1時間以内の短期間保管されたサンプルは、通常の状態に匹敵するIdUの取り込みになります。クローズドシステム内のサンプルを約2時間長期間使用すると、IdUの取り込みは減少しますが、相対的なサイクル画分と非サイクル画分は変化せず、粗い細胞サイクル分析が可能になります。極低温保存とそれに続く融解は、かなりの期間、正常な細胞周期分布を破壊します。極低温保存は、タンパク質およびRNA分布を破壊することが以前に指摘されていたが、細胞周期を混乱させることが最近になってようやく示された14,15,16,17<sup class="xref...

質量サイトメトリーは、質量分析法の高分解能と定量性を利用して、約40のパラメータの検出を可能にします。蛍光色素標識抗体の代わりに金属標識抗体が使用され、より多くのチャネルが可能で、スピルオーバーが最小限に抑えられます1,2。MCMには、フローサイトメトリーと比較して、細胞周期解析に関して長所と短所があります。MCMの主な利点の1つは、多数のパラメータにより、非常に不均一なサンプル中の多数の免疫表現型的に異なるT細胞タイプにわたる細胞周期状態を同時に測定できることです。MCMは、ヒト骨髄3およびテロメラーゼ欠損症4のトランスジェニックマウスモデルにおける正常造血中の細胞周期状態の測定に成功しています。急性骨髄性白血病(AML)における細胞周期状態の解析は、細胞周期が臨床療法に対する既知の反応と相関していることを示し、治療の選択に情報を提供できる機能的特徴へのin vivoの洞察を提供します5。マスサイトメトリー細胞周期分析の第2の利点は、細胞周期状態と相関し得る多数の他の機能マーカーを測定する能力である。最近の研究では、IdUとBRUおよびrRNA6に対する金属タグ付き抗体を使用することにより、タンパク質およびRNA合成を細胞周期状態と相関させることができました。分化の連続体における多数の集団にわたる細胞周期状態を測定するこの種の高度にパラメトリックな分析は、現在のフローサイトメトリー技術ではほぼ不可能です。MCMの主な欠点は、蛍光フローサイトメトリーで使用されるもの(DAPI、ヘキスト、ピロニンYなど)と同等のDNAまたはRNA染色がないことです。蛍光色素はDNAおよびRNA含量の比較的正確な測定を与えることができるが、この精度はヌクレオチド塩基間のインターカレーション時に生じるこれらの色素の蛍光特性の変化によってのみ可能である。したがって、MCM分析では、DNAまたはRNA含有量を同様の精度で測定することはできません。代わりに、マスサイトメトリー細胞周期分析は、サイクリンB1、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質(pRb)、リン酸化ヒストンH3(pHH3)などの細胞周期状態に関連するタンパク質の測定と、S期細胞へのIdU取り込みからのヨウ素原子の直接測定に依存しています。これら2つの測定アプローチは、正常な細胞増殖中に非常に類似した結果をもたらしますが、細胞周期の進行が破壊されると、潜在的に不一致になる可能性があります。
各細胞周期期の細胞数の測定は、正常な細胞周期の発達や、がんや免疫疾患でよく見られる細胞周期の破壊を理解する上で重要です。MCMは、金属タグ付き抗体を使用して細胞外および細胞内因子の信頼性の高い測定を提供します。しかし、イリジウムベースのDNAインターカレーターは2Nと4NのDNAを区別できなかったため、S相の測定は制限されていました。細胞周期の段階を定義するために、Behbehaniは、質量サイトメーターの範囲内に収まり、S期3の細胞を直接測定できる質量127のIdUを利用する方法を開発しました。この直接測定により、二次抗体の必要性や、酸やDNaseなどのDNA変性剤の使用を回避できます。細胞内サイクリングマーカーと組み合わせることで、実験モデルにおける細胞周期分布の高分解能を可能にします。
このプロトコルは、MCMの一般的なフローサイトメトリープロトコルからの細胞周期測定を適応させます。私たちの方法は、細胞周期パラメータを含めるための便利で簡単な方法を提供します。in vitroサンプルのIdU取り込みは、37°Cで10〜15分のインキュベーションしか必要とせず、数時間のインキュベーション時間を推奨するほとんどのBrdU染色プロトコルよりも短い3,7。IdUおよびBrdUに組み込まれたサンプルは、プロテオミクス安定剤を使用して固定し、-80°Cの冷凍庫にしばらく保存できます。これにより、サンプルの品質を低下させることなく、バッチ分析のために多数のIdU染色サンプルをアーカイブすることができます。

<table><tbody><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A3059</td><td>CSM</td></tr><tr><td>遠心分離機</td>の成分 <td>Thermo Scientific</td><td>75-217-420</td><td>サンプル遠心分離</td></tr><tr><td>Cleaved-PARP (D214)</td><td>BD Biosciences</td><td>F21-852</td><td>アポトーシス細胞の同定</td></tr><tr><td>Cyclin B1</td><td>BD Biosciences</td><td>GNS-1</td><td>G2 分解能</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>Cryopreservative</td></tr><tr><td>EQ 4 要素キャリブレーション ビーズ</td><td>Fluidigm 201078</td><td></td><td>CyTOF パフォーマンス</td></tr><tr><td>FACS チューブ メッシュストレーナー付き</td><td>Corning</td><td>08-771-23</td><td>CyTOF 実行前に塊/破片を除去する細胞ストレーナー</td></tr><tr><td>胎児ウシ血清 (FBS)</td> <td>VWR</td><td>97068-085</td><td>細胞培養成長サプリメント</td></tr><tr><td>Helios</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>CyTOFシステム/プラットフォーム</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>H3393</td><td>非特異的染色を防ぐための染色添加剤</td></tr><tr><td>IdU(5-ヨード-2&プライム;-デオキシウリジン)</td><td>シグマ</td><td>I7125</td><td>S相に組み込み</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>eBiosciences</td><td>SolA15</td><td>G0/G1</td></tr><tr><td>MaxPar マルチラベルキット</td>の確認 <td>Fluidigm</td><td>201300</td><td>金属ラベリングキット、金属を添付抗体</td></tr><tr><td>へ マイクロプレート シェーカー</td><td>Thermo Scientific</td><td>88880023</td><td>染色中のサンプルの混合</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド(PFA)</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>15710</td><td>固定剤</td></tr><tr><td>ペンタメチルシクロペンタジエニル-Ir(III)-ジピリドフェナジン</td><td>Fluidigm</td><td>201192</td><td>CyTOF取得時の細胞同定</td></tr><tr><td>p-H2AX (S139)</td><td>Millipore</td><td>JBW301</td><td>DNA損傷の検出</td></tr><tr><td>p-HH3 (S28)</td><td>Biolegend</td><td>HTA28</td><td>M-phase Resolution</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>細胞培養用洗浄液および固定液の成分</td></tr><tr><td>p-Rb (S807/811)</td><td>BD Biosciences</td><td>J112906</td><td>G0/G1 Resolution</td></tr><tr><td>Proteomic Stabilizer</td><td>SmartTube Inc</td><td>PROT1</td><td>Sample fixative</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td>細胞培養増殖培地</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Acros Organics AC447810250</td><td></td><td>CSM/抗体緩衝液の成分、殺生物剤</td></tr></tbody></table>

ピリミジン類似体である5-ヨード-2'-デオキシウリジン(idu)と細胞周期マーカーを使用して、マスサイトメトリープラットフォームで細胞周期相を確立します(英語)

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

細胞周期相の調節は、細胞増殖および恒常性の重要な側面である。細胞周期を支配する調節機構の破壊は、癌を含む多くの疾患の特徴である。細胞周期の研究には、細胞周期の進行の各部分の細胞数を定義し、各細胞周期段階を明確に描写する能力が必要です。マスサイトメトリー(MCM)の出現は、元素同位体の直接測定によるハイスループットシングルセル分析の大きな可能性を提供し、MCMによる細胞周期状態の測定方法の開発は、MCMの有用性をさらに拡大します。ここでは、MCMシステムで5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)と同様に、5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)を直接測定する方法について説明します。この IdU ベースの MCM を使用すると、いくつかの利点があります。まず、IdUは合成中にDNAに急速に取り込まれるため、10〜15分の短いインキュベーションでS期の細胞を確実に測定できます。第二に、IdUは二次抗体やDNA分解を必要とせずに測定されます。第三に、IdU染色は、サイクリンB1、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質(pRb)、およびリン酸化ヒストンH3(pHH3)の測定と簡単に組み合わせることができ、5つの細胞周期相の明確な描写をまとめて提供します。これらの細胞周期マーカーとMCMで可能な多数のパラメータとの組み合わせにより、他の多くの指標との組み合わせが可能になります。

HL-60細胞とヒト骨髄穿刺液を利用することで、実験条件が細胞周期の分布と分析にどのように影響するかを示すことができます。まず、細胞周期相がどのように導出されるかを実証するために、ゲーティング戦略を確立する必要があります。図1では、細胞の破片とダブレットを分離し、単一細胞集団を確立するのに重要な一重項ゲートの確立を示しています。細胞株の場合、細胞周期解析に進むために必要なのは一重項ゲートだけです(図2a)。ヒトサンプルの場合、各細胞周期ゲートの正確な境界は細胞タイプによって異なる可能性があるため、通常、細胞周期解析の前に免疫表現型集団を確立する必要があります。集団が確立されたら(通常、その集団を定義する表面マーカーをゲーティングすることによって)、細胞周期ゲートを確立する必要があります。図2bは、IdU対CyclinB1二軸プロット上のS相の確立を示しています。このプロットは、G2/M相ゲートの境界を確立するためにも使用されます(<strong class="...

このプロトコルは、マスサイトメトリープラットフォームで使用するために細胞周期測定に適合させます。マスサイトメトリーのマルチパラメータ機能により、ヨウ素取り込みを直接測定することでS期の細胞を同定でき、細胞内サイクリングマーカーはさまざまな実験条件で各細胞周期状態の特性評価を可能にします。

ピリミジン類似体である5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)と細胞周期マーカーを使用して、マスサイトメトリープラットフォームで細胞周期相を確立します(英語)

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

このプロトコルにより、マスサイトメーターを使用して単一細胞レベルで細胞周期を調べることができ、これにより、いくつかの新しい研究や臨床研究を行うことができます。この手法の主な利点は、その単純さです。IdUは細胞に直接添加され、さらなる治療や抗体は必要ありません。この技術を使用して、急性骨髄性白血病患者の幹細胞コンパートメントと前駆細胞コンパートメント内の細胞周期状態を調査しました。そしてこれは、これらの特定の細胞型の細胞周期特性がこれらの疾患を有する患者の臨床転帰と相関し得ることを実証した。この手法は、希少がん細胞の増殖特性を理解し、免疫細胞サブセットの増殖を理解するのに役立ちます。細胞サンプルにIdUを添加する前後に、細胞を目的の増殖条件に維持する。この場合、加湿した摂氏37度のインキュベーターを5%CO2で細胞にIdUで標識し、濃縮されたIdUストック溶液を細胞の増殖培地に1〜50に希釈する。次に、サンプルをバイオセーフティフードに移し、1ミリリットルの細胞ごとに1ミリモルのIdUを10マイクロリットル加えます。細胞をインキュベーターに10〜15分間戻してから、サンプルを個々のコニカルチューブに移します。15ミリリットルのコニカルチューブで遠心分離して細胞を収集し、チューブあたり200マイクロリットルのPBSにペレットを再懸濁します。必要に応じて、適切な生/死染色で細胞を標識し、死んだ細胞をマークします。生/死染色に続いて、CSMで洗浄した培地で細胞をクエンチした後、25マイクロリットルの16%パラホルムアルデヒドで細胞を固定しました。室温で10分間インキュベートした後、遠心分離により細胞を回収する。5〜15ミリリットルのCSMを加え、再び遠心分離します。10%ジメチルスルホキシドを添加した500マイクロリットルの細胞染色培地にペレットを再懸濁します。次に、細胞をより小さなチューブに移して、摂氏マイナス80度で保管します。細胞周期解析のためにを正規化するには、ファイルを適切なフローサイトメトリー解析ソフトウェアプログラムにインポートし、191イリジウムに対するイベント長の二軸プロットを作成します。細胞は、明瞭な明るいイリジウム高集団を形成するであろう。イベントの長さのスケールを変更して、セルがより目立つようにします。次に、ダブレットとデブリの50〜60%を除外するシングレットゲートを作成し、残りのダブレットとデブリを除去するために残差とオフセットガウスパラメータを設定します。S相ゲートを設定するには、IdU対拡散マーカーの二軸プロットを作成します。S期IdU陽性細胞は別個の集団を形成する。G0/G1およびG2/Mゲーティングの場合、IdU対サイクリンB1プロットでゲートを確立します。G0 / G1フェーズはサイクリンB1ロー、IdU陰性、G2 / MフェーズはサイクリンB1ハイ、IdU陰性になります。特定の細胞タイプをゲートするには、サイクリンB1対IdUグラフにS期細胞のみをプロットして、G0/G1期細胞とG2/M期細胞の分離を確立します。サイクリンB1の人口が多い場所の周りにゲートを引きます。場合によっては、これを識別するのが難しい場合がありますが、S期集団の約上位5%のサイクリンB1のレベルは、通常、G0 / G1とG2 / M相ゲートの間のブレークポイントです。前のゲート内に存在するセルはG2/M相集団となり、残りはG0/G1期集団になります。G0期集団を確立するには、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質対IdUプロットを作成します。G0期は、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質低、IdU陰性集団によって表されるであろう。活発なサイクリング集団は、高いリン酸化網膜芽細胞腫タンパク質とIdUの取り込みを示すため、G0フェーズゲートは、通常、2つの異なる集団で発現するため、この境界に描画できます。G0ゲートの定義が困難な場合は、S期集団を活性集団とし、リン酸化網膜芽細胞腫タンパク質の上位90〜100%を組み込んだゲートを描画します。ゲート外のリン酸化網膜芽細胞腫タンパク質の低集団は通常G0集団であり、このゲートに入るpRbレベルのG0 / G1細胞はG1細胞です。M相ゲーティングの場合、軸方向プロットによってIdU対リン酸化ヒストンH3を作成します。M期は、リン酸化ヒストンH3集団内の細胞のごく一部として観察されます。pHH3のレベルが低いG2 / M集団の細胞はG2細胞です。IdUの取り込みに失敗した場合、または不可能であった場合は、Ki67およびリン酸化網膜芽細胞腫タンパク質を使用して、サイクリングおよびサイクリングではない細胞画分を定義します。二重陽性の母集団は、G1、S、G2、およびMフェーズに相関するアクティブなサイクリング集団を表します。二重低母集団は、G0フェーズと相関する循環しない人口を表します。すべてのゲートが確立されたら、ゲートから数値をエクスポートします。各サイクルのパーセンテージは、結合された集団から単一の集団を差し引いて、後続のグラフ作成および統計分析のために個々の細胞周期フェーズの数値を生成することによって達成できます。一重項ゲートの確立は、細胞残骸およびダブレットを分離して単一細胞集団の単離を可能にするために重要である。次いで、単一細胞の細胞周期解析を行うことができる。IdU標識、したがって下流の細胞周期分析は、時間と温度によって大きく影響を受ける可能性があります。例えば、密閉された容器内または場所間の輸送中に長すぎる細胞は、S期画分が減少し、細胞周期分析には正確ではありません。1時間以下の短期間保持された細胞サンプルは、依然として正常な細胞周期分布を示しており、迅速な輸送が分析に悪影響を及ぼさない可能性があることを示しています。凍結保存された細胞は、細胞が活性細胞サイクルに戻るまでに長い平衡化期間を必要とする場合があり、これは依然として凍結保存前の細胞周期状態を反映していない可能性があります。異なる細胞タイプも、維持条件によって異なる影響を受ける可能性があります。例えば、このヒト骨髄サンプルでは、T細胞は同じサンプルからの単芽細胞と比較して細胞数の減少を示した。マスサイトメトリーのもう一つの利点は、細胞周期停止中の細胞や異常な細胞周期分布を有する細胞を識別できることです。この技術の主な利点は、表面表現型、クロマチン構造、細胞内サイトカイン刺激などの他の質量サイトメトリー測定と容易に互換性があり、細胞周期状態と相関させることができることである。この手法を使用して、免疫細胞の枯渇、老化を研究し、急性白血病患者の化学療法に対する反応が白血病細胞の細胞周期特性と相関する可能性があることを示しました。

use-pyrimidine-analog-5-iodo-2-deoxyuridine-idu-with-cell-cycle

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

我々は、細胞分裂の2つの連続ラウンドを定量化するために、成体マウスの組織へのチミジン類似体（CldUとIDU）のシーケンシャル取り込みを検出するための戦略を導出している。この戦略は、細胞の寿命の長い組織の売上高は、発癌性形質転換、またはトランジット増幅細胞を検出するのに便利です。...

一次組織の二つのチミジン類似体の免疫蛍光検出（CldUとIDU）

細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。...

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

細胞周期ステージの進行と動態の追跡微妙な変化は、BrdUとヨウ化プロピジウムを経由して全ゲノムDNAを染色した核酸の代謝標識の組み合わせの使用によって達成することができます。このメソッドは、それによって順番に細胞周期の進行に影響を及ぼす非特異的DNA損傷の導入を防止し、サイクリング細胞の化学物質の同期の必要がなくなります。...

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

このビデオでは、BrdU免疫蛍光染色のプロトコールについて説明しています。この技術により、細胞周期のさまざまな段階にある細胞を同定することができます。DNA色素の添加と抗体標識により、後のS期細胞の運命を詳細に分析することができます。...

BrdU免疫蛍光染色:細胞周期の異なる段階にある細胞を同定する技術

このビデオは、がん細胞の複製ストレスを定量化するための免疫蛍光ベースのアプローチを示しています。ヒドロキシ尿素処理細胞は、免疫蛍光法によって検出される一本鎖DNAを産生します。緑色の蛍光病巣の数は、がん細胞における複製ストレスのレベルを示しています。...

がん細胞における複製ストレスを定量するための免疫蛍光法

このプロトコルは、特定の時点でS期にあった細胞の時間的な追跡を可能にするために、ブロモデオキシウリジン（BrdUの）取り込みの使用が記載されています。 DNA色素と抗体標識の添加は、後の時点でS期細胞の運命の詳細な分析を容易にします。...

同期を必要とせずに、フローサイトメトリーを用いた細胞周期の進行の時間追跡

ここでは、(細胞周期)キナーゼのミトコンドリア局在を研究する方法と、その亜ミトコンドリア位置と潜在的なミトコンドリア基質/標的を決定する方法を概説します。タンパク質のミトコンドリアへの強制発現は、目的のタンパク質のミトコンドリア局在の機能的影響を研究するための有用なツールを提供します。...

ミトコンドリア局在と原子力細胞周期キナーゼ、Cdk1のの機能を研究するための実験的アプローチ

本プロトコールでは、細胞周期のS/G2期におけるDNA二本鎖末端切除を免疫蛍光ベースの方法を用いて可視化する方法を実証する。...

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。...

5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル

出芽酵母における5-エチニル-2'-デオキシウリジンの取り込みを用いたS期持続時間の決定

学ぶマスサイトメトリーによる単一細胞レベルの細胞周期解析法。IdUを直接添加する簡便な手法で、急性骨髄性白血病の幹細胞・前駆細胞区画における細胞周期状態を調査し、臨床転帰との相関を解明します。

ピリミジン類似体である5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)と細胞周期マーカーを使用して、マスサイトメトリープラットフォームで細胞周期相を確立します(英語)

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