Name: ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-29T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫組織化学法。蛍光標識抗体を用いてタンパク質発現を三次元的に可視化し、発生生物学におけるタンパク質動態の研究に有用な手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

NIH助成金8P20GM103436 14からの資金。

このプロトコルに記載されているゼブラフィッシュ繁殖成人および胚を扱うための手順は、マレー州立大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認された。
1. 胚の採取と固定
<ol><li>一晩システム水で満たされたメッシュまたはスロットライナーでタンクに大人のゼブラフィッシュ混合セックスペアまたはグループを配置することにより、産卵タンクを準備します。</li>
	<li>ライトが点灯している時に、新鮮な水を取り除くために産卵タンク水を交換してください。午前9時に点灯するライトで14時間/10時間のライトダークサイクルを使用してください。</li>
	<li>卵が産まれると、大人を家庭用タンクに戻します。</li>
	<li>転送ピペットを使用してそれらを描くか、メッシュストレーナーにそれらを注ぐことによって卵を収集します。</li>
	<li>胚培地(0.5 mg/Lメチレンブルーの30%ダニオーまたはE2胚培地など)で半分に充填されたペトリ皿に卵を移し、1皿当たりの胚数を50個に制限する。</li>
	<li>死んでいるか、分割に失敗した卵を取り除きます。 注:死んだ胚は、不透明になり、しばしば「曇っている」ように見えるため、容易に識別できます。メチレンブルーを胚培地に添加すると、死んだ胚は濃い青色の外観を取る。</li>
	<li>卵の料理を所望の段階に達するまで28.5 °Cでインキュベートします。この実験では、胚を23hpfまで上げます。</li>
	<li>任意)メラニン形成を防止するために、胚培地中で24hpfで24hpfで200 μM 1-チオ尿素(PTU)を移し、メラニン形成を防止する。あるいは、固定後の漂白胚(オプションセクション5を参照)。</li>
	<li>胚培地またはPTU培地を毎日変更する。</li>
	<li>立体顕微鏡下で超微細先端鉗子を用いて、ハッチングされていない胚をデコリオネートする。あるいは、胚培地中の1mg/mLプロナーゼを室温で数分間インキュベートすることによって、胚を化学的にデコリオネートする。プロナーゼから胚を取り出し、胚培地で3回洗浄する。</li>
	<li>減交胚はプラスチックに付着します。1-2%のアガロースを胚培地に溶解したガラスまたはプラスチックペトリ皿に保管してください。損傷を最小限に抑えるために、火で磨かれたパスツールピペットを使用して、エコーリオネートされた胚を移動します。</li>
	<li>プラスチックまたは火で磨かれたピペットを使用して、胚を1.5mL遠心管に移します。</li>
	<li>マイクロピペットで胚培地を除去する。各流体の変化の後に胚を覆うのに十分な液体だけを残してください。</li>
	<li>化学ヒュームフードに1xリン酸緩衝生理食塩基(PBS)で4%パラホルムアルデヒド(PFA)を調製します。 注意: PFA は危険物です。手袋を着用し、汚染された液体や固体を指定された場所に処分する。</li>
	<li>室温で穏やかな揺れで1-2時間の4%PFAで胚を固定します。あるいは、胚を4時間4°Cで一晩に固定する。</li>
	<li>1x PBS + 1% トリトン-X (PBTriton) で 5 分間 3 回洗浄します。</li>
	<li>胚をすぐに使用するか、最大1週間4°Cで保存してください。</li>
	<li>長期保存のために、100%メタノール(MeOH)2時間または-20°Cで一晩で胚を脱水する。数ヶ月間、MeOHで-20°Cに胚を保管してください。 注意: MeOH は危険物です。手袋を着用し、汚染された液体や固体を指定された場所に処分する。</li>
</ol>2. 胚の準備
<ol><li>室温で連続インキュベーションを通じて胚を水分補給する。<ol>
<li>75% MeOH/25% 1x PBS で 5 分間インキュベートし、ロッキングします。</li>
		<li>5分間50%MeOH/50%1x PBSでインキュベートし、ロッキング。</li>
		<li>5分、ロッキングのための25%MeOH / 75%1x PBSでインキュベート。</li>
		<li>5分間100%PBTritonでインキュベートし、ロッキング。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(オプション)新鮮なプロテイナーゼKの働き溶液(PBTritonで10 μg/mL)を氷の上に用意し、解凍したばかりのプロテイナーゼKストック(10mg/mL)を10μL加えて調製します。<ol>
<li>プロテイナーゼKで最大30分まで消化することにより、胚を透過します。 注: 推奨されるタイミングは <24 hpf: 消化なし;24 hpf: 15 分消化;そして7日齢:30分消化。</li>
		<li>PBTritonで浸透した胚をリンスし、室温で20分間4%PFAで再固定した。</li>
		<li>PBTritonで胚を3回洗浄し、穏やかなロッキングで室温で5分間洗います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 一次抗体インキュベーション
<ol><li>2 mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)の有無にかかわらず、二次抗体宿主種(PBTritonで10%のヤギ血清)と一致する市販のブロッキング溶液または血清を選択します。</li>
	<li>揺れながら、室温で1〜3時間、または4°Cで一晩ブロッキング溶液中の胚をブロックします。</li>
	<li>一次抗体中のインキュベートは、ブロッキング中に4°Cで一晩、PBTriton中のブロッキング溶液または1%血清中に希釈した。この実験では、使用された一次抗体は、抗NMDAR1、抗汎パン-AMPA受容体、および抗ホスホ−ヒストンH3であり、それぞれPBTritonの1%ヤギ血清中の1:500の最終濃度に希釈した。</li>
	<li>ロッキングしながら、室温で10分間PBTritonで5回洗います。</li>
</ol>4. 二次抗体インキュベーション
<ol><li>一次抗体と所望の波長の宿主種に基づいて二次抗体を選択する。</li>
	<li>2次抗体でインキュベートし、ロッキングしながら、2時間(または4°Cで一晩)のブロッキング溶液または1%血清で希釈した。 注:蛍光二次抗体は光感受性です。我々は、PBTritonで1%ヤギ血清中に希釈した1:500ヤギ抗マウスAlexa488を使用した。</li>
	<li>この後のすべてのステップのためのアルミニウム箔またはライトブロッキングボックスでチューブをカバーします。</li>
	<li>ロッキングしながら、室温で10分間PBTritonで3回洗います。</li>
	<li>胚培地中の2%アガロースのベッドを介してPBS中の50%グリセロール溶液に胚を移し、文書化に進むか、または以下のさらなる処理ステップに進む。</li>
</ol>オプションの手順
5. 漂白
<ol><li>810.7 μL の ddH2O、89.3 μL の 2 M KOH、100 μL の 30% H2O2を加えて、1.5 mL チューブに漂白剤溶液を調製します。</li>
	<li>チューブを3回反転して混合します。</li>
	<li>ピペット1 mLの漂白剤溶液方向を胚に対する。</li>
	<li>胚管キャップを開けてガスを逃がします。ベンチのチューブを軽くタップして泡を取り除きます。</li>
	<li>漂白プロセスを監視し(必要に応じて顕微鏡を使用)、顔料が十分に除去されたときに反応を停止します(24 hpfの場合は約5分、72hpfの場合は10分)。</li>
	<li>PBTritonの1 mLでマイクロピペットとリンス胚を3回慎重に除去します。 注:このステップでは胚は粘着性があります。</li>
	<li>以下のドキュメントまたは追加の処理手順に進みます。</li>
</ol>6. 胚解剖と脱離
<ol><li>黄身を取り除くために、1x PBSの少量(約200μLまたは十分に胚を完全に覆うのに十分だが、浮くことができる場所を制限するのに十分な制限)をうつ病スライドまたはプレーングラススライドに移す。</li>
	<li>プラスチックトランスファーピペットを使用して、1つ以上の胚をPBS液滴に移動します。</li>
	<li>超微細鉗子と00個の昆虫ピンを使用して黄身を分解し、胚の腹側表面から黄身顆粒を非常に穏やかに削る(Chengら2014も参照)。</li>
	<li>卵黄顆粒を取り除き、必要に応じてPBSを補充します。</li>
	<li>胚が十分に黄身を含まないまで繰り返す。</li>
</ol>7. スライド上のフラットマウント
<ol><li>脱黄胚をプラスチックピペットまたは1mLマイクロピペットをトリムチップで充電されたガラススライドに移す(せん断応力を軽減するため)。200 μL マイクロピペットチップまたは昆虫ピンで必要に応じて配向します。</li>
	<li>キムワイプまたはペーパータオルで余分なPBSを取り除きます。</li>
	<li>スライドとカバースリップに2~3滴のマウントメディアを追加します。</li>
	<li>空気は約5〜10分間乾燥します。</li>
	<li>カバーガラスを透明なマニキュアでスライドにシールします。 注:カバーガラスの縁は、マニキュアの薄い、連続した層で完全に覆われている必要があります。</li>
	<li>撮影前に10分程度乾燥させます。</li>
</ol>アガロースでの取り付け
<ol><li>マイクロ波安全フラスコまたはビーカーに50mLの胚培地に0.5gのアガロースを加えることによって、胚培地に1%のアガロースを調製する。</li>
	<li>アガロースが完全に溶解するまで、30sごとに渦巻く電子レンジで加熱します。</li>
	<li>1.5 mL遠心チューブで1 mLのアリコートを作ります。アリコートを室温で保管します。</li>
	<li>加熱する前にキャップロックでチューブキャップをカバーしてください。</li>
	<li>アガロースチューブを水で半分入ったビーカーに浮遊チューブホルダーに入れます。</li>
	<li>ビーカーに2〜3分間フローティングチューブを使用するか、アガロースが完全に溶けるまでマイクロ波を打ちます。</li>
	<li>プラスチック製のピペットまたは200 μLマイクロピペットをトリムチップでブリッジスライドに移します(せん断応力を軽減するため)。</li>
	<li>昆虫ピンを使用して胚を長方形のカバースリップに配置し、約20 μLの溶けたアガロースを胚に直接加えます。</li>
	<li>00の昆虫ピンを使用して、カバースリップに最も近い関心領域をすばやく向けます。 注:これは逆さまのマウントです。</li>
	<li>アガロースチューブを、必要に応じて各使用とマイクロ波の間の温水チューブフロートに戻します。</li>
	<li>アガロースが固まったら顕微鏡を用いた画像。取り付けられた胚を逆さまに保ち、逆顕微鏡で使用してください。直立顕微鏡で使用するためにカバースリップをひっくり返します(アガロースがカバースリップの下にあるように)。</li>
</ol>9. ブリッジスライドへの取り付け
<ol><li>ブリッジスライドを作るためには、スーパーグルーの小さなドットを使用してガラススライドに正方形のカバースリップを接着します。 注:カバースリップの間には少なくとも5mm幅のトラフが必要です。高い2つの#1カバーリップは通常24〜48 hpf胚に適していますが、高い3つのカバーリップは72 hpfに必要な場合があります。</li>
	<li>1-2個の脱黄胚をプラスチックピペットまたは200μLマイクロピペットをトリムチップでブリッジスライドに移します(剪断応力を軽減するため)。</li>
	<li>キムワイプまたはペーパータオルで余分な液体を取り除きます。</li>
	<li>胚に直接≥80%グリセロールの滴を追加します。</li>
	<li>長方形のカバーガラスで覆います。グリセロールの液滴は、カバーガラスに触れる必要があります。</li>
	<li>必要に応じてカバーガラスとスライドの間のスペースにさらにグリセロールを追加し、胚の側面にグリセロールのマージンで胚を完全に覆う。</li>
	<li>長方形のカバーガラスをそっとスライドさせて、イメージング用の位置に胚を転がします。</li>
</ol>10. DAB染色
注: このセクションは、上記の手順 4.2 の後に開始され、手順 4 の残りの部分を置き換えます。
<ol><li>ペオキシダーゼ結合二次抗体を用いたブロッキング溶液中で胚を室温で2時間、または4°Cで一晩揺らしながらインキュベートする。</li>
	<li>PBTritonで3回、室温で10分間洗います。</li>
	<li>胚を転写ピペットで培養プレートまたはうつ病スライドに移す。</li>
	<li>ddH 2 Oに50μL(3,3'-ジアミノベンジジン)を0.3%過酸化水素のddH2Oおよび50 μLに溶解し、PBSで1 mLに持ち込みます。 注意: DAB は危険物です。手袋を着用し、指定された領域でDAB汚染された液体や固体を処分します。</li>
	<li>HRP染色された胚を上記で調製したDAB溶液で覆い、顕微鏡下で色発生(通常は1〜5分)を監視する。</li>
	<li>望ましいレベルの発色に達した後、PBSで胚を短時間すすいでください。</li>
	<li>固定する前に胚を1.5mLのチューブに戻します。</li>
	<li>室温で4%PFAで15〜20分間胚を再固定する。</li>
	<li>5分間、PBTritonで胚を3回洗浄します。</li>
	<li>ドキュメントに進みます。</li>
</ol>11. スライドに取り付けられる切片組織の染色のための修正されたプロトコル
<ol><li>パップペンで染色する組織を囲む。</li>
	<li>湿気の多いチャンバーにスライドを移します。</li>
	<li>スライドに直接 1 mL の PBS を追加します。</li>
	<li>室温で7分間インキュベートし、埋め込み培地を除去する。</li>
	<li>スライドを反転させることによってPBSを注ぎます。</li>
	<li>最大1 mLのTNTバッファー(100 mMトリスpH 8.0、150 mM NaCl、0.1%Tween20)で1mInを再水和します。</li>
	<li>最大1 mLのブロッキング溶液(市販または10%血清+2%BSA)を室温で1時間ブロックします。</li>
	<li>1%血清またはブロッキング溶液で4°Cで希釈した一次抗体で一晩インキュベートする。</li>
	<li>室温で最大1 mLのTNTバッファーで5回洗浄します。</li>
	<li>2次抗体で室温で2時間、または4°Cで一晩インキュベートする。ホイルでチャンバーを覆うか、暗い蓋を使用してください。</li>
	<li>TNTで5回室温で洗います。最後の洗濯物を注ぎます。</li>
	<li>マウント媒体とカバースリップの2-3滴でマウントします。5-10分座りましょう。</li>
	<li>透明なマニキュアを使用してスライドにカバーガラスをシールします。撮影前に完全に乾燥させます。</li>
</ol>12. ドキュメント
<ol><li>ラボ ノートブックで、完全な手順と偏差を記録します。</li>
	<li>一次抗体の濃度、名前、カタログ番号、製造業者、およびロット番号を記録します。</li>
	<li>適切に取り付けられたサンプルを顕微鏡ステージに置きます。対象地域を検索します。</li>
	<li>比較的明るい例を選択します。カメラの露出とゲインを設定して、信号が飽和状態にならずに十分に明るくなります。</li>
	<li>実験抗体標識胚と対照抗体(例えばIgG)胚との間で比較する際に、同じ露光設定を用いて同じ対象領域の染色強度を比較する。</li>
</ol>

<ol><li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nature Genetics. 26 (2), 216-220 (2000).</li>
<li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZFN%2C+TALEN%2C+and+CRISPR%2FCas-based+methods+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li>
<li>Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+and+efficient+genome+editing+in+zebrafish+using+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system.</a> Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).</li>
<li>van der Ploeg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+nucleic+acid+research+during+the+twentieth+century%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical nucleic acid research during the twentieth century.</a> European Journal of Histochemistry. 44 (1), 7-42 (2000).</li>
<li>Marrack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nature+of+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nature of Antibodies.</a> Nature. 133 (3356), 292-293 (1934).</li>
<li>Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+properties+of+an+antibody+containing+a+fluorescent+group%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).</li>
<li>Lopez, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+in+situ+Hybridization%2FImmunohistochemistry+%28ISH%2FIH%29+on+Free-floating+Vibratome+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Combined in situ Hybridization/Immunohistochemistry (ISH/IH) on Free-floating Vibratome Tissue Sections.</a> Bio-protocol. 4 (18), (2014).</li>
<li>Morimoto, M., Morita, N., Ozawa, H., Yokoyama, K., Kawata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+glucocorticoid+receptor+immunoreactivity+and+mRNA+in+the+rat+brain%3A+an+immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of glucocorticoid receptor immunoreactivity and mRNA in the rat brain: an immunohistochemical and in situ hybridization study.</a> Neuroscience Research. 26 (3), 235-269 (1996).</li>
<li>Newton, S. S., Dow, A., Terwilliger, R., Duman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+combined+immunohistochemistry+and+in-situ+hybridization+in+fresh-frozen%2C+cryocut+mouse+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A simplified method for combined immunohistochemistry and in-situ hybridization in fresh-frozen, cryocut mouse brain sections.</a> Brain Research Protocols. 9 (3), 214-219 (2002).</li>
<li>Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorthell%2C+JT+%22Basic+Molecular+Protocols+in+Neuroscience%3A+Tips%2C+Tricks%2C+and+Pitfalls%22">Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls</a>. Corthell, J. T. , Academic Press. 105-111 (2014).</li>
<li>Corthell, J. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorthell%2C+JT+%22Basic+Molecular+Protocols+in+Neuroscience%3A+Tips%2C+Tricks%2C+and+Pitfalls%22">Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls</a>. Corthell, J. T. , Academic Press. 91-103 (2014).</li>
<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li>
<li>Semache, M., Ghislain, J., Zarrouki, B., Tremblay, C., Poitout, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+and+duodenal+homeobox-1+nuclear+localization+is+regulated+by+glucose+in+dispersed+rat+islets+but+not+in+insulin-secreting+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Pancreatic and duodenal homeobox-1 nuclear localization is regulated by glucose in dispersed rat islets but not in insulin-secreting cell lines.</a> Islets. 6 (4), e982376(2014).</li>
<li>Kang, H. S., Beak, J. Y., Kim, Y. S., Herbert, R., Jetten, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glis3+is+associated+with+primary+cilia+and+Wwtr1%2FTAZ+and+implicated+in+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Glis3 is associated with primary cilia and Wwtr1/TAZ and implicated in polycystic kidney disease.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (10), 2556-2569 (2009).</li>
<li>Billova, S., Galanopoulou, A. S., Seidah, N. G., Qiu, X., Kumar, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+expression+and+colocalization+of+somatostatin%2C+carboxypeptidase-E+and+prohormone+convertases+1+and+2+in+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical expression and colocalization of somatostatin, carboxypeptidase-E and prohormone convertases 1 and 2 in rat brain.</a> Neuroscience. 147 (2), 403-418 (2007).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish+%28Danio+Rerio%29%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio)</a>. , University of Oregon Press. (2000).</li>
<li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Cheng, C. N., Li, Y., Marra, A. N., Verdun, V., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+preparation+for+observation+and+analysis+of+zebrafish+embryo+specimens+stained+by+whole+mount+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flat mount preparation for observation and analysis of zebrafish embryo specimens stained by whole mount in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).</li>
<li>Brennan, C., Mangoli, M., Dyer, C. E. F., Ashworth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholine+and+calcium+signalling+regulates+muscle+fibre+formation+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Acetylcholine and calcium signalling regulates muscle fibre formation in the zebrafish embryo.</a> Journal of Cell Science. 118 (22), 5181(2005).</li>
<li>Liu, D. W., Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+muscle+acetylcholine+receptors+requires+motoneurons+in+live+embryos%2C+but+not+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Clustering of muscle acetylcholine receptors requires motoneurons in live embryos, but not in cell culture.</a> The Journal of Neuroscience. 12 (5), 1859(1992).</li>
<li>Borodinsky, L. N., Spitzer, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+neurotransmitter-receptor+matching+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent neurotransmitter-receptor matching at the neuromuscular junction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (1), 335-340 (2007).</li>
<li>Brunelli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+reinnervation+through+peripheral+nerve+graft+dictates+assembly+of+glutamatergic+synapses+at+rat+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic reinnervation through peripheral nerve graft dictates assembly of glutamatergic synapses at rat skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (24), 8752-8757 (2005).</li>
<li>Hans, F., Dimitrov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3+phosphorylation+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Histone H3 phosphorylation and cell division.</a> Oncogene. 20 (24), 3021-3027 (2001).</li>
<li>Yee, N. S., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+for+pancreatic+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model for pancreatic cancer research.</a> Methods in Molecular Medicine. 103, 273-298 (2005).</li>
<li>Seth, A., Stemple, D. L., Barroso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+use+of+zebrafish+to+model+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The emerging use of zebrafish to model metabolic disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (5), 1080-1088 (2013).</li>
<li>Fontana, B. D., Mezzomo, N. J., Kalueff, A. V., Rosemberg, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developing+utility+of+zebrafish+models+of+neurological+and+neuropsychiatric+disorders%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">The developing utility of zebrafish models of neurological and neuropsychiatric disorders: A critical review.</a> Experimental Neurology. 299 (Pt A), 157-171 (2018).</li>
<li>Richter, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glyoxal+as+an+alternative+fixative+to+formaldehyde+in+immunostaining+and+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy.</a> The EMBO journal. 37 (1), 139-159 (2018).</li>
<li>Elsalini, O. A., Rohr, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+disrupts+thyroid+function+in+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development+genes+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish.</a> Development genes and evolution. 212 (12), 593-598 (2003).</li>
<li>Wang, W. D., Wang, Y., Wen, H. J., Buhler, D. R., Hu, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenylthiourea+as+a+weak+activator+of+aryl+hydrocarbon+receptor+inhibiting+2%2C3%2C7%2C8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced+CYP1A1+transcription+in+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Phenylthiourea as a weak activator of aryl hydrocarbon receptor inhibiting 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-induced CYP1A1 transcription in zebrafish embryo.</a> Biochemical pharmacology. 68 (1), 63-71 (2004).</li>
<li>Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenothiourea+sensitizes+zebrafish+cranial+neural+crest+and+extraocular+muscle+development+to+changes+in+retinoic+acid+and+IGF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and IGF signaling.</a> PloS one. 6 (8), e22991(2011).</li>
<li>Inoue, D., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+for+all--a+highly+efficient+and+versatile+method+for+fluorescent+immunostaining+in+fish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">One for all--a highly efficient and versatile method for fluorescent immunostaining in fish embryos.</a> PLoS One. 6 (5), e19713(2011).</li>
</ol>

著者らは開示する情報を持っていません。

免疫組織化学は、生物に関心のあるほぼすべてのタンパク質の時空間的発現を特徴付けるために使用できる汎用性の高いツールです。免疫組織化学は、多種多様な組織およびモデル生物に使用される。このプロトコルはゼブラフィッシュでの使用のために最適化されています。異なる種の免疫組織化学は、異なる固定および取り扱い技術、種および内因性ペルオキシダーゼの存在に応じて溶液を遮断し、組織の厚さと組成によるインキュベーション時間を必要とするかもしれない。ゼブラフィッシュのIHCは、癌24、代謝疾患25、神経疾患26、および人間の健康に大きな関連性を持つ他の多くの分野の理解を進める上で不可欠であった。IHCの大きな利点の1つは、この手順がISHなどの他の技術と比較して比較的短く、技術的に要求が厳しくなくてはならないということです。しかし、検体の年齢、標的とする抗原、および使用されている抗体に基づいて最適化を必要とする多数のステップがあります。
このプロトコルの複数のス...

ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、短期間、急速な発達、遺伝的手法の評価可能性など、いくつかの理由から、生物学的プロセスの研究のための強力なモデルとして登場しました。その結果、ゼブラフィッシュは、一般的に、毒性研究や創薬のためにハイスループットの低分子スクリーンで使用されています。ゼブラフィッシュはまた、単一の女性が日常的に一度に50〜300個の卵を生産することができ、光学的に透明な胚が外部的に発達し、発生過程を効率的に視覚化できることを考えると、発達プロセスの研究のための魅力的なモデルである。しかし、初期の研究は、逆遺伝的技術を確立する際の課題のために、N-エチルN-ニトロソーレ(ENU)または他の変異原体を使用して前方遺伝的スクリーンに主に依存していた。およそ20年前、ゼブラフィッシュで最初にモルフォリノが使用され、標的遺伝子1をノックダウンしました。モルフォリノスは、初期の発生段階で胚への微小注入後の標的mRNAの翻訳を阻害する小さなアンチセンスオリゴヌクレオチドである。モルフォリノの主な弱点は、細胞が分裂するにつれて希釈され、一般的に受精後72時間(hpf)によって有効性を失うことである。形態素はゼブラフィッシュ遺伝子破壊のための強力なツールであり続けるが、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、およびクラスター化された定期的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート(CRISPR)は、ゼブラフィッシュゲノム2、3を直接標的にするために使用されている。これらの逆遺伝戦略は、前方遺伝学および高スループットスクリーンと組み合わせて、遺伝子発現および機能を研究するための強力なモデルとしてゼブラフィッシュを確立している。
遺伝子機能を研究する能力は、一般に、遺伝子または遺伝子産物発現の時空間的分布の評価を必要とする。初期の開発中にこのような発現パターンを視覚化するために最も一般的に使用される2つの技術は、その後のハイブリダイゼーション(ISH)と全実装免疫賦技化学(IHC)です。in in situハイブリダイゼーションは1969年に初めて開発され、生物4におけるmRNA発現を検出するために標識アンチセンスRNAプローブの使用に依存している。対照的に、標識抗体は、タンパク質発現を視覚化するために免疫組織化学に使用されます。検出用にタンパク質を標識するという考えは1930年代5年にさかのぼり、FITC標識抗体が感染組織6の病原細菌を検出するために使用された1941年に最初のIHC実験が発表されました。ISH と IHC は、その後の数十年にわたって大幅に進化し、改善し、現在では分子診断研究所7、8、9、10、11で日常的に使用されています。どちらの手法にも利点と欠点がありますが、IHC には ISH に対していくつかの利点があります。実際には、IHCはISHよりも時間がかかり、一般抗体のコストに応じて一般的に安価です。また、mRNA発現は、mRNAの豊富なmRNA量12によって約3分の1のタンパク質の存在量変動しか説明できないことがマウスおよびヒトで実証されているように、常に確実なタンパク質発現指標とは限らない。このため、IHC は可能な場合に ISH データを確認する重要な補足です。最後に、IHCは、イシュ13、14、15で決定できない細胞内および共局在データを提供することができる。ここでは、ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山中の免疫賦形化学によってタンパク質を確実に検出する段階的な方法を説明します。この技術の目的は、胚全体に目的のタンパク質の空間的および時間的発現を決定することです。この技術は、抗原特異的一次抗体と蛍光タグ付き二次抗体を利用する。このプロトコルは、スライド取り付けされた組織切片での使用や、蛍光の代わりに発泡性基質での使用に容易に適応可能です。このプロトコルを用いて、ゼブラフィッシュ骨格筋の開発は、アセチルコリン受容体に加えて、電夫グルタミン酸受容体を発現することを実証する。NMDA型グルタミン酸受容体サブユニットは、23hpfで縦筋上で検出可能である。

<table><tbody><tr><td>アガロー</td>ス <td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>アルミ箔、ヘビーデューティー</td><td>カークランド</td><td></td><td>任意のブランドを代用可能</td></tr><tr><td>抗NMDA抗体</td><td>ミリポア シグマ</td><td>MAB363</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化ヒストン H3 (Ser10)、クローン RR002</td><td>ミリポア シグマ</td><td>05-598</td><td></td></tr><tr><td>抗パン AMPA 受容体 (GluR1-4)</td><td>ミリポア シグマ</td><td></td><td></td>MABN832</tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>硝酸カルシウム [Ca(NO3)2]</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4955</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離チューブ、1.5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>クリア マニキュア</td><td>サリー・ハンソン</td><td></td><td>任意のマニキュアまたは硬化剤を代用できます</td></tr><tr><td>Depression (concavity) slide</td><td>Electron Miscroscopy Sciences</td><td>71878-01</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Thermo Scientific</td><td>1855920</td><td></td></tr><tr><td>Embryo medium, Danieau, 30%</td><td></td><td></td><td>17.4 mM NaCl, 0.21 mM KCl, 0.12 mM MgS04, 0.18 mM Ca(NO3)2, 1.5 mM HEPES 超純水中。</td></tr><tr><td>胚培地、E2</td><td></td><td></td><td>7.5 mM NaCl、0.25 mM KCl、0.5 mM MgSO4、75 &mu;M KH2PO4, 25 uM Na2HPO4, 0.5 mM CaCl2, 0.35 mM NaHCO3, 0.5 mg/L メチレンブルー</td></tr><tr><td>フローティングチューブホルダー</td><td>Thermo Scientific</td><td>59744015</td><td></td></tr><tr><td>蛍光化合物顕微鏡</td><td>Leica Biosystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡</td><td>ライカBiosystems</td><td>M165-FC</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ 18 mm x 18 mm</td><td>Corning</td><td>284518</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ 22 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>22-050-222</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>蓋付き湿潤チャンバー</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素、30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-500</td><td></td></tr><tr><td>Immunedge pap ペン</td><td>Vector labs</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>昆虫ピン、サイズ00</td><td>Stoelting</td><td>5213323</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム(MgSO4 &middot; 7H2O)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>メッシュストレーナー</td><td>Oneida</td><td></td><td>任意のブランドを置き換えることができます</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブキャップロック</td><td>研究製品 国際</td><td>145062</td><td></td></tr><tr><td>電子レンジ</td><td>トーストマスター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>I8765</td><td></td></tr><tr><td>ノーマル ヤギ血清</td><td>ミリポア シグマ</td><td>S02L1ML</td><td></td></tr><tr><td>ナットミキサー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>88-861-044</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>04042-500</td><td></td></tr><tr><td>パスツール・ピペット</td><td>フィッシャーScientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBTriton</td><td></td><td></td><td>1% TritonX-100 in 1x PBS</td></tr><tr><td>Permount mounting medium</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (ガラス)</td><td>パイレックス</td><td>3160100</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (プラスチック)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1-フェニル 2-チオ尿素</td><td>アクロス オーガニックス 207250250</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、10x、pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、1x</td><td></td><td></td><td>1x dH2O</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td> で希釈した 10x ストックから作られました<td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>Fisher</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性 (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10165921001</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2544</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム (NaCl)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム (Na2HPO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>ふたとインサート付き産卵タンク</td><td>Aquaneering ZHCT100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperBlock PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>37515</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost + スライド</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Superglue gel</td><td>3M Scotch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNT</td><td></td><td></td><td>100 mM トリス、pH 8.0;150 mM NaCl;0.1% トゥイーン20;dH2O</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td>製 フィ<td>ッシャー13-711-7M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリクロロ酢酸(Cl3CCOOH)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S374-500</td><td></td></tr>トリ<tr><td>トンX-100</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>T9284</td><td></td></tr>トゥ<tr><td>イーン20</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>超極細鉗子</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>16-100-121</td><td></td></tr><tr><td>水・超高純度/二重蒸留</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>W2-20</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

免疫賦技化学は、正常な発達状態と疾患状態の両方でタンパク質の発現および局在を調べる広く使用されている技術です。多くの免疫組織化学プロトコルは哺乳類の組織および組織切片に最適化されているが、これらのプロトコルは、多くの場合、非哺乳類モデル生物の修飾および最適化を必要とする。ゼブラフィッシュは、発達過程の分子、遺伝、細胞の生物学的メカニズムを調べるための基礎的、生物医学的、および翻訳的研究のモデルシステムとしてますます使用されています。ゼブラフィッシュはモデルシステムとして多くの利点を提供しますが、最適なタンパク質検出のために修正技術も必要です。ここでは、ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全実装蛍光免疫化学に関するプロトコルを提供します。このプロトコルでは、さらに、使用できるいくつかの異なる取り付け戦略と、各戦略が提供する利点と欠点の概要について説明します。また、このプロトコルの改変により、全実装組織における発がん基質の検出と、切片された幼虫組織における蛍光検出を可能にする。このプロトコルは、多くの発達段階および胚構造の研究に広く適用可能である。

全実装免疫組織化学は、無傷の動物におけるタンパク質発現の空間パターンを検出するために抗体を使用する。免疫組織化学の基本的なワークフロー(図1に示す)は、ゼブラフィッシュの繁殖、胚の発生および調製、非特異的抗原のブロッキング、目的のタンパク質を標的とする抗原特異的一次抗体の使用、標識された二次抗体を有する一次抗体の検出、標本の取り付け、および文書化を含む。
全実装免疫賦体化学は、ゼブラフィッシュの開発中に空間的および時間的なタンパク質発現の研究に役立つ貴重なツールです。ゼブラフィッシュは、運動ニューロンが接触する前の19hpfの前に始まるギャップ接合によって媒介される自発的収縮を示す19。ゼブラフィッシュ神経筋接合は、他の脊椎動物と同様に、ニコチン性アセチルコリン受容体で作用するアセチルコリンによって媒介される。これらの組み立て型受容体は、まず約1...

ここでは、ゼブラフィッシュ胚および幼虫の全製剤におけるタンパク質の蛍光抗体媒介検出に関するプロトコルを提示する。

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

全体のマウント免疫組織化学は、標識された抗体を使用して組織または生物内のタンパク質を直接空間的および時間的に観察することを可能にする比較的迅速かつ簡単な技術です。この技術の有用性は、それを第1の切片にすることなく、無傷の組織または生物の染色を可能にし、共焦点顕微鏡を使用してタンパク質発現パターンの三次元表現を生成することができる。免疫体化学は、疾患の根源となる病因と分子メカニズムを理解するために、生物医学研究で広く使用されています。また、病理学的サンプルの腫瘍を同定するための貴重な診断ツールです。まず、システムの水で満たされた産卵タンクを準備し、メッシュまたはスロットライナーを所定の位置に置きます。一晩タンク内のグループに大人のゼブラフィッシュ混合セックスペアを配置します。14時間/10時間の明暗サイクルを使用し、9時.mにライトが点灯します。翌朝、ライトをつけた後、生卵水を新鮮なシステムの水で交換して、フェクを取り除きます。卵が産まれると、大人を自宅のタンクに戻します。転送ピペットを使用してそれらを描画することにより、卵を収集します。胚培地で半分に満たされた各ペトリ皿に50個の卵を移します。死んでいるか、分裂しなかった不透明で曇った卵を取り除きます。受精後23時間まで28.5°Cで卵の皿をインキュベートします。胚が受精後24時間より古い場合、ピペットを用いて胚培地中の200ミクロモルPTUに移してメラニン形成を防ぐ。ステレオ顕微鏡の下で、超微細な先端鉗子を使用して、孵化していない胚をデコールリアテットする。火で磨いたパスツールピペットを使用して損傷を最小限に抑え、胚培地に溶解した1〜2%のアガロースでコーティングされたガラスまたはプラスチックペトリ皿に移します。その後、プラスチックまたは火で研磨されたピペットを使用して胚を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。マイクロピペットで胚培地を取り除きます。胚を覆うのに十分な液体だけを残してください。室温で穏やかな揺れで4%PFAで胚を1〜2時間固定します。次に、1X PBSで胚を3回、PBTritonを1%で5分間洗浄します。すぐに胚を使用するか、最大1週間摂氏4度で保存します。長期保存のために、脱水し、マイナス20°Cで100%メタノールで胚を保存します。胚を水分補給するには、最終洗浄のためにメタノールとPBSおよびPBTritonの量を減少させ、室温でそれぞれ5分間連続インキュベーションを行う。原稿に従って胚の準備を進める。BSAのミリリットル当たり2ミリグラムの有無にかかわらずPBTritonの10%ヤギ血清など、二次抗体宿主種に一致するブロッキング溶液を選択する。胚を含むチューブに0.5ミリリットルのブロッキング溶液を加え、室温で1〜3時間ロッカーにチューブを置きます。次に、ブロッキング溶液で希釈された一次抗体で胚をインキュベートし、揺れながら摂氏4度で一晩PBTritonを行います。朝、PBTritonで胚を揺らしながら室温でそれぞれ10分間5回洗浄します。次に、一次抗体の宿主種と所望の波長を488ナノメートルで基づいて二次抗体を選択する。ブロック溶液中で希釈した二次抗体を胚を含むチューブに加えます。チューブをアルミホイルで覆い、揺れながら室温で2時間インキュベートします。その後、胚をPBTritonでそれぞれ10分間洗浄し、アルミホイルで覆い、揺れ動かします。ピペットを用いて、胚培地中の2%アガロースのベッド上でPBS中の50%グリセロール溶液に胚を移す。黄身を取り除くために、1X PBSの200マイクロリットルをうつ病スライドまたはプレーンガラススライドに移します。プラスチック製の転写ピペットを使用して、1つ以上の胚をPBS液滴に移動します。超微細な鉗子と二重ゼロの昆虫ピンを使用して黄身を分解し、胚の腹側表面から黄身顆粒を非常に穏やかに削ります。黄身顆粒を取り出し、必要に応じてPBSで補充します。取り付け後、サンプルを顕微鏡のステージに置きます。比較的明るい例を選択して、対象地域を見つけます。信号が飽和することなく十分に明るくなり、カメラの露出とゲインを調整します。実験用抗体標識胚と対照抗体胚とを比較する場合は、同じ露光設定を使用する。このマウント免疫体化学全体のプロトコルは、ゼブラフィッシュの開発を用いた空間的および時間的タンパク質発現の研究に役立つツールです。NMDA型グルタミン酸受容体のGluN1サブユニットは、受精後23時間でゼブラフィッシュの筋肉を発達させるグルタミン酸受容体サブユニットの発現を明らかにした。72時間受精後の胚の凍結切片をスライドに取り付け、増殖細胞のマーカーであるホスホ-H3に対して免疫染色した。いくつかの細胞は、ホスホ-H3を発現し、その発現は心室帯で最も顕著であった。マウスIgG対照抗体および一次抗体を除くと、低レベルの非特異的発現が明らかになった。検出を確実にし、非特異的染色を最小限に抑えるためには、一次抗体宿主種に基づいて適切なブロッキング溶液および二次抗体を選択することが重要です。免疫体化学は、観察されたシグナルが実際に目的のタンパク質であることを確認する必要があります。フォローアップ実験は、通常、遺伝的または環境的に改変された生物を使用して含まれます。免疫組織化学は、研究者に、その際のタンパク質を観察する能力を与え、特に胚発生時に基礎生物学と応用生物学の両方で多くのシステムの理解を大幅に加速します。メタノールとホルムアルデヒドは有毒であり、慎重に取り扱う必要があります。廃棄物は、制度上の手続きに従って回収し、処分する必要があります。

whole-mount-immunohistochemistry-in-zebrafish-embryos-and-larvae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

in situハイブリダイゼーション全体のマウントは、発生生物学で最も広く使用されている技術の一つです。ここで、我々は、単一の遺伝子の正確な発現パターンを解析するためと、二つの遺伝子の発現領域の重なりを判定するためのin...

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

ゼブラフィッシュ胚の心臓の免疫染色を実施する迅速な方法が説明されています。全体のマウント免疫染色の手法に比べ、この方法は劇的に非常に低下処理時間内に心臓の細胞/細胞内構造を明らかに高解像度の画像を得ることができる抗体の浸透を、増加させる。...

ディテールに秘められたゼブラフィッシュ胚心臓の免疫染色

ゼブラフィッシュは、小さな熱帯魚は、脊椎動物の発生と疾患の間に遺伝子機能を研究するための人気のあるモデルとなっている。標的遺伝子の時間的および空間的な表現は次式で求めることができる...

高解像度全マウント<em&gt;その場で</em遺伝子発現と機能を研究するためにゼブラフィッシュ胚内&gt;ハイブリダイゼーション

このような増殖、パターニング、分化、および軸索ガイダンスとして発生プロセスを容易にゼブラフィッシュ脊髄でモデル化することができる。この記事では、これらのイベントの可視化を最適化した、ゼブラフィッシュ胚の取付け手順を説明します。...

解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

ゼブラフィッシュ胚は、発生生物学の研究のための優れたモデルである。胚発生の間に、ゼブラフィッシュは、試料観察および分析のための3次元の課題が卵黄塊で開発しています。このプロトコルは、その場でホールマウントの準備を取り付ける2次元の平面を作成する方法について説明します（WISH）は、ゼブラフィッシュ胚の標本を染色した。...

ホールマウントによるゼブラフィッシュ胚標本ステンドの観察および分析のためのフラットマウントの準備<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

技術は全体のゼブラフィッシュ胚におけるホスホ - エピトープを免疫染色した後、一次繊毛のように小さな細胞構造の二色の蛍光共焦点の局在化を行うことが記載されています。固定およびイメージングのための技術は、特定のタンパク質の出現または活性化の位置と速度を定義することができます。...

ホールマウントゼブラフィッシュ胚の繊毛器官におけるリン酸化エピトープを免疫染色

繊毛の開発は適切な器官形成に不可欠です。このプロトコルでは、ラベルを付けると、ゼブラフィッシュの繊毛細胞を可視化する最適化されたメソッドについて説明します。...

全体のマウント蛍光In Situハイブリダイゼーション、免疫組織の結合されたプロトコルを介してゼブラフィッシュにおける Multiciliated の細胞を可視化します。

このプロトコルは、初期のゼブラフィッシュ胚からの凍結切片に対する順次免疫蛍光および免疫組織化学を示し、特定の細胞集団における正確なコローカリゼーション分析を可能にする。...

凍結切除ゼブラフィッシュ胚に対する順次免疫蛍光と免疫組織化学

この記事では、長時間経過共焦点顕微鏡用に脆弱なゼブラフィッシュ胚を取り付ける方法について説明する。この低コストの方法は、任意の反転顕微鏡でイメージングするための通常のガラス底顕微鏡用皿を使用して簡単に行うことができます。取り付けは、異なる濃度でアガロースの層で行われる。...

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

このプロトコルでは、ゼブラフィッシュ胚切片の in situ ハイブリダイゼーションと免疫組織化学を組み合わせて画像を取得する方法について説明します。凍結切片の前に in situ...

その場で 凍結切片ゼブラフィッシュ胚における免疫組織化学と組み合わせたハイブリダイゼーション

ここでは、3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ仔魚の in vivo...

インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

学ぶゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫組織化学法。蛍光標識抗体を用いてタンパク質発現を三次元的に可視化し、発生生物学におけるタンパク質動態の研究に有用な手法です。

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

さらに動画を探す