Name: レンチウイルスベクターアプローチによるトランスジェニックラットの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぼう、レンチウイルスベクターを用いたラット胚への遺伝子導入法。透明帯下への複数回注入により、トランスジェニックラットを効率的に作出し、神経科学や遺伝子機能研究に応用する方法を解説します。

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この研究は、ポーランド科学財団のチームテックコアファシリティプラスプログラム内のANIMODプロジェクトによって支援され、欧州連合(EU)がWKに対して欧州地域開発基金の下で共同出資しました。

ウイルスベクターの生産と適用は、バイオセーフティレベル2ガイドラインに従い、ポーランド環境省によって承認されました。以下に記載されているすべての実験動物の手順は、地方倫理委員会によって承認されました。動物は安定した温度(21-23 °C)および湿気(50-60%)で個別に換気されたケージに収容された12時間/12時間の明暗サイクルの下で水と食べ物へのアドリビタムアクセスで。
1. レンチウイルスベクターの生産
<ol><li>HEK 293T細胞のトランスフェクション 注:本明細書で提示されるプロトコルは粗ベクトル上清の約200 mLを作り出す20 Ø10 cmの培養皿のトランスフェクションのために設計されている。<ol>
<li>37°Cで加湿CO2インキュベーター中にウシ胎児血清(10%、v/v)を添加したDMEM培地中のHEK293T細胞を培養する。トランスフェクションの場合は、直径20枚のプレートを10 cm、皿1皿あたり1.5~2 x 106 HEK 293Tセルを作ります。</li>
		<li>合流度が70%に達すると、ポリエチレンアミン(PEI)試薬を用いて細胞をトランスフェクトし、pH 7.0、DNA1μg当たりPEIの3μgの割合で。<ol>
<li>トランスフェクション混合物を5皿用に準備します(皿の総数に応じて繰り返し回数を準備してください)。Dulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM;血清なし)の1mLに、3つのプラスミドの混合物を加えて、VSVgプラスミドの最終量25μg、デルタR8.2の50 μg、および50 μgのコーディングプラスミドに達します。</li>
			<li>ピペットを上下に、3 μg/μLの濃度で125μLのPEIを加え、室温で15分間インキュベートし、インキュベーション中にチューブを3回反転させます。プレートごとにトランスフェクション混合物を200 μL加えます。次に、37°Cで加湿したCO2インキュベーターにプレートをインキュベートする。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>レンチウイルスベクターの濃度<ol>
<li>トランスフェクション後48時間、LV粒子を含む培地を収穫する。50 mL円錐形チューブを使用してください。 注:蛍光タグ付きのプラスミドを使用する場合、この時点で細胞を可視化してトランスフェクション効率を検証できます。DMEM培地の新しい部分を加えることができ、そして細胞は、さらに24時間インキュベートされてもよい。LV収率は、トランスフェクション後の48および72時間の時点で収集した場合に比較可能です。</li>
		<li>5分間3,000xgで遠心分離gし、室温で分離した細胞を除去する。</li>
		<li>上清(0.45 μm)をフィルターし、新しいチューブに注ぎます。 注: この手順は省略できます。</li>
		<li>DNase I(RNaseフリー、1 μg/mL)とMgCl2(1mM)を加え、37°Cの水浴中で15分間インキュベートします。2</li>
		<li>培地を使い捨てのポリエチレンチューブに移し、115,000 x gでスイングローターに超遠心分離機を1.5時間移動します。</li>
		<li>遠心分離後、チューブの壁を媒体の残留物から静かに排出します。</li>
		<li>ペレットに無菌リン酸緩衝生理食塩分(PBS;1管当たり70~80 μL)を浸します。</li>
		<li>4~8 °Cで2時間インキュベートします。</li>
		<li>穏やかなピペットによってPBSのウイルスベクターを再中断する。 注意:発泡を避けてください。</li>
		<li>1.5 mL遠心分離管と遠心分離機を7,000 x gで、4 °Cで30sに移し、上清を新しいチューブに移します。細胞破片ペレットが見えなくなるまで、このステップを繰り返します。</li>
		<li>アリコートと -80 °Cで凍結します。LVアリコートを再凍結することは避けてください。</li>
	</ol></li>
	<li>定量ポリメラーゼ連鎖反応によるウイルス力の定量 注: ウイルスベクターの滴定は定量PCR(qPCR)を使用して行われます。この方法は、ウイルスゲノム15の長末端リピート領域内で長いDNA断片を84bp長鎖で増幅することに基づいている。<ol>
<li>LVコードプラスミドの連続希釈を行って標準曲線を作成します:1:500、1:1,000、1:5,000、1:10,000、1:100,000、および1:1,000,000。標準曲線に使用されるプラスミドのコピー数を決定します。次の式を使用してください: コピー数/μL = (濃度 [g/μL] x 6.02 x 1023 [数/モル]) / (660 [g/mol] x プラスミドサイズ [bp]), 6.02 x 1023数/モルは、アボガドロの数であり、660 g/molはbp重量です。 注: オンラインコピー番号計算機を使用することができます。</li>
		<li>レンチウイルス懸濁液の希釈液を調製する:1:100、1:500、および1:1,000。</li>
		<li>反応混合物(ウェルあたりの体積)を調製する:qPCRマスターミックス10 μL、10 μMフォワードプライマーの1 μL、10 μMリバースプライマーの1 μL、および7 μLのH2O.ピペット混合物を96ウェルプレートのウェルに入れます。 注:フォワードプライマー:5'-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA。リバースプライマー:5'-TACTAAAAAGGGTGAGGGGgA。</li>
		<li>各標準的な希釈液とレンチウイルス懸濁液を三重に1μL加えます。</li>
		<li>qPCRは、2分間50°C、5分間96°C、96°Cの35サイクル(20s)、60°C(40s)、1分間の70°C、メルトカーブステージ:95°C(1分、30°C)に従って実行します。</li>
		<li>各希釈に対して受け取った分子の数を標準曲線と比較して、結果を分析します。各希釈に対する3つの反復の平均としてベクター分子の濃度を決定する。 注:提示された定量化は、ウイルス粒子の物理的な濃度を与える。機能性の高い機能として扱うべきではありません。</li>
	</ol></li>
</ol>2. トランスジェニックラットの生成
<ol><li>受精胚の超排卵と採取<ol>
<li>性腺刺激ホルモンを投与する。 注:採取した胚の数を増やすには(女性1人あたり約30個)、ホルモン刺激には未熟な5週齢のウィスターメスを使用してください。<ol>
<li>1日目(午後12時~午後1時)に、腹腔内に妊娠中の雌の血清性性性性性腺刺激ホルモン(PMSG;女性1人あたり25 IU)を注射する。0.9%NaClでホルモン粉末を溶解することにより、125 IU /mLの濃度で作業溶液の1 mLアリコートを調製します。-20 °Cで最大1ヶ月間、または-80°Cで6ヶ月間保管してください。</li>
			<li>3日目(午後12時~午後1時)に、腹腔内にヒト絨毛性ゴナドトロフィン(hCG;女性1人あたり30 IU)を注入する。0.9%NaClでホルモン粉末を溶解することにより、1 mLの作業溶液(150 IU /mL)を調製します。-20 °Cで最大1ヶ月間、または-80°Cで6ヶ月間保管してください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>hCG投与後、女性は1:1に性的に肥沃な男性(生後3~10ヶ月)と交尾する。</li>
		<li>翌朝(4日目午前8時~10時)、女性に膣プラグがないか確認します。最高の視覚化のための最良の視覚化は、交配の夜の後に早朝にチェックする必要があり、白っぽい交配プラグの存在のために膣の開口部をチェックしてください。胚の収集には、可視プラグを持つメスのみを使用してください。</li>
		<li>午前10時に胚を収集します。動物を犠牲にして排卵物を切除し、事前に温めたM2培地で排卵物を皿に集めます。<ol>
<li>牛の精巣からヒアルロニダーゼを含む35mmのM2培地を含む35mmの皿に排卵物を0.5mg/mLの濃度で移します。</li>
			<li>天体顕微鏡下で微細な鉗子を使用して卵管の壁を開き、胚が解放されるまでアンペア(すなわち、乳雲細胞に囲まれた受精胚を含む卵性の腫れた部分)を押す。 注:ヒアルロンダイダーゼは、胚を放出し、cumulus細胞を酵素的に消化します。 注意: ヒアルロンジダーゼへの長期暴露は胚に有害である;したがって、このステップは5分以上続くはずです。</li>
			<li>積雲細胞からの胚の放出を容易にするために、口で作動させた吸引管に接続されるガラス転写ピペットを使用して、それらを上下に穏やかにピペット化する。<ol>
<li>転写ピペットを製造するには、グラスパスツールピペットを火炎の上に引っ張り、ストレート〜5〜10cmの先端を作り出します。約4cmの先端を残してピペットを割ります。</li>
			</ol>
</li>
			<li>胚をM2培地で数回洗浄し、ヒアルロンジーゼおよび細胞の破片を除去する。液体パラフィンまたはミネラルオイルで覆われた平衡化されたM16培地の(約50μL)滴を含む60mmの皿に、5%CO2雰囲気の加湿された37°Cインキュベーターに胚を移す。2</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>透明帯下の1細胞期胚へのレンチウイルスベクターのマイクロインジェクション メモ:マイクロインジェクションには、2つの目に見える前核を持つ1細胞段の胚を使用してください(図1)。<ol>
<li>LVアリコートを室温で解凍し、遠心分離機を10,000 x gで2分間解凍し、残りの細胞デブリをペレットにします。</li>
		<li>マイクロインジェクションのセットアップ<ol>
<li>マイクロフォージを使用してピペット(ホウケイ酸ガラスキャピラリー)を保持するガラスを準備します。ガラスの毛管を炎の上に引っ張って、5〜10 cmの先端を作り出します。約4cmの先端を残してピペットを割ります。外径は~80~120μmです。 注:ピペットチップが完全にまっすぐで滑らかであることを確認してください。</li>
			<li>引っ張られたピペットをマイクロフォージに、加熱フィラメントの前に先端を付けて組み立てます。フィラメントをピペットチップに非常に近く加熱し、直径約15μm(胚サイズの約20%)まで縮小させます。ピペットを加熱フィラメントに垂直に、ピペットチップから2~3mm離して熱を出します。ガラスが柔らかくなります。15°の角度になるまで加熱します。</li>
			<li>ピペットプーラーを使用してフィラメントでマイクロインジェクションホウケイ酸ガラス毛細血管を準備します。引っ張る部屋に毛管を挿入します。ランプテストを実行します(新しいガラスのために初めて、フィラメントを変更した後、毎回)。[熱]をランプ値-10に、プルを100に、速度を150に、時間を100に設定します。 注: 最適な射出毛管を得るためにパラメータを変更します。</li>
			<li>バイオセーフティラミナーフローフードの下で、マイクロローダーチップを用いて約2μLのウイルス溶液をマイクロインジェクションピペットにロードします。</li>
			<li>液体パラフィンまたはミネラルオイルで覆われたM2培地(中央)の100 μLドロップでマイクロインジェクション皿(60mmペトリ皿の蓋)を準備します。</li>
			<li>ウイルス溶液を装填した保持ピペットとマイクロインジェクション毛細管を、逆顕微鏡下でマイクロマニピュレーターとマイクロインジェクション皿に取り付けます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>マイクロインジェクションを行います。<ol>
<li>マイクロインジェクション皿のM2ドロップに15〜20個の1細胞段階の胚を移す。保持ピペットを使用して胚を保持します。</li>
			<li>400x倍率を使用して、自動インジェクターに接続されているガラスキャピラリーを使用して、透明帯下のLV溶液をペリビテリン空間に注入します。帯内透明帯の下に毛細血管を少し持ち続けなさい。 注:穏やかな正圧を使用して、ウイルス溶液は注入毛細血管から連続的に流れ出るが、送達される懸濁液の容積は制御できない。</li>
			<li>微細なピペットを用いて、5%CO2雰囲気中の37°Cで培養器内の培養皿に胚を戻2す。1つのザイゴテの注射の数は変化し、ウイルスベクター濃度に基づいて適応することができる。 注:注入された胚は、2細胞段階で移管される前に、1細胞段階で里親に移管するか、M16培地でO/Nをインキュベートすることができます。ラット胚の長期のインビトロ培養は避けるべきである。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>母親を育てる注射胚の移入<ol>
<li>肥沃なBN男性または精管切除されたSD男性(精管切除手順は後述のセクション3)を3日目(1細胞段階で胚を移す場合)または4日目(2細胞段階で胚を移す場合)で性的に成熟したSDメスを交配して里親を準備する。 注:卵管の転送のために、0.5日後のコイタム(dpc)女性を使用してください。</li>
		<li>翌朝、SDメスの膣プラグをチェックし、目に見えるプラグを持つものだけを使用してください。</li>
		<li>胚移植を行う。 メモ:立体顕微鏡で滅菌器具を使用して手術を行ってください。手術の日の前に、オートクレーブはさみ、細かい鉗子、針のホールダー、およびメスのホールダー。<ol>
<li>ケタミン(50mg/kg)およびメデトミジン(0.5mg/kg)溶液のi.p.投与で女性を麻酔する。手術を開始する前に、麻酔を確認するために反射神経をテストします。</li>
			<li>動物をトレフェナミック酸(2mg/kg)、ブトルファンノール酒引酸(1mg/kg)、エンロフロクサシン(5〜10mg/kg)で皮下に注射し、それぞれ炎症、痛み、感染を防ぎます。</li>
			<li>角膜乾燥を防ぐために、両眼に眼科軟膏潤滑を適用します。後ろから毛皮を剃り、外科用スクラブで皮膚を殺菌し、続いて無菌非付着パッドを使用してアルコールを70%アルコール化する。皮膚を乾燥させます。</li>
			<li>切開部位に0.25%ブピバカイン(局所麻酔薬)の100 μLで皮下に注入します。手術顕微鏡の目的の下で加熱パッド上のきれいな表面に起こりやすい位置に動物を移す。下背部に小さな穴を開けて、無菌ドレープでラットを覆います。</li>
			<li>腰椎柱に平行に約2cmの皮膚切開を行う。</li>
			<li>鋭利なはさみを使って、腹壁に切り傷をつけます。鉗子を使用して卵巣脂肪パッドをつかみ、卵巣と卵化管を引き出し、0.9%NaClで濡れたガーゼの上に置きます。</li>
			<li>吸引M2培地、空気の3つの気泡、および胚を転写毛細管に入れた。移送される胚の推奨総数(一方的または両側性):妊娠中の女性(≤15-16胚)、疑似妊娠女性(≤30胚)。</li>
			<li>マイクロハサミを使用して卵管(インファンディブラムとアンプラの間)に小さな切開を行い、卵管に移管ピペットを挿入します。</li>
			<li>ピペットから卵管に胚と気泡を静かに排出します。鈍い鉗子で、生殖管を腹腔に戻す。</li>
			<li>ポリグリコール酸吸収性縫合糸で腹壁を縫合し、創傷クリップで皮膚切開を閉じます。利用可能な胚の数に応じて、他の卵管に対してこの手順を繰り返します。</li>
			<li>動物の腹腔内に、アトピテゾール(0.5mg/kg)を注入して麻酔の効果を逆転させます。</li>
			<li>きれいなケージに動物を移し、完全に麻酔から回復するために、温めのプレートの上に保管してください。ラットでの送達は~21日後に起こる。 注:オスのBNラットが交配に使用される場合、白い子犬だけがトランスジェニックである可能性があります。茶色の子犬は自然妊娠からです。</li>
			<li>組織断片(好ましくは耳から)を遺伝子型3週齢の子犬に収集する。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>3. 精管切除術
注意:手術の日の前に、オートクレーブはさみ、細かい鉗子および針のホールダー。
<ol><li>ケタミン(50mg/kg)およびメデトミジン(0.5mg/kg)溶液のi.p.投与で5週齢の雄SDラットを麻酔する。手術を開始する前に、麻酔を確認するために反射神経をテストします。</li>
	<li>トルフェナミン酸(2mg/kg)、ブトルファノール酒を1mg/kg、エンロフロクサシン(5~10mg/kg)を皮下に投与し、炎症、痛み、感染を予防します。</li>
	<li>角膜乾燥を防ぐために、両眼に眼科軟膏潤滑を適用します。ラットのスパインを加熱パッドのきれいな表面に置き、外科用スクラブで精巣の皮膚を殺菌し、続いて無菌非接着パッドを使用して70%アルコールを殺菌する。皮膚を乾燥させます。精巣の上に小さな穴を開けて無菌ドレープでラットを覆います。腹部を軽く押して、陰嚢嚢の精巣を露出させる。</li>
	<li>手術用ハサミを使用して、陰嚢嚢の真ん中に〜0.5cmの切開を行います。精巣の間の正中線の壁(白線)を見つけます。</li>
	<li>正中壁の左側に近い精巣膜に5mmの切開を行います。</li>
	<li>慎重に精巣を左に押し、単一の血管を持つ白い管として(精巣と正線の間)精管を見つけます。</li>
	<li>時計職人の鉗子を使用して、陰嚢嚢からゆっくりと精管を引き出します。1組の鉗子で精管を保持し、細かいはさみでそれをカットします(または鉗子の2番目のペアの赤熱の先端で焼灼します)。ダクトの1cmの破片を取り除きます。 注:焼灼が行われる場合は、2番目の鉗子の先端を炎に入れなさい。</li>
	<li>他のテストで上記の手順を繰り返します。ポリグリコール酸吸収性縫合糸で皮膚を縫合し、動物を腹腔内にアティパメゾール(0.5mg/kg)で注入する。</li>
	<li>動物が麻酔から回復するまで、ラットを温め皿の上のきれいなケージに入れます。 注:オスは、〜2週間の回復期間後にテストの交配で使用することができます。無菌性が確認された後、それらは偽妊娠誘導に使用することができる。</li>
</ol>

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著者(W.K.)は、ポーランド共和国の特許庁(No. P 355353;21.03.2008)から特許「トランスジェニック動物の製造方法」に対する権利を有する。

トランスジェニック技術の進歩により、げっ歯類モデルは生物医学研究において非常に貴重なツールとなっています。彼らは、生体内で遺伝子型-表現型の関係を研究する機会を提供する。ここでは、プロ核注射による従来のトランスジェネシスに対して広く利用可能な代替手段を提示する。レンチウイルス遺伝子導入の使用は、ウイルスベクターを透明帯下に注入することができるので、要求の多いマイクロインジェクションの必要性をバイパスする。このアプローチは、本質的に注入された接合体の100%の生存率を保証する胚の完全性に影響を与えません。レンチウイルスベクターによって組み込まれる導入遺伝子は、宿主ゲノムに安定的に組み込まれ、長期発現および生殖細胞系列伝達を可能にする。さらに、里親に対する改変胚移植のための2つの代替技術を提示する。1つの技術は、精管切除された不妊の男性と交配することによって以前に調製された偽妊娠女性への胚移植を利用する。もう一つの技術は、肥沃な男性と交配しているが、異なる毛皮の色(すなわち、BNラット)と交配される自然妊娠女性の使用に基づいている。妊娠のこのより生理学的なコースは、挑戦的な遺伝子改変を受ける胚の適切な発達を可能にする<sup class="...

長年にわたり、ラットやマウスなどの実験室のげっ歯類は、ヒトの生理学的および病理学的状態をモデル化するために使用されてきました。動物研究は、他の手段では達成できなかった発見につながっています。当初、遺伝学的研究は、人間の状態を密接に模倣すると考えられている自然発生障害および型の解析に焦点を当てた1.遺伝子工学的手法の開発により、特定の遺伝子の導入または欠失が望ましい表現型を得ることが可能となった。そのため、遺伝子導入動物の生成は、生物における遺伝子機能の研究を可能にする現代研究の基礎技術として認識されている。
遺伝子導入動物技術は、実験発生学と分子生物学の成果を組み合わせて可能になりました。1960年代、ポーランドの発生学者A.K.タルコフスキは、開発初期段階におけるマウス胚操作に関する最初の研究を発表した。さらに、分子生物学者は、動物のゲノムに外来DNAを導入するためのDNAベクター(すなわち、キャリア)を生成する技術を開発した。これらのベクターは、選択した遺伝子の伝播と、実施される研究の種類に応じて、それらの適切な修飾を可能にします。「トランスジェニック動物」という用語は、ゴードンとラドル3によって導入された。
神経生物学、生理学、薬理学、毒物学、および生物医学と医学の他の多くの分野で使用された最初の広く受け入れられた種は、ノルウェーラット、ラトゥスノルベギカス4でした。しかし、ラット胚の操作が困難であるため、家のマウスの筋肉は、遺伝子研究5で支配的な動物種となっています。このような研究におけるマウスの優位性のもう一つの理由は、この種のノックアウト動物を生成する胚性幹細胞技術の利用可能性であった。トランスジェネシスの最も一般的に使用される技術(生まれたすべての動物に対するトランスジェニック子孫の2〜10%)は、受精卵母細胞の前核へのDNA断片のマイクロインジェクションです。1990年、マウスで初めて導入されたこのアプローチは、ラット66,77に適応した。前核注入によるラットトランスジェネシスは、マウスと比較して効率8が低いことを特徴とし、これは弾性プラズマおよび前核膜9の存在に厳密に関連している。操作後の胚の生存率はマウスより40〜50%低いが、この技術は遺伝子組み換えラット10の生成における標準と考えられている。効率的な導入遺伝子導入と注入された接合の高い生存率を保証できる代替アプローチが検討されている。
安定したトランスジーン発現と子孫への伝達の重要な決定要因は、宿主細胞ゲノムへの統合である。レンチウイルス(LV)は、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができるという特徴があります。異種遺伝子を胚に組み込むツールとしての使用は、高効率の11であることが判明し、トランスジェニック個体は、組み込まれたDNA断片の安定な発現によって特徴付けられる。レンチウイルスベクター,の有効性は、マウス12、13、ラット12、14、および他の,13種11の遺伝子改変について確認されている。14この方法では、LV懸濁液は、2つの前核の段階で胚の透明帯下に注入される。この技術は、オイレンマが影響を受けないので、本質的に胚の100%生存を保証する。高品質で比較的集中度の高いLVサスペンションの製造は、重要な要素です。しかし、LV懸濁液の低濃度は、繰り返し注射11によって克服することができ、これは膜の集積に影響を与えずに卵表面でのウイルス粒子の量を増加させる。膜領域への反復注射を受けた胚はさらに発達し、トランスジェニック子孫は生殖細胞系列を介してトランスジーンを伝達することができる。レンチウイルストランスジェネシスによるトランスジェニックラット生成の効率は、80%12までも12高くすることができる。
ここでは、HIV-1由来組換えレンチウイルスの産生について、胞性口内炎ウイルス(VSV)Gエンベロープタンパク質を擬似タイプ型にした。第二世代のパッケージングシステムVSV疑似型の使用は、ウイルス粒子の広い感染性を決定し、超遠心分離および凍結保存によって濃縮することができる非常に安定したベクターの生産を可能にする。滴下検証後、ベクターはアルビノウィスターラットジゴテへのトランスジーンデリバリーの車両として使用する準備ができています。一連の注射の後、胚は一晩培養され、母親を育てるために2細胞段階で移すことができる。この時点で、2 つの代替アプローチのいずれかを検討できます。標準的な手順は、胎児のレシピエントとして疑似妊娠女性を利用する。しかし、精管切除された男性と交配した後に妊娠率が低い場合、胚は、暗い毛皮の色を有する肥沃な雄ラット(例えば、ブラウンノルウェー[BN]ラット)と交配している妊娠中のウィスター/スプレイグ・ドーリー(SD)メスに移植することができる。毛皮の色は、移された操作された胚に由来する子孫から自然妊娠からの子孫の区別を可能にする。

<table><tbody><tr><td>7500 リアルタイム PCR システム</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aerrane (イソフルラン)</td><td>Baxter</td><td>FDG9623</td><td></td></tr><tr><td>校正済みマイクロキャピラリーピペット用アスピレーターチューブアセンブリ</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Atipam 5 mg/ml</td><td>Eurovet Animal Health BV</td><td>N/A</td><td>0.5 mg/kg</td></tr><tr><td>Baytril 25 mg/ml (enrofloksacin)</td><td>Bayer</td><td>N/A</td><td>5-10 mg / kg</td></tr><tr><td>フィラメント付きホウケイ酸ガラス毛細血管 GC100TF-15</td><td>ハーバード デバイス限定</td><td>30-0039</td><td>注射毛細血管</td></tr><tr><td>ブピバカイン 25 mg/ml</td><td>Advanz Pharma</td><td>N/A</td><td>0.25% in&nbsp; 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>Butomidor 10 mg/ml (ブトルファノール&nbsp; 酒石酸塩)</td><td>Orion Pharma</td><td>N/A</td><td>1 mg/kg</td></tr><tr><td>CELLSTAR Tissue Cell Culture Dish 35-mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>CELLSTAR 組織細胞培養ディッシュ 60mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>CellTram Oil</td><td>Eppendorf</td><td>5176 000.025</td><td></td></tr><tr><td>Cepetor (Medetomidine) 1 mg/ml</td><td>cp-pharma</td><td>N/A</td><td>0.5 mg/kg</td></tr><tr><td>Chorulon, Human Chorionic Gonadotrophin&nbsp;</td><td>Intervet</td><td>N/A</td><td>150 IU/ml ml 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>DMEM 低グルコース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6048</td><td></td></tr><tr><td>DNase, RNase-free</td><td>A&バイオテクノロジー</td><td>1009-100</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax フィルター付き軽鉱物油</td><td>Sigma</td><td>ES-005-C</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルスベクター用エンベロープタンパク質コードプラスミド (VSVg プラスミド)&nbsp;</td><td>ADDGENE</td><td>14888</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet</td><td>Eppendorf</td><td>4i /5252 000.013</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Folligon, Pregnant Mare'血清ゴナドトロピン&nbsp;</td><td>Intervet</td><td>N/A</td><td>125 IU/mL 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>HEK 293T 細胞内&nbsp;</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>ウシ精巣由来ヒアルロニダーゼ&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4272-30MG</td><td>0.5 mg/ml M2</td></tr><tr><td>中倒立顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>アクシオーバー 200</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン 100mg/ml</td><td>バイオウェット Pulawy</td><td>N/A</td><td>50 mg/kg</td></tr><tr><td>リキッド パラフィン</td><td>メルク ミリポア</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>M16 ミディアム エンブリオマックス</td><td>シグマ</td><td>MR-016-D</td><td></td></tr><tr><td>M2 ミディアム</td><td>シグマ</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム 1M</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>63069-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma</td><td>M8410-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0.9%</td><td>POLPHARMA OTC</td><td>N/A</td><td>滅菌、5ml アンプル</td></tr><tr><td>手術用顕微鏡&nbsp;</td><td>Inami Ophthalmic Instruments</td><td>Deca-21</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルスベクター用プラスミドをコーディングする包装システム&nbsp;(デルタR8.2プラスミド)</td><td>ADDGENE</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>PEI試薬(ポリエチレン、Mw~25,000、)、</td><td>Polysciences、Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水、pH 7.4、液体、滅菌ろ過、細胞培養に適しています</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806552-500ML</td><td></td></tr><tr><td>プーラー&nbsp;</td><td>サッターインストゥルメント株式会社</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>リフレックスクリップ アプライヤー/リフレックスクリップ</td><td>ワールド精密機器</td><td>500345/500346</td><td></td></tr><tr><td>サフィル、ポリグリコール酸、編組、コーティング、吸収性糸</td><td>B.ブラウン 外科</td><td>用1048029</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX16</td><td></td></tr><tr><td>外科用縫製糸</td><td>B.ブラウン&nbsp;</td><td></td><td></td>C1048040</tr><tr><td>SYBR グリーン PCR マスター ミックス</td><td>Applied Biosystem</td><td>4334973</td><td></td></tr><tr><td>トルフェジン 4% (トルフェナム酸)</td> <td>ベトキノール</td><td>N/A</td><td>2 mg/kg</td></tr><tr><td>TransferMan NK2</td><td>エッペンドルフ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン EDTA 溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3924-500ML</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>オプティマ L-100 XP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VacuTip</td><td>Eppendorf</td><td>5175108.000</td><td>ホルダー毛細血管</td></tr><tr><td>Vita-POS</td><td>Ursapharm</td><td>N / A</td><td>眼軟膏</td></tr><tr><td>温暖化プレート</td><td>Semic</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>時計職人鉗子</td><td>VWR</td><td>470018-868</td><td></td></tr></tbody></table>

レンチウイルスベクターアプローチによるトランスジェニックラットの生成

Generation of Transgenic Rats using a Lentiviral Vector Approach

トランスジェニック動物モデルは、現代の生物医学研究にとって基本的に重要です。初期のマウスまたはラット胚への外来遺伝子の組み込みは、生物における遺伝子機能解析にとって非常に貴重なツールです。標準的な遺伝子導入法は、受精卵母細胞の原核に外来DNA断片をマイクロ注入することに基づいている。この技術はマウスで広く使用されていますが、他の動物種では比較的非効率的で技術的に要求が厳しいままです。この遺伝子は、レンチウイルス感染を介して1細胞段階の胚に導入することもできるので、特により困難な胚構造を有する種または株において、標準的な前核注射に代わる効果的な代替手段を提供する。このアプローチでは、レンチウイルスベクターを含む懸濁液を受精ラット胚の腹腔内空間に注入し、技術的に要求が少なく、成功率が高い。レンチウイルスベクターは、トランス遺伝子をゲノムに効率的に組み込み、安定なトランスジェニックラインの生成を決定することが示された。いくつかの制限(例えば、バイオセーフティレベル2要件、DNA断片サイズ制限)にもかかわらず、レンチウイルストランスジェネシスは迅速かつ効率的なトランスジェネシス法である。さらに、異なる支配的な毛皮の色を有する肥沃な男性株と交配される雌ラットを使用して、偽妊娠の里親を生成する代わりとして提示される。

本明細書に記載のプロトコルを用いて、Syn-TDP-43-eGFP構築物を運んだレンチウイルスベクターが産生され(物理LV力計=3.48x 10 8/μL)、次いで1細胞段胚下天注射に使用することができた。2つの目に見える前核を有する胚のみが処置に供された。ウイルス懸濁液の注射回数を実験的に決定した。高い移植効率とトランスジェニック子孫の同時欠如は、成功したトランスダクションのためのウイルス粒子の不十分な数の指標と考えられていた。この場合、注射数が増加した。LVの単一投与は20匹のF0生成ラットの誕生をもたらし、いずれもトランスジェニックではなかった。注射回数が1桁増加してもラットの誕生は見えなかったが、2細胞段階に発達した胚の100%であった。その後の実験では、注射数が、子孫が得られた値と比較して1つ増加した。2回の注射の変異体について、8匹のラットが生まれ、そのうちの3匹がトランスジーンを運ぶことが確認された(表1にまとめ)。創設者の一人は、トランスジーンを子孫に移しませんでした。各実験変異体で注入され、移された胚の数は、LV x1およびLV x2のバリアントで48、LVx10...

本稿は、ザイゴテのペリビテリン空間へのウイルス懸濁液の複数の注射を用いたラット胚におけるレンチウイルストランスジェネシスの方法論を提供することを目的とする。異なる支配的な毛皮の色を持つ肥沃な男性株と交配される雌ラットは、偽妊娠の里親を生成するために使用されます。

Transgenic animal models are fundamentally important for modern biomedical research. The incorporation of foreign genes into early mouse or rat embryos is ...

トランスジェニック動物は、生物の遺伝子機能の研究を可能にする現代の生物医学研究の基礎です。遺伝子改変の様々な方法が動物実験に適用されている。ここでは、ラット胚のゲノムへの導入遺伝子の組み込みのためのツールとしてレンチウイルスベクターを用いた広くアクセス可能で効果的な技術を提示する。ヒト絨毛性ゴナドトロピン投与後、5週齢のウィスター雌ラットを1対1で性的に肥沃な3〜10ヶ月のウィスターオスと交尾する。翌朝8時から10時.m時に、膣プラグの有無をメスに確認し、交配プラグを持つ女性から卵管を10.mまでに収穫する。あらかじめ温めたM2培地を含むコレクション皿に。すべての卵性が採取されたら、牛の精巣からヒアルロニダーゼのミリリットル当たり0.5ミリグラムを補った事前に温められたM2培地を含む35ミリメートル皿に組織を移し、皿を立体顕微鏡の下に置きます。卵管の壁を開くために細かい鉗子を使用し、胚が解放されるまでアンペアを押します。cumulus細胞からの胚の放出を容易にするために、口で作動する吸引器管に接続されたガラス伝達ピペットを使用して、胚を上下に穏やかにピペット化する。すべての胚が放出されたら、新鮮なM2培地で細胞を数回洗浄してヒアルロンジダーゼおよび細胞残骸を除去する。胚を60ミリメートル皿の鉱物油で覆われた平衡化されたM16培地の個々の50マイクロリットルの滴に移す。その後、注入するまで5%の二酸化炭素雰囲気を有する加湿37度摂氏インキュベーターに皿を入れます。一細胞段階胚の透明帯下でのレンチウイルスベクターマイクロインジェクションの場合、ピペットプーラーを使用してフィラメントを用いたマイクロインジェクションホウケイ酸ガラス毛細血管を調製する。フィラメントが変更されるか、新しいガラスキャピラリーが使用されるたびに、ランプテストを実行して最適なパラメータを設定します。次に、マイクロローダーチップを使用して、バイオセーフティ層流フードの下でマイクロインジェクションピペットあたり解凍したレンチウイルス溶液の約2マイクロリットルをロードします。60ミリメートルのペトリ皿から蓋の中央にM2培地の100マイクロリットルの滴を追加します。ミネラルオイルで媒体を覆い、保持ピペットとウイルスがマイクロマニピュレータにマイクロインジェクション毛細管をロードして取り付けます。マイクロインジェクション皿を逆顕微鏡の下に置き、15〜20個の1細胞段階胚をマイクロインジェクション皿のM2ドロップに移します。保持ピペットで1つの胚を捕獲し、400倍の倍率とガラス毛細管を使用して、ウイルスが送達された後、一瞬、ソナ透明体の下の毛細管を保持する腹腔内空間に透明帯下のレンチウイルス溶液を注入する。すべての胚が注入されたら、細かいピペットを使用して注入された細胞を培養皿に戻し、その注入まで培養インキュベーターに皿を戻します。胚移植のために里親を準備するために、精管切除された男性と性的に成熟したスプレイグ・ドーリーの女性を仲間にし、翌朝女性に膣プラグをチェックする。実行可能なプラグを持つ麻酔をかけた雌のペダル反射への応答の欠如を確認した後、動物の目に軟膏を適用し、各動物の後ろから毛皮を剃る。手術用顕微鏡下の加熱パッドのきれいな表面に、最初のラットを起こしやすい位置に置きます。下背部に小さな穴を開けて無菌ドレープでラットを覆い、腰椎柱に平行に約2センチメートルの皮膚切開を行います。鋭利なはさみを使用して腹壁に切り傷を付け、鉗子を使用して卵巣脂肪パッドをつかむ。腹腔から卵巣と卵管を0.9%塩化ナトリウム浸しガーゼの一部に引き出します。M2培地、空気の3つの気泡、および胚を転写毛細管にロードする。マイクロシザーを使用して、インファンディブラムとアンプラの間の卵管に小さな切開を行い、切開管に移管ピペットの先端を挿入します。胚と気泡を卵管に静かに排出し、鈍い鉗子を使用して生殖管を腹腔に戻します。腹壁をポリグリコール酸吸収性縫合糸で縫合し、創傷クリップで皮膚切開を閉じ、動物を完全な再発まで監視する温暖化プレートのきれいなケージに入れます。潜在的な仲間を精管切除するには、実証されているように手術のために雄のラットを準備した後、70%エタノールと外科スクラブを使用して精巣の上に皮膚を消毒する。腹部を静かに押して陰嚢嚢の精巣を露出させ、ラットを手術部位の上に小さな穴で無菌ドレープで覆い、陰嚢はさみを使用して嚢の真ん中に0.5センチメートルの切開を行います。慎重に精巣を左に押し、精巣と正中線の間の精巣を単一の血管を持つ白い管として見つけます。時計職人の鉗子を使用して、陰嚢嚢からゆっくりと蒸気を引き出し、鉗子で容器を保持し、細かいはさみを使用してダクトから1センチメートルの断片を取り除きます。ちょうど実証したように2番目の精巣の手順を繰り返し、ポリグリコール酸吸収性縫合糸で皮膚を閉じます。その後、完全な再実行まで監視と温暖化プレート上のきれいなケージにラットを置きます。単一胚を複数回注入したこの代表的な実験では、2回注射された胚から8匹のラットが生まれ、そのうちの3匹が遺伝子導入を担うことが確認された。創設者の一人は、子孫にトランスジーンを転送しませんでしたし、3人の里親女性が各実験セットアップに使用されました。選択されたアプローチは、中枢神経系全体の1つのプロモーターにおけるニューロンシナプスの制御下でTDP-43-eGFP融合タンパク質を発現する安定したトランスジェニックラット株の生成を可能にした。レンチウイルス系トランスジェネシスは、定量PCRによって示されるように、トランスジーンの単一コピー挿入をもたらした。この方法を他のレンチウイルスベクターに使用した場合、約90%の生存率が観察された。前核注射を生き延びた胚の割合は有意に低かった。全体として、これらの結果は、妊娠中の女性ラットが同等の効率を持つ里親として使用できることを示唆している。特に、マイクロインジェクションの個々のラウンドについて分析された数値データは、移植の有効性が1つの胚への注射の数に直接依存し、間接的にウイルス負荷に依存することを示した。レンチウイルスベクターの使用は、遺伝子導入遺伝子のゲノム統合および伝達を保証し、複数の皮下注射が行われる場合でも、マイクロ操作胚の高い生存率を促進する。この手順は、他の種に効果的に適用され得るし、従来のトランスジェネシスの代替と考えることができる。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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包装HIV-またはFIVベースLentivector発現コンストラクト＆VSV-Gシュードウイルス粒子の伝達

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レンチウイルスベクターアプローチによるトランスジェニックラットの生成

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