Name: ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学ぶ ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化プロトコル。神経前駆細胞への分化機構を解明し、創薬スクリーニングや再生医療への応用可能性を示す。

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カール・D・ボルトナー博士(NIEHS)のFACS分析への協力に感謝します。この研究は、国立環境衛生科学研究所、国立衛生研究所Z01-ES-101585の村内研究プログラムによってAMJに支援されました。

1. hESC認定基底膜マトリックスコーティングプレートの調製
<ol><li>hESC認定基底膜マトリックス(材料表参照)溶液を少なくとも2~3時間または一晩でゆっくりと解凍し、ゲルの形成を避けます。</li>
	<li>基底膜マトリックスコーティングプレートを調製するために、冷間DMEM/F12で希釈マトリックスを2%の最終濃度にする。よく混合し、希釈されたマトリックス溶液の1 mLで6ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。</li>
	<li>基底膜マトリックスコーティングプレートを室温(RT)で少なくとも3時間または4°Cの一晩でインキュベートする。 注:基底膜マトリックスを有するプレートは、マトリックス溶液が除去され、プレートが使用される前に、4°Cで1週間保存することができます。</li>
</ol>2. コロニー型hESCの単細胞hESC培養への適応
<ol><li>基底膜マトリックス上で増殖したコロニー型H9(WA09)hESCのフィーダーフリー培養物を通過させ、ウェルから培地を吸引する(図1A)9。</li>
	<li>DPBSの1 mLで1xを洗浄します。ウェルあたり1mLのディスパーゼ溶液(1 U/mL)を加え、37°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>ディスパーゼを取り除き、DMEM/F12の2 mLで細胞1xを穏やかに洗い、培地を取り除き、各プレートに2mLのDMEM/F12を加えます。</li>
	<li>ゆっくりと上下にピペットをしてコロニーを取り外し、15 mLチューブに移します。</li>
	<li>370 x gで2分間ペレットを遠心分離し、培地を吸引する。</li>
	<li>細胞ペレットを単一細胞に解離するには、2mLの細胞剥離溶液(1x濃度、材料表参照)を加え、37°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>370 x gで2分間の遠心分離細胞を取り外し、剥離溶液を除去する。</li>
	<li>新鮮なmTeSR1ヒトESC培地を追加し、穏やかなピペット上下によって単一細胞に細胞を解解き分けます。</li>
	<li>コロニー型hESCを単一細胞型培養に適合させるには、10μM ROCK阻害剤を24時間含むmTeSR1の2mLの基底膜マトリックスコーティング6ウェルプレートの各ウェルに約1.5〜2.0 x 106 hESCをプレートする(図1A)。</li>
	<li>24時間後、hESC培地をROCK阻害剤なしで新鮮なmTeSR1に交換し、hESCが3日間単一細胞型として成長できるようにします。毎日メディアを変更します。</li>
	<li>4日目に、培養物が100%近いコンフルエンスに達したら、剥離溶液中の細胞を解離し、次いでステップ2.6に記載の方法で再プレートする。 注:ROCK阻害剤は、単一細胞型hESC培養の初期24時間の間に細胞生存率を向上させる。</li>
</ol>3. 胚体形成と3つの生殖層への分化 (図2)
<ol><li>EBを形成するには、最初の24時間の間に10μM ROCK阻害剤を用いてmTeSR1培地の3 mLで細胞を再サスペンドし、次に37°インキュベーターで60mmの低付着皿に一晩インキュベートして凝集を可能にする。</li>
	<li>24時間後、小さなEBは15 mLチューブに移される。EBをチューブの底部に落ち着かせ、ピペットで媒体を軽く取り除きます。EB培地にEBを転写し(20%ノックアウト血清置換を補ったノックアウトDMEM、1xグルタミンサプリメント[材料表を参照]、1%NEAA[非必須アミノ酸;材料表]、および0.2%β-メルカプトエタノールを参照)、7日間低い付着皿で拡大することを可能にする。培地は、上述したように1日おきに変更することができます(図2A)。</li>
	<li>7日目に、食器からEBを収集し、15 mLチューブに転送します。ピペットで媒体を軽く取り出し、ベース膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートにEBを移します。</li>
	<li>EBをプレートに取り付け、EB培地で12日間インキュベートし、その間に3つの胚芽層に分化させます(図2B)。1 日おきにメディアを変更します。 メモ:セルの凝集中に、低い添付ファイルの皿はEBの付属品を避けるのに役立つ。</li>
</ol>4. 単一セル型hESCをNPCに差別化する (図 3)
<ol><li>NPC分化を誘導するには、1mLの剥離溶液(1x)で単一細胞型hESCを解離し、37°Cで10分間インキュベートする。</li>
	<li>370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。DMEM/F12を1mL加え、穏やかなピペットで細胞を再サスペンドします。</li>
	<li>10μM ROCK阻害剤を含有するmTeSR1の2mLにおける2x105細胞/ウェルの密度で基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート上のプレートセル。</li>
	<li>24時間後、培養培地を1μMドルソモルフィンと5μM SB431542を補充した神経誘導培地(DMEMと1%B27からビタミンA)に交換します。</li>
	<li>神経誘導の最初の4日間は1日おきに培地を交換し、その後7日目に合流に達するまで毎日を変更する(図3B)。 注:(1)ドルソモルフィンはALK2,3,6受容体を標的とすることによりBMP経路を阻害し、AMPKを阻害する;SB431542はALK5,7を標的とすることによりTGFβ/アクチビン経路の阻害剤である。(2) 同じプロトコルを別の ESC 回線(WA01)でテストし、WA0916と同様の結果をもたらしました。(3)我々は、一般的に基底膜マトリックスにマトリゲルを使用しています。しかし、細胞をゲルトレックス上で培養し、いくつかのNPCマーカーの発現によって示されるように非常によく似た結果を持つNPCに分化することができます(図4D,E)。マトリゲルと同じ方法でゲルトレックスを取り扱います(セクション1を参照)。</li>
</ol>5. NPCの拡大と凍結保存
<ol><li>神経誘導の7日後、1mLの剥離溶液(1x)で細胞を解離し、37°Cで10分間インキュベートする。</li>
	<li>370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。NPC 膨張媒体を 1 mL 加え(材料表を参照)、穏やかなピペットによって細胞を再サスペンドします。</li>
	<li>基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレート上のNPC膨張培地の2mL中のプレート1x105細胞。</li>
	<li>培養が90%近くに達すると、必要に応じて何度もNPCを通過する。最初の3~4回の通路では、細胞死を防ぐために、最初の24時間に10μM ROCK阻害剤を添加します。これらの通路の後、細胞はROCK阻害剤なしで通過および培養することができる。拡張中に 1 日おきにメディアを変更します。</li>
	<li>培養が合流に達すると、凍結NPC。<ol>
<li>凍結保存のために、37°Cで5分間剥離溶液(1x)の1mLで細胞を解離し、次いで370 x gで2分間遠心分離懸濁液を除去する。</li>
		<li>細胞凍結溶液(材料表参照)を加え、1 x 106細胞/mLでNPCを解剖し、1mLのアリコートをクライオビアーに分配します。</li>
		<li>凍結容器に凍結容器に入れ、-80°Cの冷凍庫に一晩保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>凍結膜を液体窒素に入します。</li>
</ol>6. ポリL-オルニチン(PLO)およびラミニンコーティングプレートの調製
<ol><li>PLO/ラミニンコーティングプレートを調製するには、PLO原液をPBSまたは水に希釈し、最終濃度10μg/mLにします。よく混ぜ、希釈されたPLO溶液の1 mLで6ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。</li>
	<li>少なくとも2時間、37°Cでインキュベートするか、4°Cで一晩インキュベートする。</li>
	<li>PBSでそれぞれをよく洗います。</li>
	<li>冷たいPBSまたは水の希薄ラミニン原液を10μg/mLで希釈します。ラミニン溶液をよく混ぜます。PBSを取り外し、直ちにラミニン溶液1mLで各ウェルをコーティングします。プレートは4°Cに保ち、1週間以内に使用してください。PBSで洗浄し、すぐに培養培地を追加します。 メモ:PLO/ラミニンコーティングプレートを乾燥させないでください。</li>
</ol>7. ドーパミン作動性ニューロンへのhESC由来NPCの分化 (図 6A)
<ol><li>約50%の密度でNPC膨張媒体中のPLO/ラミニンコーティングされた料理のプレートNPC。</li>
	<li>24時間後、培地をDA1培地(2mMグルタミンサプリメントを含む神経バサバル培地、1x NEAA、1x B27、200ng/mL SHH、および100ng/mL FGF8)に変更し、1日おきに培地を変更する。</li>
	<li>彼らが合流に達したときの通路文化。1 mLの剥離溶液(1x)で細胞を解離し、37°Cで10分間インキュベートする。</li>
	<li>370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。DA1培地を1mL加え、穏やかなピペットで細胞を再サスペンドします。</li>
	<li>プレート1 x 105細胞を2mLのDA1培地でPLO/ラミニンコーティング6ウェルプレートに記載。</li>
	<li>10日後、DA2培地(2mMグルタミンサプリメントを含む神経バサガル培地、1x NEAA、1x B27、200μMアスコルビン酸、20ng/mL BDNF、および20 ng/mL GNDF)に変更し、さらに20日間1日おきに培地を変更する(図6A)。 メモ:DA2培地に新鮮なアスコルビン酸を毎日追加します。最初の14日以内に、分化した細胞は90%のコンフルエンスに達したときに渡されるべきですが、その後は渡す必要はありません。</li>
</ol>8. ESC由来NPCをアストロサイトに分化する
<ol><li>約50%の密度でNPC膨張培地中のPLO/ラミニンコーティングプレート上のプレート神経前駆細胞。</li>
	<li>24時間後、培地をアストロサイト培地(DMEM/F12培地を含む1:100 N2、1:100 B27、200ng/mL IGF、10ng/mLアクティビンA、10ng/mLヘレグリンβ-1、および8 ng/mL bFGF)に変更し、1日おきに培地を変更する。</li>
	<li>彼らが合流に達したときの通路文化。1 mLの剥離溶液(1x)で細胞を解離し、37°Cで10分間インキュベートする。</li>
	<li>370 x gで2分間細胞を遠心分離し、剥離溶液上清を除去する。1 mLのアストロサイト培地を追加し、穏やかなピペットによって細胞を再サスペンドします。</li>
	<li>PLO/ラミニンコーティングされた6ウェルディッシュ上のアストロサイト培地の2 mL中のプレート1 x 105細胞。</li>
	<li>差別化を合計 5 ~ 6 週間継続できるようにします (図 6B)。</li>
</ol>9. 免疫蛍光染色
<ol><li>上記の細胞タイプごとに35mmμ皿で培養する。培地を吸引し、1皿あたり4%PFA溶液の1 mLを加え、RTで20分間インキュベートします。</li>
	<li>PBSで2xを5分間洗う。 注:細胞が固定されると、アッセイプレートをパラフィルムで密閉し、4°Cで保存することができます。固定後1週間以内に抗体で染色する。</li>
	<li>1皿あたり300μLのブロッキング溶液(PBSのヤギまたはロバ血清)を加え、RTで30~60分間インキュベートします。</li>
	<li>料理2xをPBSで5分間洗います。</li>
	<li>300 μLの一次抗体(表1)溶液(ブロッキング溶液で希釈)を加え、RTで1.5時間または4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>PBSで2xを10分間洗う。</li>
	<li>300 μL の蛍光共役二次抗体 (表 1)をブロッキング溶液に加え、暗闇の中で1時間RTでインキュベートします。</li>
	<li>細胞を2倍にPBSで10分間洗浄します。</li>
	<li>ハフスト染色液(PBSでは1μM最終濃度)を加えて核を染色します。暗闇の中の細胞をRTで5分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞1xをPBSで5分間洗浄し、500μLのPBSを加える。皿を暗闇の中に置き、共焦点顕微鏡で蛍光を観察します(図2B、図5C、図6A、図7B)。 </li>
</ol>

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</ol>

著者は利益相反を宣言しない。

様々な系統へのhESCの分化および十分な数の分化細胞の生成のためのスケーラブルで効率的な方法は、薬物スクリーニングおよび幹細胞治療のための重要な基準である。様々な単細胞通過方法が公表されており、細胞は生存を改善するためにROCK阻害剤または他の小分子の存在下で培養されるが、これらの培養方法の最終産物はコロニー型hESC17、18、19、20、21である。以前に公開された方法19、20、21、22に部分的に基づく単一セル ESC プロトコルは、単一セル型 hESC...

ヒト胚性幹細胞(hESC)は、3つの一次生殖層に分化する可能性を有し、その後、様々な多能性前駆細胞系統に分化する。これらの系統は、その後、人体内のすべての細胞タイプを生じる.in vitro hESC培養システムは、ヒト胚発生を研究する能力を変革し、これらのプロセスが生物学的および分子レベルでどのように調節されるかについての新しい洞察を得るための貴重なツールとして機能してきました。同様に、ヒト患者から単離された体細胞のリプログラミングから生じる人工多能性幹細胞(iPSC)の研究は、様々な疾患に対する新しい洞察を提供する。また、hESC由来の前駆細胞および分化細胞は、幹細胞治療および薬物スクリーニング1、2、3、4を含む研究に有用であり得る。
hESCは、広範な自己再生能力を有する多電位細胞である神経前駆細胞(NPC)に分化するように誘導することができる。続いて、これらの細胞は、ニューロン、アストロサイト、およびオリゴデンドロサイト5、6に分化することができる。NPCはまた、神経発達生物学と様々な神経疾患のインビトロ研究のための細胞システムを提供しています.しかしながら、hESCとNPCへのその分化を含む現在のコロニー型培養方法は非効率的であり、多くの場合、胚体(EB)およびロゼット形成5、7、8、9と同様に共培養を伴う。これらのプロトコルは、低い生存率と自発的な分化を示し、より時間がかかります。
ここで紹介する、容易にスケーラブルで、hESC10の高密度単一細胞型培養を使用する改良された堅牢な培養システムである。Roh-キナーゼ(ROCK)阻害剤の含有は、hESC10、11、12、13、14の単一細胞型培養中の生存効率を有意に高めることに寄与した。このカルチャシステムでは、hESC を簡単に保守および拡張できます。さらに、このプロトコルは、hESCの単一細胞型培養物からNPCを生成する効率的な方法を提示し、高純度NPCの産生を可能にする。
要約すると、hESCを用いた単一細胞型培養プロトコルは、NPCを含む様々な系統へのこれらの細胞の分化を研究する魅力的なモデルを提供する。このプロトコルは簡単にスケーラブルであり、したがって、再生療法や薬物スクリーニングを含む研究のための細胞を生成するのに適しています。

<table><tbody><tr><td>35 mm m-dishes</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>細胞培養ディッシュ</td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104-500</td><td>細胞剥離液</td></tr><tr><td>Activin A</td><td>R&Dシステム</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B27 サプリメント (-Vit A)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Applied Biological Materials</td><td>Z100065</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18C</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>DAMON/ICE</td><td>428-6759</td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>4110</td><td></td></tr><tr><td>コーニング hESC-qulified マトリックス (Magrigel)</td><td>コーニング</td><td>354277</td><td>基底膜マトリックス (ここではほとんどのプロトコルに使用)</td></tr><tr><td>クライオスター CS 10</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7930</td><td>細胞凍結液</td></tr><tr><td>ディスパーゼ</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>ドルソモルフィン</td><td>トクリス</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>ペプロテック</td><td>AF-100-16A</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>SH3007003HI</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>応用生物材料</td><td>Z101705</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Applied Biological Materials</td><td>Z101057</td><td></td></tr><tr><td>Geltrex matrix</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1569601</td><td>Basement membrane matrix</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Thermo Fisher</td><td>35050061</td><td>Glutamine supplement, 100X</td></tr><tr><td>H9 (WA09) ヒト胚性幹細胞株</td><td>WiCell</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>ヘレグリン b-1</td><td>Peprotech</td><td>100-3</td><td></td></tr><tr><td>IGF</td><td>Peprotech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト DMEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清交換</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>ステムセルテクノロジー</td>ズ <td>85850</td><td>hESC 培地</td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>サーモフィッシャー</td><td>17502001</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベース</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3655</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 阻害剤</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>Applied Biological Materials</td><td>Z200617</td><td></td></tr><tr><td>Stemdiff 神経前駆細胞培地</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5833</td><td>NPC 拡張培地</td></tr></tbody></table>

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

ヒト胚性幹細胞(hESC)のインビトロ分化は、生物学的および分子レベルの両方で人間の発達を研究する能力を転換し、再生用途に使用する細胞を提供しました。コロニー型培養を用いたhESC培養に対する標準的なアプローチは、未分化のhESCおよび胚体(EB)を維持し、異なる胚層への分化のためのロゼット形成は非効率的で時間がかかる。ここで紹介する単細胞培養法は、コロニー型培養物の代わりにhESCを用いた方法である。この方法により、コロニー型hESCに匹敵するレベルでのhESCマーカーの発現を含む、未分化hESCの特徴を維持することができます。さらに、このプロトコルは、1週間以内にNPCを産生する単一細胞型hESCからの神経前駆細胞(NPC)生成のための効率的な方法を提示する。これらの細胞は、いくつかのNPCマーカー遺伝子を高度に発現し、ドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトを含む様々な神経細胞型に分化することができる。hESC用のこの単細胞培養システムは、これらのプロセスの分子機構、特定の疾患の研究、および創薬画面の調査に役立ちます。

ここで提示する、hESCの単一細胞型培養の維持と拡大のための改良されたプロトコルと、神経前駆細胞への効率的な分化は、その後、様々な下流の神経系統に分化し、ドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトを含む。
代表的な位相差画像は、コロニー型hESCを単一細胞型培養物に適応させる間、異なる工程で細胞形態を示す(図1A)。単細胞培養条件を通じて、適合したhESCを高密度に維持することができ、その後、コンフルエントに達すると容易かつ効率的にサブカルチャー化できることがわかった(図1A,B)。これらの細胞は、コロニー型hESCの典型的な細胞周期特性(すなわち、S相における細胞の短いG1位および高い割合)を保持した(図1C,D)。また、ESCマーカー(すなわち、OCT4、TRA 1-81、SOX2、およびNANO...

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

ヒト胚性幹細胞は、神経前駆細胞に分化し、その後ニューロンアストロサイトとオリゴデンドロサイトに分化するように誘導することができる。しかしながら、ヒト胚性幹細胞の培養法及びそれらの神経前駆細胞への分化は非常に非効率的で、生体内での共同培養系で開かれた、ヒト胚性幹細胞を用いた高密度単細胞型培養を用いて容易に拡張可能な改良された堅牢な培養システムを提示する。ヒト胚性幹細胞の単一細胞型培養は、神経前駆細胞とその後の分化を含む様々で明確な分化系統に沿った多段階分化を調節する分子機構を研究するための迅速かつ効率的なシステムを提供する。ヒト胚性幹細胞修飾基膜マトリックス被覆プレートを調製する。少なくとも2〜3時間または一晩、摂氏4度で基膜マトリックス溶液をゆっくりと解凍する。解凍したら、冷たいDMEM/F-12でマトリックスを希釈し、2%よく混ぜ、希釈した溶液を1ミリリットルで6ウェルプレートの各ウェルをコーティングします。コーティングされたプレートを室温で少なくとも3時間または一晩摂氏4度でインキュベートします。コロニー型H9型ヒト胚性幹細胞のフィーダーフリー培養物を基部膜マトリックス上で増殖させるために、ウェルから培地を吸引し、1ミリリットルのDPBSで1回洗浄する。各ウェルに1ミリリットルのディスパーゼ溶液を加え、20分間摂氏37度でプレートをインキュベートします。ディスパーゼを取り出し、DMEM/F-12の2ミリリットルで細胞を穏やかに洗います。洗浄後、培地を取り出し、各ウェルに2ミリリットルのDMEM/F-12を加えます。コロニーを上下にピペットして穏やかに取り外し、15ミリリットルのチューブに移します。チューブを370回gで2分間遠心分離する。培地を吸引する。その後、細胞ペレットを1つの細胞に解離し、2ミリリットルの細胞剥離液を加え、37°Cで10分間インキュベートします。遠心分離を繰り返し、剥離液を取り除きます。mTeSR-1ヒトESC培地中の細胞を上下に軽くピペット化して再懸濁する。コロニー型ヒト胚性幹細胞を単一の細胞型培養物に適合させるために、約150万~200万個の細胞を、10ミクロモルロック阻害剤を含むmTeSR-1の2ミリリットルのプレートにコーティングされた基底膜マトリックスの各ウェルにプレートを入れる。24時間後、ROCK阻害剤なしで新鮮なmTeSR-1で培地を交換してください。毎日培地を変更する 3 日間、セルを単一のセル型として拡張できるようにします。4日目に、分離溶液中の細胞を解離し、先に述べたように再板を取り出します。原稿の方向に従って細胞を再中断してインキュベートした後、小さな胚体を15ミリリットルのチューブに移し、底に落ち着かせ、ピペットで穏やかに培地を取り除きます。EB培地に移し、7日間低い愛着料理で拡大できるようにします。神経前駆細胞またはNPC分化を誘導するために、単一細胞型ヒト胚性幹細胞を1ミリリットルの剥離液で解離し、摂氏37度で10分間培養する。370回gで2分間細胞を遠心分離する。剥離液上清を取り除きます。次に、DMEM/F-12のセルを再び中断します。10マイクロモルロック阻害剤を有するmTeSR-1の2ミリリットルのウェルあたり2倍の密度で6ウェルプレートをコーティングした基底膜マトリックス上の細胞をプレートします。24時間後、培養培地を1つの小臼歯ドルソモルフィンおよび5つのマイクロモルSB431542で補った神経誘導培地に置き換える。神経誘導の最初の4日間に1日おきに培地を変更し、7日目に合流するまで毎日変更します。7日間の神経誘導の後、1ミリリットルの剥離溶液を加え、摂氏37度で10分間インキュベートして細胞を解離する。細胞を370倍gで遠心分離し、剥離液上清を除去する。1ミリリットルのNPC膨張培地を加え、細胞を上下に静かにピペットして再中断します。次いで、6ウェルプレートを被覆した基質膜マトリックス上のNPC膨張媒体の2ミリリットルに10〜5番目の細胞を1回プレートする。培養が90%合流に達したときに必要に応じて細胞を通過し、最初の3〜4つの通路の間に10マイクロモルROCK阻害剤を加える。拡張中に、1 日おきにメディアを変更します。PLOラミニンコーティングされたプレートを調製するには、PBSまたは水でPLOストック溶液を1ミリリットル当たり10マイクログラムの最終濃度に希釈し、よく混ぜ、6ウェルプレートの各ウェルを1ミリリットルの溶液でコーティングします。プレートを摂氏37度で少なくとも2時間、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、PBSで各ウェルをよく洗い、その直後に原稿の指示に従って調製したラミニン溶液を1ミリリットルずつ塗布します。プレートを摂氏4度に1週間まで置きます。NPCをドーパミン作動性ニューロンに分化するには、24時間後に約50%の密度でNPC膨張培地にPLOラミニンコーティングされた皿の細胞をプレートし、その後1日おきに培地をDA1に変更し、その後1日おきに培地を交換します。合流に達したときに培養液を通過するには、1ミリリットルの剥離溶液で細胞を解離し、摂氏37度で10分間インキュベートする。次いで370回gで遠心分離し、剥離液上清を除去する。DA1培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁し、PLOラミニンコーティングされた6ウェルプレート上の培地の2ミリリットルに10〜5番目の細胞を1回プレートします。NPCをアストロサイトに分化するには、PLOラミニンプレート上の細胞とNPC膨張媒体を50%の密度でプレートし、24時間後に培地をアストロサイト培地に変更し、前述のように細胞を通過させます。コロニー型ヒト胚性幹細胞を単一細胞型培養に適応させたところ、細胞を高密度に維持し、合流に達すると容易かつ効率的にサブ培養できることが分かった。これらの細胞は、短いG1相及び高割合のS相の細胞のようなコロニー型ヒト胚性幹細胞に典型的な細胞周期特性を保持した。定量PCR分析では、コロニー型細胞と同等のレベルでESCマーカーを発現することも確認された。さらに、ヒト胚性幹細胞の単一細胞が、3つの胚層すべて(エンドデラム、中胚、および外胚葉)の細胞を含む胚体を形成できることが示された。その後、典型的なヒト胚性幹細胞の形態の喪失とNPC形態の出現によって示されるように、単一細胞型ヒト胚性幹細胞がNPCに効率的に分化することが実証された。分化は、シグネチャーNPCマーカーの発現増加によって支持され、免疫染色およびFACS分析によって確認された。同じ分析では、90%以上の細胞がSOX1、PAX6、およびNCAMタンパク質に陽性に染色されたことも示されました。さらに、誘導NPCは、特徴的な形態の出現および系統特異的マーカーの発現によって示されるように、ドーパミン作動性ニューロンおよびアストロサイトに分化することができた。この手順を試みる際には、健康で未分化のヒト胚性幹細胞培養を維持するためには、ヒト胚性幹細胞を高密度にプレートすることが不可欠である。このプロトコルは、神経変性医療における基礎研究、薬物スクリーン、および応用のために拡張可能となる前駆細胞および分化細胞のシンプルで堅牢でスケーラブルな生産のためのプラットフォームを提供する。

efficient-neural-differentiation-using-single-cell-culture-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。...

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

このビデオは、フィーダー細胞や中間ステップを使用せずに、ヒト胚性幹細胞(hESC)が直接神経前駆細胞に分化することを示しています。骨形成タンパク質またはBMPの選択的阻害およびトランスフォーミング成長因子-ベータ(TGF-β)シグナル伝達経路は、hESCの神経前駆細胞またはNPCへの分化につながります。...

ヒト胚性幹細胞の神経前駆細胞への分化

このビデオは、胚性幹細胞を機能しているシナプスを持つニューロンのネットワーク集団に分化する技術を示しています。胚性幹細胞のニューロンへの分化、ニューロンネットワーク形成の誘導、およびネットワーク化されたニューロンによる培養の濃縮に関与するステップを概説しています。...

マウス胚性幹細胞のネットワーク化ニューロン集団への分化

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

このプロトコルは、無血清単層法を使用して胚性幹細胞から神経前駆細胞を生成する方法を詳細に説明しています。これらの前駆細胞は、成熟した神経細胞タイプの誘導や神経仕様のプロセスの研究に使用でき、化合物スクリーニングのためのマルチウェルフォーマットスケーリングに適しています。...

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。...

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。...

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

本プロトコルは、高い再現性と効率で網膜オルガノイドの接着と融合を減少させる最適化された3D神経網膜誘導システムについて説明しています。...

ヒト多能性幹細胞からの神経網膜の生成

学ぶ ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化プロトコル。神経前駆細胞への分化機構を解明し、創薬スクリーニングや再生医療への応用可能性を示す。

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

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