Name: サルモネラ感染組織培養細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 学ぶNF-κBルシフェラーゼレポーター法によるSalmonella Typhimurium感染細胞での転写因子活性化と遺伝子発現の定量解析。ハイスループットスクリーニングが可能な信頼性の高い手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

キーストラ・ゴウンダー研究所での研究は、NIHのNIAIDから賞番号R21AI122092の助成金と、米国糖尿病協会からの賞番号1-18-JDF-035の助成金によって支えられています。

<ol><li>Liu, T., Zhang, L., Joo, D., Sun, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+signaling+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB signaling in inflammation.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 2, (2017).</li>
<li>Piva, R., Belardo, G., Santoro, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB%3A+a+stress-regulated+switch+for+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB: a stress-regulated switch for cell survival.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 8 (3-4), 478-486 (2006).</li>
<li>Lawrence, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nuclear+factor+NF-kappaB+pathway+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">The nuclear factor NF-kappaB pathway in inflammation.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (6), a001651(2009).</li>
<li>Hargett, D., Rice, S., Bachenheimer, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+ICP27-dependent+activation+of+NF-kappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 ICP27-dependent activation of NF-kappaB.</a> Journal of Virology. 80 (21), 10565-10578 (2006).</li>
<li>Zaragoza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+protease+cleavage+of+inhibitor+of+kappaBalpha+triggers+host+cell+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Viral protease cleavage of inhibitor of kappaBalpha triggers host cell apoptosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences United States of America. 103 (50), 19051-19056 (2006).</li>
<li>Gao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+effector+binding+to+ribosomal+protein+s3+subverts+NF-kappaB+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Bacterial effector binding to ribosomal protein s3 subverts NF-kappaB function.</a> PLOS Pathogens. 5 (12), e1000708(2009).</li>
<li>Kravchenko, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+gene+expression+via+disruption+of+NF-kappaB+signaling+by+a+bacterial+small+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Modulation of gene expression via disruption of NF-kappaB signaling by a bacterial small molecule.</a> Science. 321 (5886), 259-263 (2008).</li>
<li>Kawai, T., Akira, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+to+NF-kappaB+by+Toll-like+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Signaling to NF-kappaB by Toll-like receptors.</a> Trends in Molecular Medicine. 13 (11), 460-469 (2007).</li>
<li>Pinaud, L., Sansonetti, P. J., Phalipon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+Cell+Targeting+by+Enteropathogenic+Bacteria+T3SS+Effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Host Cell Targeting by Enteropathogenic Bacteria T3SS Effectors.</a> Trends in Microbiology. 26 (4), 266-283 (2018).</li>
<li>Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+NF-kappaB+is+activated%3A+the+role+of+the+IkappaB+kinase+%28IKK%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">How NF-kappaB is activated: the role of the IkappaB kinase (IKK) complex.</a> Oncogene. , (1999).</li>
<li>Berti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+RT-PCR+analysis+of+inflammatory+gene+expression+associated+with+ischemia-reperfusion+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time RT-PCR analysis of inflammatory gene expression associated with ischemia-reperfusion brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 22 (9), 1068-1079 (2002).</li>
<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li>
<li>Holden, N. S., Tacon, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+problems+of+the+electrophoretic+mobility+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 63 (1), 7-14 (2011).</li>
<li>Renard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Research. 29 (4), E21(2001).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39 (5), 715-725 (2005).</li>
<li>Ernst, O., Vayttaden, S. J., Fraser, I. D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+NF-kappaB+Activation+in+TLR-Activated+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measurement of NF-kappaB Activation in TLR-Activated Macrophages.</a> Methods in Molecular Biology. 1714, 67-78 (2018).</li>
<li>Rodriguez, M. S., Thompson, J., Hay, R. T., Dargemont, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retention+of+IkappaBalpha+protects+it+from+signal-induced+degradation+and+inhibits+nuclear+factor+kappaB+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear retention of IkappaBalpha protects it from signal-induced degradation and inhibits nuclear factor kappaB transcriptional activation.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (13), 9108-9115 (1999).</li>
<li>Mendez, J. M., Kolora, L. D., Lemon, J. S., Dupree, S. L., Keestra-Gounder, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+endoplasmic+reticulum+stress+response+impacts+the+NOD1+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Activation of the endoplasmic reticulum stress response impacts the NOD1 signaling pathway.</a> Infection and Immunity. , (2019).</li>
<li>Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aromatic-Dependent+Salmonella-Typhimurium+Are+Non-Virulent+and+Effective+as+Live+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aromatic-Dependent Salmonella-Typhimurium Are Non-Virulent and Effective as Live Vaccines.</a> Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).</li>
<li>Keestra, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+small+Rho+GTPases+is+a+pathogen-induced+process+detected+by+NOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1.</a> Nature. 496 (7444), 233-237 (2013).</li>
<li>Wong, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+characterization+of+NF-kappaB+binding+uncovers+non-canonical+motifs+and+advances+the+interpretation+of+genetic+functional+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Extensive characterization of NF-kappaB binding uncovers non-canonical motifs and advances the interpretation of genetic functional traits.</a> Genome Biology. 12 (7), R70(2011).</li>
<li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+mutants+as+sensors+of+proteome+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress.</a> Nature Methods. 8 (10), 879-884 (2011).</li>
<li>Cogswell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+regulates+IL-1+beta+transcription+through+a+consensus+NF-kappa+B+binding+site+and+a+nonconsensus+CRE-like+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B regulates IL-1 beta transcription through a consensus NF-kappa B binding site and a nonconsensus CRE-like site.</a> Journal of Immunology. 153 (2), 712-723 (1994).</li>
<li>Thornberry, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Heterodimeric+Cysteine+Protease+Is+Required+for+Interleukin-1-Beta+Processing+in+Monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Novel Heterodimeric Cysteine Protease Is Required for Interleukin-1-Beta Processing in Monocytes.</a> Nature. 356 (6372), 768-774 (1992).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

記載されているプロトコルの主な貢献は、細胞内のNF-κB活性化を検出する迅速かつ容易な方法を提供し、NF-κB活性化に影響を与える複数の刺激条件または薬物の高スループット分析を可能にすることです。ここでは、サルモネラ菌感染HeLa細胞におけるNF-κB活性化のためのプロトコルについて説明する。これらの細胞は、他の病原体との感染に使用して、NF-κB活性化に対する細菌感染の影響を研究することができる。さらに、HeLa 57A細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化は、NF-κB活性化につながるシグナル伝達経路の活性化または阻害剤のスクリーニングに使用することができる。ここでは、HeLa 57A細胞を48ウェルプレートに播種しますが、これらの実験は96~384ウェルプレートまでスケールアップし、実験あたりのサンプル数を増やすことができます。HeLa 57A細胞はLacZを構成的に発現し、β-galアッセイを用いて細胞数および生存率の内部制御として測定することができる。ここで説明するプロトコルは、NF-κB::luciferaseレポーター構築物で安定または一過性にトランスフェクトされた細胞株での使用に適用可能である...

タンパク質の核因子-κB(NF-κB)ファミリーは、様々な生物学的経路における遺伝子発現を調節する重要な転写活性化剤である。NF-κBの活性化は、標的遺伝子の転写を誘導し、その多くは免疫および炎症反応、細胞増殖、ストレス応答および癌進行に重要である。NF-κBは、病原体クリアランスのための早期炎症結果を媒取する上で不可欠な役割を果たす。NF-κB活性化によって媒介される多くの生物学的プロセスを考えると、そのシグナル伝達の中断は健康および病気に重大な影響を及ぼす可能性がある。NF-κBシグナル伝達における機能変異の喪失は、いくつかの免疫欠乏表現型に関連しているが、機能変異の獲得は、B細胞リンパ腫および乳癌3を含むいくつかのタイプの癌と関連している。さらに、多くの病原体は、毒性因子4、5、6、7の発現を介してNF−κBの活性化状態を直接調節することが示されている。
NF-κBの活性化は、リポ多糖(LPS)、フラグエリンおよびペプチドグリカン(PamPs)として知られている細菌産物を含む多くの可変刺激の結果であることが知られている。これらのPAMPは、NF-κBの活性化およびNF-κB依存性炎症遺伝子8の配列のその後の発現につながるトール様受容体(TR)およびノッド様受容体(NR)などのパターン認識受容体(PRR)によって検出される。PamPsによるPRR活性化に加えて、細菌エフェクタータンパク質などの他の細菌産物は、NF−κBの活性化を誘導し得る。興味深いことに、細菌はまた、NF−κB経路を積極的に減衰し、その病原性を増強するエフェクタータンパク質を発現し、免疫の必須メディエーターとしてNF-κBの重要性を強調する9。
NF-κBダイマーを形成する5つの異なるサブユニットがあります。p50, p52, RelA (p65), RelB および cRel.2つの主要なNF-κBヘテロダイマーはp50:RelAおよびp52:RelBダイマーである。活性化されたNF-κBダイマーは、κB部位として知られるDNA部位に、種々の標的遺伝子のプロモーターおよびエンハンサー領域において結合する。正常な恒常性条件下では、NF-κBはIκBタンパク質として知られている阻害剤タンパク質のファミリーと相互作用し、不活性なままである。刺激の際、IκBはIκBキナーゼ(IKK)によってリン酸化され、ユビキチン化の標的となり、その後の分解を可能にする。IκBの分解は、核局在化信号を明らかにすることによりNF−κBを活性化する。NF-κBは次いで核に転移し、そこで標的遺伝子のプロモーター領域におけるκB部位を結合し、転写10を促進する。従って、NF-κBの活性化は、NF−κB標的遺伝子のmRNA発現をアップレギュレートし、そしてこの変化はRT-qPCR11などのRNA定量アッセイを通じて測定することができる。
電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、核転座、遺伝子レポーターアッセイなど、NF-κB活性化の測定には、いくつかの方法が存在し、一般的に使用されています。EMSAは、核酸を含むタンパク質複合体を検出するために使用されます。刺激された細胞は、転移したNF-κBを含む核タンパク質を単離するために分画され、その後、NF−κB結合ドメインを含む放射性標識ヌクレオチドでインキュベートされる。サンプルはゲル上で実行され、32P標識核酸の自己放射線撮影によって画像化される。NF-κBがタンパク質画分中に存在する場合、ヌクレオチドは結合し、これはゲルを通してゆっくりと移行し、離散バンドとして存在する。活性化NF-κBを欠く細胞の核分率(例えば、非刺激制御細胞)は、ヌクレオチドがゲルの末端まで速く移行するにつれてバンドを産生しない。この方法の主な欠点は、バイナリーセンス(すなわち、オンまたはオフ)で大部分が定量的であり、NF-κB結合容量の有意な差異を適切に捕捉しないことです。さらに、この方法は、NF−κB標的遺伝子12、13に対して機能的に重要なクロマチン構造を考慮しない。
前の方法と同様に、マルチウェルプレートがNF−κB結合配列を含むヌクレオチドで被覆される「非シフト」アッセイがある。タンパク質の核画分を有する細胞の治療に続いて、NF−κBはウェルに結合したヌクレオチドに結合する。次いで、抗NF-κB抗体が添加され、結合したNF-κBと相互作用し、NF-κBの量に比例した比色シグナルを生成し、NF−κB活性化の程度を示す。この方法は、放射線標識核酸を必要とせず定量的であるという問題でEMSAよりも有利であり、比較して。しかしながら、この方法の注意点は、再びNF−κB標的遺伝子14のクロマチン状態を区別しないことである。
NF-κB活性化が検出され得る別の方法は、クロマチン免疫沈降(ChIP)によるものであり、それによってDNAおよび相互作用タンパク質はホルムアルデヒドと架橋され、特異的な抗NF−κB抗体と免疫沈殿される。その後、特定のヌクレオチド断片を精製し、PCR増幅または直接高スループットシーケンシングを介して同定される。この方法から生成された結果は、標的遺伝子とのNF−κB結合活性の半定量的結果を提供する。しかしながら、結果は各ステップ15における固定条件および精製プロセスに大きく依存する。
核転座アッセイでは、細胞が刺激されNF-κB活性化を誘導し、次いで固定される。抗p65抗体は固定細胞に添加される。あるいは、p65サブユニット自体は、緑色蛍光緑色(GFP)などの蛍光ペプチドでタグ付けすることができる。いずれの場合も、免疫蛍光は、p65の局在化のイメージングを可能にし、細胞分布を決定する。細胞質および核局在タンパク質の割合を測定することにより、研究者はNF−κBの相対的活性化状態を決定することができる。この方法の欠点は、免疫蛍光が比較的時間がかかり、高価な抗体を必要とし、比較的大きな技術的専門知識を必要とすることである。
レポーター遺伝子は、目的の遺伝子の調節パターンおよび発現パターンを研究するために一般的に使用されるツールです。典型的には、レポーター遺伝子は、容易に検出可能なタンパク質をコードする遺伝子に融合された目的遺伝子のプロモーター配列から構築される。酵素活性、蛍光、または発光特性を有するタンパク質は、一般的にアッセイおよび定量化する能力のために選択される。したがって、読み出し(例えば、発光、蛍光)は、遺伝子発現の検出のためのシグナルとして機能する。これらのレポーター構築物は、上皮細胞またはマクロファージなどの異なる細胞型に導入することができる。
プロトコルに記載されているのは、免疫グロブリンκ鎖プロモーター領域17のκBコンセンサスの3つのコピーを含むルシフェラーゼレポーターで安定にトランスフェクトされたクローンHeLa細胞株(HeLa 57A)の使用である。ルシフェラーゼの発現は、細胞刺激の後に生じるNF-κBの活性化に依存する。刺激された細胞は、ルシフェラーゼアッセイキットに設けられた細胞リシス緩衝液を用いて容易にリンパがされる。次いで、細胞リサートの一部をルシフェリンを含むルシフェラーゼアッセイバッファーと混合する。ルシフェリンはルシフェラーゼの基質であり、ルシフェラーゼの存在下で光を生成するために必要とされる。アッセイバッファーと溶解物を組み合わせた後、溶液は発光と呼ばれるプロセスで光を放出する。生成される光の量は、ルーメンで与えられ、溶解物中に存在するルシフェラーゼの量に比例し、NF−κB活性化の尺度として機能する。ルーメンの読み取り値は、ベースラインNF-κB活性を考慮して非刺激標準と比較して解釈され、信号自体は信頼性の高い測定を可能にするために数分間安定しています。さらに、HeLa 57A細胞株は、NF-κB非依存型βガラクトシダーゼレポーターで安定にトランスフェクトされる。β-ガラクトシダーゼレポーターは構成的に発現され、β-ガラクトシダーゼ活性は、細胞生存率または細胞数17の変動を制御するために測定することができる。ルシフェラーゼ値は、β-ガラクトシダーゼ値に調整し、刺激されない対照細胞のフォールド増加として報告することができる。
NF-κBはNF-κB依存性標的遺伝子の発現増加を担う転写因子であるため、NF-κB依存性増加遺伝子発現を制御するフォローアップ実験は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)。RT-qPCRは、遺伝子発現の変化を数桁にわたって定量することができる高感度な方法です。刺激および対照細胞は、フェノールクロロホルム抽出を介してRNAのために収穫される。相分離の後、RNAは水層の主要成分として抽出される。その後、RNAを沈殿させて洗浄し、純粋なペレットを作製する。このペレットは、DNase処理を介して再構成され、さらに汚染物質DNAを洗浄します。次に、純粋な RNA を逆転写して相補的な DNA (cDNA) を作成します。このcDNAは、特定のmRNA配列の豊富さを定量化して遺伝子発現を決定する定量的PCR技術を通じて分析することができる。この技術は、翻訳制御、翻訳後修飾、タンパク質の存在量、またはタンパク質活性を解明しません。しかしながら、多くの遺伝子、特に炎症前プロセスに関与する遺伝子は、NF-κBを介して調節され、そのmRNAの存在量は、その発現を示す。
ここで提案される方法は、NF-κB活性化が細胞溶解物の発光アッセイを介して検出され得る迅速かつ簡単な方法を利用する。NF-κB標的遺伝子発現のRT-qPCRは、特定の遺伝子の発現を定量化し、NF−κB活性化の機能活性を検証するために使用することができる。このようなシステムの主な利点は、NF-κB活性化を調節する条件の範囲の高スループットスクリーニングを可能にする、そのシンプルさと速度です。このプロトコルは、NF−κB::ルシフェラーゼレポーターを発現する他の細胞株に適しており、かつ安定にトランスフェクトされたRAW264.7細胞18において実証されている。細胞溶解から発光信号の生成まで、サンプルの処理に要する時間は最小限で、約1時間のスパンを要します。NF-κBの測定には、不透明プレートなどの基本的な実験装置、発光を測定できるプレートリーダー、スプレッドシートプログラムなどの単純なデータ解析ソフトウェアのみが必要です。

<table><tbody><tr><td>粘着フィルム</td><td>VWR インターナショナル</td><td>60941-070</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>C298-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11665092</td><td></td></tr><tr><td>DNAse 治療キット</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>プロメガ</td><td>U1511</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP2818100</td><td>分子グレード</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 57A 細胞</td><td></td><td></td><td>Ref # 15</td></tr><tr><td>大容量 cDNA 逆転写キット</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td> フィ<td>ッシャーバイオ試薬</td><td>BP1425-500</td><td></td></tr><tr><td>リソジェニーブロス</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fisher Chemical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td>分光光度計</td></tr><tr><td>プロメガ ルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>プロメガ</td><td>E1501</td><td>細胞溶解バッファー & ルシフェリン基質</td></tr><tr><td>ランダムヘキサマー</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>リアルタイム GAPDH フォワードプライマー</td><td></td><td></td><td>5'-CCAGGAAATGAGCTTGAC AAAGT-3'</td></tr><tr><td>リアルタイム GAPDH リバースプライマー</td><td></td><td></td><td>5-'CCCACTCCTCCACCT TTGAC-3'</td></tr><tr><td>リアルタイム IL-23 フォワードプライマー</td><td></td><td></td><td>5-'GAGCCTTCTCTGCTCCC TGAT-3'</td></tr><tr><td>リアルタイムIL-23 リバースプライマー</td><td></td><td></td><td>5'-AGTTGGCTGAGGCCCAGTAG-3'</td></tr><tr><td>リアルタイム IL-6 フォワードプライマー</td><td></td><td></td><td>5'-GTAGCCGCCCCACACACAGA-3'</td></tr><tr><td>リアルタイム IL-6 リバースプライマー</td><td></td><td></td><td>5'-CATGTCTCCTTTCTCAGG GCTG-3'</td></tr><tr><td>リバース トランススクリプトアーゼ</td><td>Applied Biosystems</td><td>4308228</td><td></td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Thermo科学</td>的な<td>EO0381</td><td></td></tr><tr><td>RTの緩衝材</td><td>Promega</td><td>A3561</td><td></td></tr><tr><td>SL1344</td><td></td><td></td><td>Ref #17</td></tr><tr><td>SL1344 &Delta;sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039</td><td></td><td></td><td>Ref # 18</td></tr><tr><td>SL1344 &Delta;sopE&デルタ;sipA sopB::MudJ sopE2::p SB1039</td><td></td><td></td><td>Ref # 18</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Applied Biosystems</td><td>4309155</td><td>2x mastermix</td></tr><tr><td>Tri-reagent</td><td>Molecular Research Center</td><td>TR 118</td><td>グアニジンチオシアン酸</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>25300054</td><td>0.05% トリプシン-EDTA</td></tr><tr><td>超純水</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td></td><td></td></tr><tr>PCR <td>VWR International</td><td>89218-294</td><td>384ウェルプレート</td><td>用BP248450ウェルプレート</td></tr></tbody></table>

サルモネラ感染組織培養細胞におけるnf-κb依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量

NF-&#954;B-dependent Luciferase Activation and Quantification of Gene Expression in Salmonella Infected Tissue Culture Cells

二量体転写因子NF-κBは、種々のサイトカインおよびケモカインの発現を誘導することによって炎症経路を含む多くの細胞応答経路を調節する。NF-κBは、B細胞阻害剤におけるカッパ光ポリペプチド遺伝子増強剤の阻害性タンパク質核因子によって細胞内で構成的に発現され、隔離される、α(IκBα)である。NF-κBの活性化は、IκBαの分解を必要とし、その後、NF-κB上で核局在化信号を露出させ、核へのその入稿を促進する。いったん核内に入ると、NF−κBはインターロイキン6(IL-6)およびIL-23などのNF−κB標的遺伝子のプロモーター領域に結合し、それらの発現を促進する。
NF-κBの活性化は、転写または翻訳とは独立して起こる。したがって、NF-κBの活性化状態は、核内で特異的にNF-κBを定量するか、またはNF-κB標的遺伝子の発現を定量することによって測定されなければならない。このプロトコルでは、NF-κB::ルシフェラーゼレポーター構築物で安定にトランスフェクトされた細胞は、in vitro組織培養技術を用いてNF−κB活性化のためにアッセイされる。これらの細胞はサルモネラ・チフィムリウムに感染してNF-κBを活性化し、核に入り込み、ルシフェラーゼのプロモーター領域のκB部位に結合し、その発現を誘導する。細胞はルシフェラーゼアッセイシステムでリゼし、分析される。細胞によって産生されるルシフェラーゼの量は、プレートリーダーによって検出される発光信号の強度と相関する。この手順によって生成される発光信号は、様々な条件下でNF-κB活性化を評価するための迅速かつ高感度な方法を提供します。このプロトコルはまた、遺伝子発現を示す相対mRNAレベルを検出するために定量的逆転写PCR(RT-qPCR)を利用する。

ここで説明するアッセイは、HeLa細胞のラインに安定にトランスフェクトされるNF-κB依存性ルシフェラーゼレポーターを用いた転写因子NF-κBの活性化に焦点を当てている。活性化されたNF-κBは、炎症性サイトカインIL6およびIL23を含む標的遺伝子のκB結合部位に結合する核に転移する。NF-κB 活性化の概要を図 1に示します。この研究では、NF-κBの活性化剤として、IL6の後方発現として、グラム陰性サルモネラ菌性セロバル・チピムリウムを用いた(図2)。病因に必要な主な毒性因子の1つは、Sを可能にするタイプIII分泌システム-1(T3SS-1)です。細胞に感染し、NF-κB活性化を誘導するチフィム尿。T3SS-1の機能は、細菌タンパク質、エフェクターと呼ばれ、宿主細胞に送り込むことです。ここでエフェクタータンパク質は、宿主上皮細胞の浸潤を媒介する多数の細胞シグナ...

ここでは、NF-κB::ルシフェラーゼレポーター構築物を発現する細胞株における活性化B細胞(NF-κB)の核因子カッパ軽鎖増強剤を迅速かつ容易に測定するプロトコルを提示し、細胞溶解物中の発光の測定を行う。さらに、遺伝子発現は、サルモネラ・チフィムリウムに感染した細胞から単離されたRT-qPCRを介して決定される。

サルモネラ感染組織培養細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量

The dimeric transcription factor NF-&#954;B regulates many cellular response pathways, including inflammatory pathways by inducing the expression of ...

このプロトコルは、NF-κ-Bルシファーゼレポーターを発現する細胞におけるNF-κ-B活性化の変化を決定するのに有用である。この技術の主な利点は、NF-kappa-B活性化の変化につながる要因または条件のハイスループットスクリーンを可能にすることです。NF-κ-Bは、多種多様な細胞プロセスの転写因子である。NF-κ-Bの周知の機能は、様々なサイトカインおよびケモカインの発現を誘導することによって炎症反応の誘導にある。私たちの研究室は、特に、サルモネラ菌の腸炎によって誘導されるNF-κ-Bの誘導に関心を持っています。ここでは、NF-κ-Bルシファーゼレポータープラスミドと安定してトランスフェクションされるHeLa細胞株を用います。他の細菌、あるいはウイルスまたは化学化合物も、この細胞株中でNF-κ-Bの活性化を研究するために使用することができる。他の細胞株は、その細胞株中にこのようなNF-κ-Bルシファーゼレポータープラスミドを導入することができる場合にも使用することができる。これを初めて行う人は、細胞培養や細菌の仕事に必要な無菌技術を適切に利用する問題があるかもしれません。細胞刺激の1日前に、約75%の合流度に成長したHeLa57A細胞の増殖培地を除去する。0.05%トリプシンEDTAの1ミリリットルで細胞を洗浄します。別のミリリットルのトリプシンEDTAに交換し、フラスコを37°Cのインキュベーターに5分間移します。細胞がフラスコから切り離された後、10ミリリットルの増殖培地に懸濁させる。セルサスペンション10マイクロリットルとトリパンブルーの10マイクロリットルを組み合わせ、ピペットを上下に混ぜ合わせ、セルカウンタースライドに10マイクロリットルを移します。細胞カウンターを使用して懸濁液中の細胞を数え、増殖培地を使用して、50ミリリットルの円錐管で1ミリリットル当たり5個の細胞に2.5倍の濃度に細胞を希釈する。48ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液の250マイクロリットルを移します。均質な細胞懸濁液を確保するために、定期的にコニカルチューブをキャップしてひっくり返します。プレートを側面にそっとタップして、ウェル内で細胞が均一に分配されるようにします。5%の二酸化炭素インキュベーターでプレートを摂氏37度に移し、細胞が一晩で付着して成長できるようにします。単一のコロニーを生成するためにLB寒天プレートにサルモネラ菌のストリーク冷凍ストック。プレートを摂氏37度に設定したインキュベーターに移し、一晩の成長を可能にします。翌日、無菌細菌培養チューブにLBを3ミリリットル加え、適切な抗生物質を培地に添加する。滅菌接種ループを使用して、縞模様の細菌培養物から単一のコロニーを選び、ループをLB培地に触れる。接種後にチューブをキャップし、ループを捨てます。37°Cと180 RPMに設定された振る振るインキュベーターにチューブを入れ、細菌が一晩成長できるようにします。午前中、インキュベーターから一晩細菌培養物を回収する。新鮮なLBと抗生物質の3ミリリットルを追加することにより、サブカルチャーのためのチューブを準備します。一晩細菌培養物の30マイクロリットルを作りたての培地に移す。37°Cに設定された揺れるインキュベーターに3時間チューブを入れます。3時間のインキュベーションの後、無菌LBスープの1ミリリットルをプラスチックキュベットに移してブランクとして機能させます。900マイクロリットルのLBを他のキュベットに移し、サンプル分析に使用します。100マイクロリットルの細菌サブカルチャーを900マイクロリットルのLBを含むキュベットに移し、ピペットを数回上下に混合します。細菌懸濁液ごとにこれを繰り返します。分光光度計をオンにして、600ナノメートルの波長で細菌培養物の光学密度を測定します。分光光度計にブランクを入れる。方向を書き留めます。蓋を閉じ、分光光度計の空白のボタンを押して、背景吸光度を得ます。ブランクキュベットを同じ向きのサンプルキュベットに置き換え、Read を押します。これらのサンプルの OD600 値を記録します。希釈係数を考慮するために、値に 10 を掛けます。懸濁液をキュベットで1〜10に希釈し、吸光度を測定し、ミリリットル当たり10倍の10倍に相当する約0.1の値を与える必要があります。新しいチューブでは、希釈されたサブカルチャーの適切な量を新鮮なLBに加え、接種物として使用される1ミリリットル当たり8 CFUに10倍の懸濁液を達成する。50マイクロリットルの細菌懸濁液を、1ミリリットル当たり約100CFUの最終的な希釈がなされるまで、450マイクロリットルの無菌PBSを含むチューブに移すことによって、接種物の連続希釈を調製する。2つの最も低い希釈液の100マイクロリットルを、1ミリリットル当たり100と1000 CFU、2つのLB寒天プレートに移し、セルスプレッダーで懸濁液を広げて単一コロニーを得る。これらのプレートを摂氏37度のインキュベーターに移し、一晩インキュベートします。翌日、コロニーを数え、初期接種の細菌濃度を計算して、実際の接種濃度を決定します。同じ日に、各ウェルに使用される感染条件に応じてプレートの蓋にラベルを付け、各状態は三重で行われます。適切な井戸に接種物の10マイクロリットルを追加し、無感染制御井戸に無菌LBの10マイクロリットルを追加します。感染時間を同期させるには、プレートを卓上遠心分離機に入れ、500倍Gで5分間回転し、プレートのバランスが取れなくて済みます。その後、感染した細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素インキュベーターに1時間移す。次のステップで使用するために、細胞培養培地のアリコートを含む15ミリリットルの円錐管を摂氏37度の水浴に入れます。感染後1時間、細胞培養培地を含む15ミリリットルの円錐チューブを水浴から取り出し、70%エタノールで外装を拭く。培養器からバイオセーフティキャビネットに組織培養プレートを移します。ウェルから培地を吸引し、新鮮な温かい細胞培養培地の250マイクロリットルに置き換えるために無菌のヒントを使用してください。さらに4時間、37°Cで5%の二酸化炭素インキュベーターにプレートを戻します。その後、二酸化炭素インキュベーターからプレートを取り出し、ウェルから培地を吸引する。ルシファーゼ分析のために、1X細胞のライシスバッファーの100マイクロリットルをウェルに加えます。プレートをマイナス80°Cの冷凍庫に移し、少なくとも30分間インキュベートして効率的な細胞リシスを確保します。次に、凍結した細胞のライセートを含むプレートをベンチに置いて解凍し、メーカーの推奨に従ってルシファーゼの基質試薬を調製します。ルシファーゼ基質試薬を室温に平衡化させます。次に、プレートリーダーをオンにして、対応するリーダープログラムを開きます。発光を測定する機械を設定します。各細胞の10マイクロリットルを不透明な96ウェルプレートのウェルに移します。マルチチャンネルピペットを使用して、不透明板の各ウェルに50マイクロリットルのルシファーゼアッセイ試薬を加える。側面のプレートを軽くタップして井戸を混ぜ、底面が液体で覆われているようにします。プレートリーダーにプレートを置き、読み取りを開始します。ルミネセンス値をスプレッドシートプログラムにコピーし、結果をプロットします。このプロトコルは、HeLa細胞のラインに安定的にトランスフェクトされるNF-κ-B依存性ルシファーゼレポーターを用いた転写因子NF-κ-Bの活性化に焦点を当てています。本図は、サルモネラ菌に感染したHeLA 57A細胞におけるNF-κ-B依存性ルシファーゼ活性化およびIL6遺伝子発現の代表的な実験を示す。野生型SL1344株の感染は、RLUおよびIL6発現の両方で強力なルシファーゼシグナルを誘発し、これはsipA sopB sopE2トリプル突然変異体に感染した細胞で減少し、sipA sopB sopE2 sopE2 sopE 4倍量突然変異体で制御レベルに低下した。シリアル希釈やめっきをする際には細心の注意を払ってください。これにより、あなたの株全体で一貫した接種を持っていることを保証します。MRNA発現のNF-κ-B活性化および下流変化に寄与する因子を同定した後、ウェスタンブロット法を用いてタンパク質発現の変化を同定することができる。このプロトコルにより、サルモネラ菌によって誘導されるNF-κ-B活性化だけでなく、NF-kappa-B活性化に関与する他の化合物およびタンパク質を評価することができました。サルモネラ菌はヒト病原体である。これらの細菌を使用する場合は、適切なPPEを使用してください。

nf-b-dependent-luciferase-activation-quantification-gene-expression

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここで、我々はプロメガからデュアルGloTMルシフェラーゼアッセイシステムを用いてルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子のアプローチで貪食誘導性遺伝子発現の変化を研究するための手順について説明します。...

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイで膜の生合成を研究して

生きている動物における細菌感染症の生物発光イメージングのための方法が説明されています。病原体は、生きた動物における感染症の光学全身イメージングを可能にルシフェラーゼを発現するように変更されます。動物モデルは、ルシフェラーゼを発現する病原体に感染し、病気の結果として得られるコースは、生物発光イメージングによってリアルタイムに可視化することができます。...

マウスでイメージ細菌感染にルシフェラーゼを用いた

このビデオでは、組換えルシフェラーゼと蛍光タンパク質発現バイレポーターのインフルエンザAウイルスを使用して、マウスモデルでウイルス感染を追跡する方法を示します。この方法により、in vivo と ex vivo...

ウイルス感染を追跡するためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

我々は、高スループットのロボットのトランスフェクションと自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを使用して転写調節因子を同定するための迅速で安価なスクリーニング法を提示する。このプロトコルは、急速に数千の遺伝子のための直接のサイド·バイ·サイド機能データを生成し、目的の任意の遺伝子をターゲットに簡単に変更可能です。...

自家製デュアルグロールシフェラーゼアッセイを用いて、ハイスループット機能スクリーニング

細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。...

培養細胞における癌関連シグナル伝達を問い合わせるための多重ルシフェラーゼベースのスクリーニング·プラットフォーム

モデル生物Caenorhabditis elegansにおけるミトコンドリア阻害剤の影響のin...

スクリーニング可能<em&gt;インビボ</em&gt;トランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

腸管出血性発光標識細菌によるエシェリヒア属大腸菌(EHEC) の植民地化のためのマウスモデルの詳細なプロトコルが表示されます。非侵襲的生体内でイメージ投射生きている動物のシステムによってこれらの発光細菌の検出は、EHEC...

非侵襲体内生物発光システムによってマウスのホストである腸管出血性大腸菌の植民地化の検出

本稿では、ルシフェラーゼ活性の測定に基づく蛋白質蛋白質の相互作用を決定するための簡単かつ迅速な実験手順について説明します。...

ベンサミアーナ タバコ葉蛋白質蛋白質の相互作用ダイナミクスの一過性の決定のための試金補完ルシフェラーゼ イメージング

ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

インフルエンザA型ウイルス(IAV)は、毎年の流行や時折のパンデミックを引き起こす伝染性呼吸器病原体です。ここでは、新規組換えルシフェラーゼおよび蛍光発現バイレポーターIAV(BIRFLU)を用いて生体内のウイルス感染を追跡するプロトコルについて説明する。このアプローチは、研究者に生体内でIAVを研究するための優れたツールを提供します。...

ウイルス感染のライブイメージングと定量化のためのルシフェラーゼ蛍光レポーターインフルエンザウイルス

神経幹/前駆細胞は、細胞イベントの異なる結果につながるノッチシグナル伝達成分の様々な発現ダイナミクスを示す。このような動的発現は、遺伝子発現の急速な変化の可視化を可能にする高感度生物発光イメージングシステムを用いて、静的解析ではなくリアルタイムモニタリングによって明らかにすることができる。...

マウス神経新生時のノッチシグナル伝達ダイナミクスのリアルタイム生物発光イメージング

学ぶNF-κBルシフェラーゼレポーター法によるSalmonella Typhimurium感染細胞での転写因子活性化と遺伝子発現の定量解析。ハイスループットスクリーニングが可能な信頼性の高い手法です。

サルモネラ感染組織培養細胞におけるNF-κB依存性ルシフェラーゼ活性化と遺伝子発現の定量

さらに動画を探す