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中性子活性化解析(NAA)を支援したTAMUの化学部門の元素分析ラボに所属するブライアン・E・トムリン博士に感謝します。

1. ポリカプロラシロントリアクリル(PCLTA)合成
<ol><li>400ダポリカプロラシロン(PCL)の3.2mLを、オープン200mLラウンドボトムフラスコで50°Cで一晩乾燥し、90°CのガラスバイアルでK2CO3を乾燥させた。</li>
	<li>トリオールをジクロロメタン(DCM)6.4 mL、炭酸カリウム4.246g(K2CO3)をアル2ゴン下で混ぜます。</li>
	<li>27.2 mLのDCMに2.72mLの塩化アクリルを混ぜ、5分以上フラスコ中の反応混合物に滴下します。</li>
	<li>反応混合物をアルミホイルで覆い、アルゴンの下で24時間室温で乱さないままにしておきます。</li>
	<li>24時間後、真空下でブフナー漏斗上のフィルターペーパーを用いて反応混合物を濾過し、過剰な試薬を廃棄する。</li>
	<li>ジエチルエーテルの末端ポリマーを1:3(vol/vol)に含むステップ1.5からの濾液を沈殿させ、30°Cでロトバペを除去し、ジエチルエーテルを除去した。</li>
</ol>2. ポリバブルの形成
注:脱イオン(DI)水にポリマーを注入すると、ポリバブルがバイアルの底に移動し、底部が平坦化されます。ポリバブルの平坦化を避けるために、代わりに10%(wt/vol)カルボキシメチルセルロース(CMC)を使用してガラスバイアルを充填してください。
<ol><li>DI水に10%(重量/体積)CMC溶液を調製します。</li>
	<li>1 mL のトランスファーパイプを使用して 0.8 mL の 10% CMC で 0.92 mL ガラスバイアルを充填します。</li>
	<li>1000 mg/mLの14 kDa PCLをDCMに混合し、PCLTAを1:3(vol/vol)で合成して全容量2000μLで5kDaポリ(乳酸コグリコール酸)の2000mg/mLを調製し、クロホルムでジウリル(PLGADA)を調製します。</li>
	<li>2-ヒドロキシ-4'(2-ヒドロキシエトキシ)-2-メチルプロピオフェノン(光基質刺激体)を0.005:1(vol/vol)のポリマー(PLGADAまたはPCL/PCLTA)混合物と混ぜます。</li>
	<li>200 μL のポリマー混合物を、内径 0.016 インチの分配ステンレス鋼管に接続されたシリンジポンプに取り付けられた 1 mL ガラスシリンジに積み込みます。</li>
	<li>マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前進と後方の動きを制御し、ポリマーをガラスバイアル内の10%CMCに注入してポリバブルを形成します。</li>
	<li>2 W/cm 2で60 sの254 nm波長で紫外線(UV)下で2ポリバブルを治す。</li>
	<li>フラッシュは液体窒素中のポリバブルを凍結し、0.010 mBar真空で-85 °Cで一晩凍結乾燥します。</li>
	<li>ポリバブルを鉗子で乾燥したCMCから分離し、残留CMCを除去するためにDI水でポリバブルを洗浄する。なお、他のポリマーは、放出動態を改変する改変を伴って使用される可能性が高い。</li>
</ol>3. ポリバブル径の変調
<ol><li>1 mL のトランスファーパイプを使用して、0.92 mL ガラスバイアルに 10% CMC を充填します。</li>
	<li>PCL/PCLTAを1:3(vol/vol)に1000mg/mL 14kDa PCLと混ぜ合わせ、PCLTAを合成します。0.005:1 (vol/vol) で重合体混合物とフォトイチエーターを混合します。</li>
	<li>ポリマー混合物を、0.016インチの内径の分配ステンレス鋼管に接続されたシリンジポンプに取り付けられた1mLガラスシリンジにロードします。</li>
	<li>マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前進と後方の動きを制御し、ポリマーをガラスバイアル内の10%CMCに注入してポリバブルを形成します。</li>
	<li>さまざまな直径のポリバブルを得るためには、0.0005から1 μL/sの範囲の分配率を変える。</li>
	<li>様々な直径を持つポリバブルとバイアルの画像を撮ります。</li>
	<li>ImageJ を使用してポリバブルの直径を定量化し、バイアルのサイズをスケールとして使用します。</li>
</ol>4. ポリバブル内の貨物をセンタリング
<ol><li>
K2CO3を用いたPCL/PCLTA粘度の変調: 注:PLGADAの粘度は、1000 mg/mLで5 kDa PLAGDAの粘度が貨物をセンタリングするのに十分であるため、K2CO3を使用して変更する必要はありません。<ol>
<li>0 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL、および60 mg/mLを含む様々な濃度で、PCLTAにK2CO3(PCLTA反応後に単離された)を加えます。</li>
		<li>レオメトリーを使用してせん断速度を0から1000 1/sに変更して、溶液の動的粘度を測定します。</li>
		<li>K2CO3の異なる濃度のPCL/PCLTA溶液を使用して形成されたポリバブルの途中で貨物を手動で注入します(ステップ4.1.1)。ステップ4.1.1からどの溶液が貨物の中央に保持をもたらすかを観察することによって、K2CO3の最適な濃度を決定する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
CMCを使用した貨物の中心(既に小分子での実現可能性を示している)
	<ol>
<li>貨物の粘度を上げるために、一晩、回転器で5%(wt/vol)CMCと貨物を混合します。</li>
		<li>手動でポリバブルに2μLの貨物混合物を注入し、2 W/cm2で60 sの254 nm波長でUV硬化を進めます。</li>
		<li>フラッシュは、液体窒素中のポリバブルを30sのために凍結し、0.010 mBar真空で-85°Cで一晩凍結乾燥します。</li>
		<li>ポリバブルを鉗子で乾燥したCMCから分離し、任意の残留CMCを除去するためにDI水で洗浄する。</li>
		<li>ポリバブルを半分に切り、コンフォーカル顕微鏡を使用して半分を画像化して貨物が中央に配置されるようにします(励起波長と発光波長を使用する場合はステップ6を参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 貨物製剤
注:ポリバブル製剤は、小分子、タンパク質、核酸を含む様々な貨物タイプを収容することができます。
<ol><li>これまでの研究に基づき、タンパク質貨物の場合、ポリエチレングリコール(PEG)6、ポリビニルピ6ロリドン(PVP)、および糖ポリマー6を含む賦形剤を使用して、ポリバブル製剤中のタンパク質の安定性を向上させる。</li>
	<li>ステップ 2 のプロトコルに基づいてポリバブルを形成します。</li>
	<li>17.11 gのトレハロースを625 μLのHIV gp120/41抗原に添加して、抗原溶液を調製します。</li>
	<li>ポリバブルの中央に1μLの抗原溶液を手動で注入します。</li>
	<li>0日目、7日目、14日目、21日目にポリバブルを開き、励起波長と発光波長497nm、520nmの抗原の蛍光をそれぞれ記録する。</li>
	<li>酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて抗原の機能を決定し、5%ノンファットミルクをブロッキングバッファーとして使用します。</li>
</ol>6. 貨物の解放
注:小分子や抗原は、貨物タイプとして使用することができます
<ol><li>
小分子
	<ol>
<li>37°Cのリン酸緩衝塩(PBS)の400 μL、PLGADAポリバブルの場合は50°C、PCL/PCLTAポリバブルでは37°C、50°C、70°Cでアクリフラビンを中心としたポリバブルをインキュベートします。 注: 体温以上のテストを推奨する理由は、pCL および PLGA 内で金ナノロッド (AuNRs) をレーザー加工しながらポリバブルが到達する温度 (50 °C) をシミュレートすることです。そしてb)PCL(50°C、70°C)の分解プロセスを加速する。</li>
		<li>各時点で上清を収集し、400 μLの新鮮なPBSに交換します。</li>
		<li>プレートリーダーを使用して、収集した上清の蛍光強度を定量化します。 注: アクリフラビンには 416 nm/514 nm の ex/em を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抗原
	<ol>
<li>37°CでPBSの400 μL、PLGADAポリバブルの場合は50°C、PCL/PCLTAポリバブルでは50°Cで、シウシアルブミン血清(BSA)-488を中心としたインキュベートポリバブル。</li>
		<li>各時点で上清を収集し、400 μLの新鮮なPBSに交換してください。</li>
		<li>プレートリーダーを使用して、収集した上清の蛍光強度を定量化します。BSA-488 には 497 nm/520 nm の ex/em を使用してください。 注:PCL/PCLTAポリバブルの70°Cでの放出試験は、極端な温度に抗原を暴露しないように行われるべきではありません。</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 毒性
<ol><li>
中性子活性化解析(NAA)を用いたポリバブル中の塩素含有量の定量
	<ol>
<li>0.010 mBar真空および-85°Cでのこの研究のために2、4、6、20、および24時間凍結乾燥したポリバブルを使用してください。</li>
		<li>ポリバブルの5〜9mgを測定し、LDPE照射バイアルに置きます。</li>
		<li>国立標準技術研究所(NIST)の追跡可能な校正ソリューションから、1000 g/mLの塩素校正液を準備します。</li>
		<li>1メガワットのトリガ原子炉を使用して、中性子フルエンス率9.1×1012 /cm2·sで600sの中性子蛍光率で各サンプルに中性子照射を行います。</li>
		<li>ポリバブルを照射されていないバイアルに移します。</li>
		<li>HPGe検出器を使用して、360 sの減衰間隔の後に500 sのガンマ線スペクトルを得る。</li>
		<li>データを分析するには、キャンベラインダストリーズのNAAソフトウェアを使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NAAを用いてポリバブルから放出される塩素含有量の定量化
	<ol>
<li>一晩凍結乾燥させたインキュベートポリバブル(0.010 mBar真空で-85°Cで)、PBSの400 μLで37°Cで。</li>
		<li>インキュベーション後の週 1、2、および 3 で上清を収集します。</li>
		<li>ステップ7.1で前述と同じ方法を使用してNAAを使用して塩素含有量の上清を分析します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. キットラーによるAuNR合成, S., 他.8.
<ol><li>250 μLの10 mMクロロアウリン酸(HAuCl 4)、7.54mLの100 mMセトリモニウム臭化物(CTAB)、および600 μLの10mM氷冷ナトリウムホウドリド(NaBH4)を混合してオーNRシード液を調製する。</li>
	<li>40 mLの100 mM CTAB、10 mM HAuCl4の1.7 mL、硝酸銀250μL(AgNO3)、17.6mg/mLアスコルビン酸270 μLをチューブに混合して成長液を調製します。</li>
	<li>420 μLのシード溶液を1200 rpmの成長溶液と1分間激しく混合します。その後、混合物を乱さずに16時間反応させたままにしておきます。</li>
	<li>8000×gで10分間遠心して混合物から余分な試薬gを取り除き、上清を捨てます。</li>
</ol>9. ソリマンによるAuNRsの疎水化化,M.G.,他9
<ol><li>1 mM水酸化ナトリウム(NaOH)を使用して、合成されたCTAB安定化AuNRsのpHを10に調整します。</li>
	<li>0.3 mM メチル化 PEG (mPEG) チオールを一晩で 0.1 mL で攪拌します。</li>
	<li>PEGylated AuNRsを0.4 Mのドデシルアミン(DDA)とクロロホルムで500rpmで4日間混ぜます。</li>
	<li>疎水化AuNRsを含む上の有機層をパイプアウトし、将来の使用まで4°Cで保存します。</li>
</ol>10. ポリバブルのNIR活性化
<ol><li>ポリマー(PLGADAまたはPCL/PCLTA)溶液を疎水化オーナーと1:9(vol/vol)で混ぜます。</li>
	<li>0.005:1 (vol/vol) でポリマー-AuNR混合物にフォトイチエーターを追加します。</li>
	<li>ポリバブルを形成し、ポリマー-AuNR混合物を10%CMC(wt/vol)で0.92 mLガラスバイアルに注入します(ステップ2参照)。</li>
	<li>2 W/cm 2で60 sの254 nm波長で2ポリバブルを治す。</li>
	<li>フラッシュは液体窒素中で30sで凍結し、0.010 mBar真空で-85°Cで一晩凍結乾燥します。</li>
	<li>乾燥したポリバブルを鉗子で分離し、任意の残留CMCを除去するためにDI水で洗浄します。</li>
	<li>37°CでPBSの400 μLでポリバブルをインキュベートします。</li>
	<li>毎週月曜日、水曜日、金曜日に8Aで8Aでポリバブルを5分間アクティブにします。</li>
	<li>レーザー活性化の前後にポリバブルの前方赤外線(FLIR)画像を撮り、温度値を取得します。</li>
	<li>FLIR画像の温度値に基づいて、レーザー活性化前と後の温度差を計算します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

現在の技術と課題 エマルジョンベースのマイクロおよびナノ粒子は、一般的に薬物送達担体として使用されてきました。これらの装置からの貨物の放出動態は広範囲に研究されているが、バースト放出動態の制御は大きな課題であった11.貨物の多様性と機能性は、過剰な水性および有機溶媒への貨物の暴露のためにエマルジョンベースのシステムでも制限されています。タンパク質ベースの貨物は、多くの場合、貨物の変性および凝集の可能性のためにマイクロおよびナノ粒子と互換性がありません12.貨物の安定性に加えて、貨物の動態は、セロコンバージョンにつながるブースターショットの必要性のためにワクチンの文脈で特に重要です。ワクチンデリバリーにおけるこれらの課題に対処するためのこれまでの取り組みは、単一注射ワクチンシステムの概念が数十年前から行われ、まだ臨床的に翻訳されていないため、十分に成功していません。
当社のポリバブルワクチンデリバリープラットフォームは、露出した貨物量を最小限に抑える...

限定的な予防接種の適用範囲は、ワクチン予防可能な疾患によって特に引き起こされる300万人の死亡をもたらす1.不十分な保管および輸送条件は、機能性ワクチンの浪費につながり、したがって、世界的な予防接種の減少に貢献する。さらに、必要なワクチンスケジュールに従わないための不完全なワクチン接種も、特に発展途上国ではワクチンの適用範囲が限られている。ブースターショットを受けるには、推奨期間内に医療従事者への複数回の訪問が必要であり、完全なワクチン接種を伴う人口の割合を制限します。したがって、これらの課題を回避するために、制御されたワクチンの送達のための新しい戦略を開発する必要があります。
ワクチンデリバリー技術の開発に向けた現在の取り組みとしては、エマルジョン系ポリマー系33,44が挙げられる。しかし、貨物は、多くの場合、凝集や変性を引き起こす可能性のある有機溶媒の量が多く、特にタンパク質ベースの貨物55,66の文脈で。我々は、溶媒7にさらされる貨物の量を最小限に抑えながら、潜在的に複数の貨物室を収容することができる新しいワクチンデリバリープラットフォーム「ポリバブル」を開発しました。例えば、当社のポリバブルコアシェルプラットフォームでは、直径0.38mm(SEM)の1つの貨物ポケットが1mmポリバブルの中央に注入されます。この場合、有機溶剤に曝露される貨物の表面積は約0.453mm22となる。球体(貨物庫)内の球体(微粒子)の充填密度を考慮した結果、デポに収まる可能性のある実際の微粒子(直径10μm)は0.17mm3です3。1個の微粒子の体積は5.24x10-8mm3であり、したがって、デポに収まる粒子の微粒子の数は〜3.2x106粒子である。-8 3 6各微粒子に直径0.25μmの20個のカーゴポケット(ダブルエマルジョンの結果)がある場合、有機溶媒に曝露される貨物の表面積は1274mm2である。2したがって、ポリバブル内の貨物庫は、微粒子中の有機溶剤暴露貨物と比較して、有機溶媒にさらされた表面積が約2800倍少なくなります。当社のポリエステルベースのプラットフォームは、有機溶剤にさらされた貨物の量を減らす可能性があり、そうでなければ貨物の集約や不安定性を引き起こす可能性があります。
ポリバブルは、有機相のポリエステルを水溶液に注入して球状の気泡を生じる相分離原理に基づいて形成される。水相の貨物は、ポリバブルの中心に注入することができます。別の貨物室は、ポリマーシェルと異なる貨物を混合することによって、ポリバブル内で達成される可能性があります。この段階でのポリバブルは可鍛性になり、その後、真ん中に貨物を持つ固体ポリバブル構造をもたらすように硬化されます。球状のポリバブルは、ポリバブルの全体的なサイズを最小限に抑えながら、ポリバブル内の貨物容量を増加させるために、他の幾何学的形状よりも選択されました。中央に貨物を持つポリバブルは、遅延バーストリリースを実証するために選択されました。ポリバブルはまた、近赤外(NIR)-感受性(すなわち、熱刺激性有効)剤、すなわち金ナノロッド(AuNR)と組み込まれ、ポリバブルの温度上昇を引き起こす。この効果は、より速い劣化を促進する可能性があり、将来のアプリケーションでキネティクスを制御するために使用される可能性があります。本論文では、ポリバブルを形成し、特徴づけ、ポリバブルからの遅延バースト放出を達成し、ポリバブル内にAuNRを組み込んでNIR活性化を引き起こすアプローチについて述べた。

<table><tbody><tr><td>1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate</td><td>Solution Thermo scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>2-Hydroxy-2-methylpropiophenone</td><td>TCI AMERICA</td><td>H0991</td><td></td></tr><tr><td>450 nm TMB Substrate Abcam</td><td></td><td>ab17152</td><td></td></tr><tr><td>Acryloyl chloride</td><td>Sigma Aldrich A24109-100G</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>の停止溶液アクリフラビン</td><td>Chem-Impex International</td><td>22916</td><td></td></tr><tr><td>無水エチルエーテル</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>E138-500</td><td></td></tr><tr><td>抗 HIV1 gp120 抗体 西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP9700100</td><td></td></tr><tr><td>BSA-CF488 色素コンジュゲート</td><td>Invitrogen</td><td>A13100</td><td></td></tr><tr><td>ブロモサリチル酸</td><td>Acros Organics</td><td>AC162142500</td><td></td></tr><tr><td>カルボキシメチルセルロース (CMC)</td><td>ミリポア シグマ</td><td>80502-040</td><td></td></tr><tr><td>臭化セントリモニウム (CTAB)</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN19400480</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>C2984</td><td></td></tr><tr><td>コーティングバッファー</td><td>Abcam</td><td>ab210899</td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン (DCM)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270997-1L</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルエーテル</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>E1384</td><td></td></tr><tr><td>ドデアシルアミン</td><td>アクロス オーガニック</td><td>AC117665000</td><td></td></tr><tr><td>ドキソルビシン塩酸塩</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP251610</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>A61 100</td><td></td></tr><tr><td>レガート 100 シリンジポンプ</td><td>KD サイエンティフィック</td><td>14 831 212</td><td></td></tr><tr><td>mPEGチオール</td><td>Laysan Bio</td><td>NC0702454</td><td></td></tr><tr><td>無脂肪粉ミルク</td><td>Andwin Scientific</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カリウム</td><td>Acros Organics</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate 生理食塩水</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP3991</td><td></td></tr><tr><td>(ポリ(カプロラクトン)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-250G</td><td></td></tr><tr><td>(ポリ(カプロラクトン) トリオール</td><td>アクロス オーガニックス AC190730250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリ (乳酸 - コグリコール酸) ジアクリレート</td><td>CMTec</td><td>280050</td><td></td></tr><tr><td>炭酸カリウム</td><td>アクロス オーガニックス</td><td>AC424081000</td><td></td></tr><tr><td>組換え HIV1 gp120 + gp41 タンパク質</td><td>アブカム</td><td>ab49054</td><td></td></tr><tr><td>硝酸銀</td><td>アクロス オーガニックス</td><td>S181 25</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム水素化ホウ素</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S678 10</td><td></td></tr>テ<tr><td>トラクロロオーリン酸</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>G54 1</td><td></td></tr>トレ<tr><td>ハロース</td><td>アクロスオーガニック</td><td>NC9022655</td><td></td></tr><tr><td>トリエチルアミン</td><td>アクロスオーガニックス</td><td>AC157910010</td><td></td></tr></tbody></table>

近赤外感受性コアシェルワクチンデリバリープラットフォームの製造

Production of Near-Infrared Sensitive, Core-Shell Vaccine Delivery Platform

新しいリリースプロファイルを可能にしながら、有機溶媒への貨物の暴露を制限することができるワクチンの配達戦略は、世界中の予防接種カバレッジを改善するために重要です。ここでは、ポリバブルと呼ばれる新規注射可能な、紫外線硬化性および遅延バースト放出を可能にするワクチン送達プラットフォームが導入される。貨物は、10%カルボキシメチセルロース系水溶液で形成されたポリエステル系ポリバブルに注入された。本論文には、ポリバブルの球形を維持し、貨物の配置と保持を最適化して、ポリバブル内の貨物の量を最大化するためのプロトコルが含まれています。安全性を確保するため、ポリバブル内の塩素系溶媒含有量を中性子活性化解析を用いて分析した。放出試験は、遅延バースト放出を確認するために、ポリバブル内の貨物として低分子で行われた。さらに、貨物のオンデマンド配信の可能性を示すために、金ナノロッドをポリマーシェル内に混合し、近赤外レーザー活性化を可能にした。

ポリバブルは、SEMおよびNAAを用いて広範囲に特徴付けられていた。貨物は、バーストリリースの遅延を引き起こすために中央に配置されました。ポリバブルもポリバブル内にAuNRsが存在するため、レーザー活性化に成功しました。
ポリバブルの特徴付け CMCを使用しない水溶液に注入されたポリバブルは、ガラスバイアルの底部と接触するため、ポリバブルが平坦化した結果となった(図1A,B)。DI水の代わりに5%CMC系水溶液を用いた場合に部分平坦化が観察された(図1C)。その後、ガラスバイアル中の10%CMC系水溶液が、ポリバブルが溶液中に懸濁され、ポリバブルの球形維持に成功した(図...

この記事では、遅延バースト放出を可能にするために新しいワクチンデリバリープラットフォーム「ポリバブル」を製造するために使用されるプロトコルについて説明します。ポリバブルを形成するためにポリ(乳酸コグリコール酸)やポリカプロラクチンを含むポリエステルを用い、小分子と抗原を貨物として使用した。

Vaccine delivery strategies that can limit the exposure of cargo to organic solvent while enabling novel release profiles are crucial for improving ...

このプロトコルは、ポリバブルを使用することで、小分子とタンパク質の両方である貨物の安定性を維持するのに役立ち、溶媒との炭素相互作用を減らすことができます。この新しい技術は、非効率的な輸送および貯蔵施設のためにワクチンの機能が損なわれることが多いため、発展途上国のワクチンカバレッジを改善するために使用することができます。ポリバブルを製造するには、まず1ミリリットルの移入ピペットを使用して、10%CMCの800マイクロリットルを0.92ミリリットルのガラスバイアルに加えます。PCLTAを合成するには、1ミリリットル当たり1,000グラムの14キロダルトンPCLを200マイクロリットルのDCMに混ぜます。PLGADAを合成するには、5キロダルトンPLGADAの1ミリリットル当たり1,000グラムをクロロホルムの200マイクロリットルに混ぜます。0.005対1の比率で目的のポリマー混合物とフォトイチエーターを混合し、得られた溶液の200マイクロリットルを、0.016インチの内径の分配ステンレス鋼管に接続されたシリンジポンプに取り付けられた1ミリリットルのガラス注射器にロードします。マイクロモーターを使用してポリマーチューブの前後運動を制御し、ガラスバイアルの10%CMCにポリマーを注入してポリバブルを形成し、254ナノメートル波長の紫外線下で254ナノメートルのポリバブルを平方センチメートル当たり2ワットで60秒間硬化させ、液体窒素中のポリバブルを30秒間フラッシュして0.85ミリで一晩乾燥させます。ポリバブル内の目的の貨物の中心のために、手動でポリバブルに貨物混合物の2マイクロリットルを注入する前に、手動で貨物の粘度を増加させるために、一晩の回転子で5%CMCと貨物を混合します。すべての貨物が注入されたら、再治療、フラッシュフリーズ、およびちょうど実証したように、注入されたポリバブルを凍結乾燥させる。翌朝、鉗子を使用して乾燥したCMCからポリバブルを分離し、ポリバブルを脱イオン水で洗浄して残留CMCを除去する。その後、ポリバブルを半分にカットし、貨物が中央に配置されていることを確認するために共焦点顕微鏡で半分を画像化します。低分子貨物放出の場合、適切なインキュベーション長さのために37°CのPBSの400マイクロリットルの中心アクリフラビンを持つポリバブルをインキュベートします。各実験時点で、上清を収集し、バイアルに新鮮なPBSの400マイクロリットルを追加します。次にプレートリーダーを使用して、収集した上清の蛍光強度を定量化します。近赤外活性化のために、ポリマー溶液を疎水化された金ナノロッドと1~9の比率で混合し、0.005~1の比率でフォトイニシエーターを追加します。得られた混合物を10%CMCの800マイクロリットルを含む0.92ミリリットルガラスバイアルに

production-near-infrared-sensitive-core-shell-vaccine-delivery

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、組換え受容体結合ドメイン（RBD）ベースのSARSに対するサブユニットワクチンを研究するための一般的な手順を説明します。それは、293T細胞におけるRBDタンパク質のトランスフェクションと発現、RBDおよび確立されたSARSの偽ウイルス中和アッセイを用いたマウス血清の中和活性の検出によるマウスの免疫化のためのメソッドが含まれています。...

タンパク質調製物、動物の予防接種と中和の検出：遺伝子組換えRBDベースのSARSのワクチンのためのプロトコル

このビデオでは、多価表示外膜小胞(OMV)ワクチンを生成する方法を示します。哺乳類細胞をトランスフェクションして、SpyTagおよびポリヒスチジンタグに融合したウイルス抗原を発現および分泌します。次に、これらの抗原をニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)アフィニティーカラムを使用して精製します。精製された抗原は、表面結合型SpyCatcher(SC)タンパク質を発現する外膜小胞と混合されます。複数の抗原がSpyTag(ST)を介してSpyCatcherに共有結合し、抗原を表示するOMVを作り出し、多価ワクチンとして機能します。...

多価表示外膜小胞ワクチンの作製

このビデオでは、遅延バースト放出を可能にするポリマーバブルまたはポリバブルベースの新しいプラットフォームを生成する方法を示します。ポリエステルベースのポリマーを使用して、コアシェル構造を持つポリバブルを形成し、低分子や抗原を貨物として使用できます。...

分子の遅延バースト放出のための新規送達プラットフォームを生成する手法

このビデオでは、高分子ナノ粒子を使用してmRNAワクチン候補を生成する方法を示します。カチオン性ポリマーは、負に帯電したmRNAと相互作用し、ポリプレックスを形成します。ポリプレックスの形成によりmRNAが安定化し、免疫療法アプリケーションにおける将来のmRNAワクチンの候補となる可能性があります。...

ワクチン接種を目的としたmRNAインロードナノ粒子の製剤化

このプロトコルではケージ プロテインキナーゼ A (PKA)、細胞信号伝達 bioeffector ナノ粒子表面に固定化した細胞質に microinjected、アップ コンバートされる紫外線近赤外線 (NIR)...

キナーゼのアップコン バージョンのナノ粒子を介した光活性化によって細胞内シグナル伝達をリモートでトリガーする統合システム

ここでは、ワクチン開発に使用する自己組織化タンパク質ナノ粒子(SAPN)の精製、再折りたたみ、および特性評価について詳しく説明します。...

トリマーエピトーププレゼンテーションを必要とするワクチンに対する大腸菌の自己組織化タンパク質ナノ粒子の産生

このプロトコルでは、市販の無細胞タンパク質発現キットを使用して、サブユニットワクチンの抗原として使用できるナノディスクに支持された膜タンパク質を産生することを説明しています。...

ワクチン開発のためのクラ ミジア・ムリダルム 由来の組換え主要外膜タンパク質への無細胞スケール生産とアジュバント添加

本プロトコルは、外膜小胞のバイオエンジニアリングを、生産、精製、バイオコンジュゲーション、および特性評価を含む「プラグアンドディスプレイ」ワクチンプラットフォームとして説明しています。...

SARS-CoV-2受容体結合ドメインを示す外膜小胞に基づく「プラグアンドディスプレイ」ナノ粒子ワクチンプラットフォーム

ここでは、インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製および評価のための詳細な方法を提示する。...

インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製、特性、毒性、および有効性評価

この方法は、狂犬病抗原を、所定の遅延後に拍動放出を可能にする構造的および材料的特性を有する生分解性ポリマー微粒子に封入することを記載する。粒子コアから回収された抗原の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)評価では、粒子作製を通じて無傷の三量体狂犬病ウイルス糖タンパク質の存在が確認されます。...

狂犬病抗原を封入した拍動性高分子微粒子の作製

学ぶ近赤外感受性コアシェルワクチンデリバリープラットフォームの製造法。ポリ乳酸・グリコール酸共重合体とポリカプロラクトンを用いたポリバブルの作製、蛍光定量による制御放出実験、レーザー活性化の赤外線イメージング評価により、カーゴ安定性と遅延バースト放出を実現する革新的ワクチン配送技術を習得する。

近赤外感受性コアシェルワクチンデリバリープラットフォームの製造

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