Name: 中国ハムスター卵巣細胞培養におけるハイスループット自動マイクロバイオリアクターを用いたプロセス最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 学ぶ自動マイクロバイオリアクターによるDOE実験計画法と細胞培養プロセス最適化の手法。中国ハムスター卵巣細胞を用いたハイスループット実験とタンパク質定量分析の効率的なデータ解析技術を習得できます。

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著者らは、ドイツの連邦教育研究省(BMBF)、ドイツのサルトリウス・ステディム・バイオテック社のバイオプロセッシングチームの支援に感謝したいと考えています。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

収量を増やすためにプロセスの最適化は、バイオ医薬品業界で非常に重要です。シェイクフラスコは、潜在的に株のスクリーニングに使用することができます。ただし、pH や DO などのプロセス パラメータの監視はフラスコでは使用できません。マイクロバイオリアクターは、プロセスの継続的な監視と制御を可能にする利点があります。マイクロバイオリアクターにおけるこれらの制御ループは、より大きなスケールでの条件と同様の条件を提供し、したがって、より大規模なバイオリアクターに匹敵する結果を提供する。マイクロバイオリアクターのもう一つの利点は、時間および労力12、13,の点でベンチトップバイオリアクターと比較したときに、同じ時間枠内で低コストで試験することができる条件の広い範囲である。小さいサイズはまた、基板の量が減少し、並列操作のためのスペースの要件を減らすことによる低ランニングコストの点でも有利です。しかし、ベンチトップ多用途バイオリアクターと比較すると、単回使用マイクロバイオリアクターで栽培を実行する方が高価である可能性があるため、船舶の...

世界のバイオ医薬品市場は2018年に2,500億米ドル以上の価値があり、継続的に拡大しています 1 .製薬会社は、小分子薬の製造から組み換えタンパク質などのバイオテクノロジーで製造された治療薬に移行しています。これらだけでも1,500億ドル以上の収益が1.5億ドルを超える。哺乳動物細胞は現在、これらの医薬組換えタンパク質の生産に広く使用されている。現在の期間において、哺乳動物細胞によって産生される68の承認された製品のうち、57は中国のハムスター卵巣細胞(CHO)2によって産生される。CHO細胞は、翻訳後修飾を必要とする組換えタンパク質の製造に特に使用されます。これらの細胞は、懸濁液中で増殖し、それによって血清フリーの化学的に定義された培地33、44で再現可能な結果を可能にする好ましい。CHO細胞を用いるもう1つの利点は、産物のグリカン構造がヒトモノクローナル抗体(mAb)に類似しており、遺伝子増幅による組換えタンパク質収率および特異的生産性の向上をもたらす5。
組換えCHO(rCHO)細胞培養の収量は、過去20年間で100倍に増加しました。この改善は、プロセスパラメータの最適化、摂食戦略および無血清化学的に定義された培地6の開発に起因する。医薬品の要求の増加に伴い、生産プロセス7の開発のためのコストと時間効率の圧力が高まります。製品品質を保証しながら圧力を軽減するために、製薬業界の焦点は設計品質(QbD)にリダイレクトされました。QbD は、製品の生産とプロセスを理解するために使用されます。ObD で使用される重要なツールは実験の設計 (DOE) です。さまざまな入力変数と結果の出力データの関係を明らかにすることで、プロセスの理解を深めるのに役立ちます。DOEアプローチを適用してバイオプロセスを最適化することは、プロジェクトの初期段階でプロセス条件を同化し、タイターの量と品質を高める上で有益です。このアプローチは、昔ながらの戦略と比較すると有益です: 一時1ファクター (OFAT)。古典、シャイニン、田口を用いたDOEに対する統計的アプローチはOFAT8よりはるかに優れている。
プロセスおよび媒体の最適化は、シェイクフラスコで行うことができる。フラスコは比較的安価です。しかし、温度、pH、溶存酸素(DO)などのパラメータを制御することはできません。これらの欠点を克服するために、0.5 Lから5 Lの働く容積から及ぶ多用のベンチトップバイオリアクターを使用することができる。原子炉は広範なインライン監視およびプロセス制御を提供する。しかし、多用途バイオリアクターの使用は時間と労力を要する。これらの欠点を克服するために、ベンチトップバイオリアクターを監視する包括的なプロセスとシェイクフラスコの容易な取り扱いを組み合わせた新しい単回使用バイオリアクターが使用されています。高スループットスクリーニングシステムとシングルユース技術は、プロセス性能と開発の効率を高める9.
この記事では、自動マイクロバイオリアクター(AMBR)ソフトウェアにレシピをロードするためのガイドラインをリストします。異なる攪拌機の速度とpHが生存細胞濃度(VCC)および力乗に及ぼす影響は、この実験の過程で検討される。実験結果及び分析は、実験用ソフトウェアMODDE12の設計を用いて行う。製品分析は、プロテインAカラムを備えた高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)システムで行われます。mAbのFc領域は、高親和性10,11,11のプロテインAに結合するという原理に基づいている。この方法により、mAbを同定し定量することができる。定量は、280nmで測定された溶出ピーク領域上で行われる。

<table><tbody><tr><td>1 mL ディスポーザブル ピペット チップ、滅菌済み</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>A-0040</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-グルタミン</td><td>コーニング、メルク</td><td>25-005-CV</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル ディープ ウェル プレート</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>A-0038</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ディスポーザブル ピペット チップ、滅菌済み</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>A-0039</td><td></td></tr><tr><td>ambr 15 自動化マイクロバイオリアクターシステム</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>001-2804</td><td></td></tr><tr><td>ambr 15 細胞培養 24 使い捨てバイオリアクター - Sparged</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>001-1B86</td><td></td></tr><tr><td>Antifoam C Emulsion</td><td>Sigma-Aldrich, Merck</td><td>A8011</td><td></td></tr><tr><td>Bottle Top Sterile filter</td><td>Corning, Merck</td><td>CLS431474</td><td>0.1 &mu;細孔径</td></tr><tr><td>CEDEX 洗剤 (3% ムコゾール)</td><td>Roche Innovatis AG</td><td>05-650-658-001</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>Roche Innovatis AG</td><td>05-650-216-001</td><td>CEDEX HiRes</td></tr><tr><td>CHO DG44 細胞株</td><td>Cellca, Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CHOKO Feed Media A (FMA)</td><td>Sigma-Aldrich, Merck</td><td>CR80025</td><td></td></tr><tr><td>CHOKO Feed Media B (FMB)</td><td>Sigma-Aldrich,メルク</td><td>CR80026</td><td></td></tr><tr><td>CHOKO 生産培地</td><td>Sigma-Aldrich, メルク</td><td>CR80027</td><td></td></tr><tr><td>CHOKO ストックカルチャー Meium</td><td>Sigma-Aldrich, Merck</td><td>CR80028</td><td></td></tr><tr><td>Chromaster 高圧液体クロマトグラフィーシステム</td><td>VWR 国際</td><td></td><td></td></tr><tr><td>円錐遠心分離管</td><td>コーニング, メルク</td><td>SIAL0790</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td></td><td></td>1070179026</tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>56-40-6</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Vials</td><td>VWR International</td><td>SUPLSU860181</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich,Merck</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Protein A カラム</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1502226</td><td>POROS&trade;A 1.7&nbsp;mL</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich,Merck</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水</td><td>Sigma-Aldrich,Merck</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR International</td><td>VWRVK940</td><td></td></tr><tr><td></td><td>YSI YSI Inc</td><td>2900D</td><td>YSI 2900 Select</td></tr></tbody></table>

中国ハムスター卵巣細胞培養におけるハイスループット自動マイクロバイオリアクターを用いたプロセス最適化

Process Optimization using High Throughput Automated Micro-Bioreactors in Chinese Hamster Ovary Cell Cultivation

バイオプロセスの最適化は、バイオ医薬品業界において、望ましい製品の収量を増やすために重要です。これは、ひずみの選択とバイオプロセスパラメータの開発によって達成することができます。この目的のために振るフラスコが使用されています。しかし、pHや溶存酸素(DO)などのプロセスパラメータを制御する能力がありません。この制限は、自動化されたマイクロバイオリアクターの助けを借りて克服することができます。これらのバイオリアクターは、より大きなスケールでの栽培を模倣します。このシステムの大きな利点の1つは、実験計画(DOE)をソフトウェアに統合することです。この統合により、複数のプロセスパラメータを同時に変更できる設計を確立できます。重要なプロセスパラメータと最適なバイオプロセス条件は、ソフトウェア内で分析できます。ここで紹介する作業の焦点は、ソフトウェアのプロセス設計に関わるステップと、栽培の過程におけるDOEの組み込みについて、ユーザーに紹介することです。

この研究で行われた栽培の概要を図2に示す。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60577/60577fig02.jpg"> 図2:培養局におけるpHおよび撹拌速度プロファイルを試験するための実験条件の概略表現。図はまた、船を配置するための正しいレイアウトを表しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60577/60577fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
自動化されたマイクロバイオリアクターの細胞増殖は、多用途バイオリアクターに匹敵する。これは 図3に示し...

ここでは、自動マイクロバイオリアクターで実験計画を実行し、その後にプロテインAカラムを用いた細胞収穫およびタンパク質定量を行う詳細な手順を提示する。

Optimization of bioprocesses to increase the yield of desired products is of importance in the biopharmaceutical industry. This can be achieved by strain ...

このビデオでは、ユーザーは実験またはDOEの計画と実行を伴うマイクロバイオリアクターソフトウェアに導入しました。また、分析器の補助バルブも、プロセス条件を最適化するために実証されています。自動化されたマイクロバイオリアクターソフトウェアへのモデの組み込みは、データ分析のための公式となっています。小規模で同時に多数の実験を計画し、実行することができます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、タマンナ・ナグライクです。テキストプロトコルに記載されているように、主な培養におけるプレカルチャー手順から始めます。新しい実験を作成するには、アンバーの自己培養ソフトウェアを開き、[導入] タブをクリックして新しい実験を作成します。新しい実験タブで、実験の名前と実験の実施日を入力します。栽培中に使用する容器内の培養ステーションのチェックポイントを有効にします。DOE実験のプログラミング中に簡単に移行するために、DOEタグを自動追加することもできます。次のタブに切り替えるには、「次へ」をクリックします。発泡防止、接種、飼料、およびグルコースとともに容器への培地の添加に関する情報を設定するには、追加メディアプレートのチェックポイントをアクティブにします。プレートの種類、名前、およびメディアを含むプレートの位置を定義します。[船舶にメディアを追加]をクリックします。船舶に追加する媒体の容積を入力します。プレートから船舶へのメディア転送のマッピングを定義します。次のタブに切り替えるには、「次へ」をクリックします。メディア情報をソフトウェアに供給した後、栽培条件を割り当てます。条件メディアをクリックし、温度、目標DO、上のPH限界、および攪拌RPMを埋めます。次に、「かき混ぜる」または下の攪拌をクリックします。血管内に接種物を添加するには、細胞プレートを加えて活性化します。プレートの種類、名前、およびメディアを含むプレートの位置を定義します。をクリックして、細胞を容器に追加します。接種の時間と、船舶に追加する媒体の体積を入力します。プレートから容器にセルを転送するために、液体ハンドラによって移動するパスを定義します。次のタブに切り替えるには、「次へ」をクリックします。フィード、グルコース、および消泡の追加を設定するには、フィードプレートをアクティブにし、プレートの種類、名前、および場所を定義します。容器に飼料を追加をクリックし、容器に追加する飼料の量を入力します。栽培に応じて、飼料添加数を加えます。この栽培のために、反応器は24時間ごとに72時間後に供給される。追加したセルから遅延データを入力して、給餌の間の時間遅延を手動で追加します。摂食の最初の日は接種の72時間後、次の日は96時間後などです。プレートから容器へのフィードの転送のマッピングを定義します。栽培中にサンプリングを設定するには、サンプルプレートの追加をアクティブにし、プレートの種類、名前、および場所を定義します。「船舶からサンプルを採取」をチェックし、船舶から取り出すサンプルの体積を入力します。培養の過程で体積が10ミリリットル以下にならないようにしてください。栽培中に採取するサンプル数を加えます。供給と同様に、各入力サンプルポイントについて容器から取り出されるサンプルの時間を追加します。プロセスを保存します。これで実行の準備が整いました。最後に、容器からプレートへのサンプルの移動のマッピングを定義します。アンバー15 DOEソフトウェアを開きます。「調査」をクリックして、新しいを選択します。[調査の作成] ダイアログ ボックスに、新しい DOE 調査の名前を入力します。DOE 調査に実験を割り当てるには、作成したレシピを開いて、異なるパラメータを調べます。[参照] をクリックし、それぞれの実験を選択します。容器タグは、すでに列に入っています。目的の DOE 係数を定義するには、パラメータを選択し、DOE 係数というラベルの付いた列をクリックします。「新しい」を選択し、単位、略語、および因子の下限と上限を追加します。[応答] タブで、データの分析に考慮する値を定義します。DOE 応答の編集をクリックし、応答の名前、省略形、単位、および最小および最大制限を定義します。応答が定義されたら、各応答に対してオレンジ色の変数を選択し、定義します。応答は、微生物バイオリアクター変数に自動的に関連付けることができます。ドロップダウンリストから必要な変数を選択します。要件に応じて、各応答の式を変更します。最小、最大、最初、最後、平均のデータの間の選択。設計を作成するには、デザインウィザードを使用して実験計画のタイプを選択し、反復数と中心点を追加または削除します。目的を選択して、設計とモデルの選択を決定します。テキスト プロトコルで説明されているように、アンバー自己培養ソフトウェアにインポートできる作業パケットを完了して作成します。実験タブで、DOE実験の作成をクリックし、DOEソフトウェアを使用して作成された作業パケットを参照します。[開始] をクリックしてプロセスを初期化します。実験を実行したら、エクスポート DOE 結果を使用してデータをエクスポートします。エクスポート DOE 結果」ウィンドウが開き、培養容器とステーションを示す行が表にリストされます。目的の行を選択し、選択した行をエクスポートするをクリックするか、実験データをエクスポート"すべての結果を保存し、さらなる分析のためにファイルを保存します。結果タブに切り替えてインポート結果を選択することにより、データをアンバーDOEモジュールにインポートします。目的のデータ ファイルを参照し、[結果の分析] をクリックします。自動化された微生物バイオリアクターの細胞増殖は、多用途バイオリアクターと同等である。3つの異なるスケールからの細胞濃度を比較するに当たって、15ミリリットルの自動化された微生物バイオリアクターが2リットルガラスバイオリアクターを模倣することが観察される。シェイクフラスコの結果もアンバーの利点を示すために比較されます。異なる攪拌速度とPHの影響は、自動化された微生物バイオリアクターで研究されています。ここに示されているのは、生存細胞濃度、またはVCC、および異なる微生物バイオリアクターにおけるモノクローナル抗体濃度の比較である。VCCに対するPH 6.9の負の影響は観察できる。さらに、PH 7.3の培養下での細胞の増殖はPH 7.1と比較して有意に改善した。ここに示されているのが、VCCおよびモノクローナル抗体濃度の応答輪郭プロットである。この値は、同じPHと異なる攪拌速度を有する容器内で比較可能であり、このプロセスのために収集された攪拌機の速度がプロセス出力に大きな影響を与えがないことを示す。実験の実行中にエラーを避けるために、マシンに与えられたすべての命令は慎重に書かれなければならない。ソフトウェアは柔軟性があり、一度に多くの実験を実行できるため、プロセスの最適化にかかる時間を短縮できます。実験の設計は、ある程度他の生物に拡張することができる知識ベースのプロセス理解を与える結果として、バイオプロセスの分野で有用である。

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Bioengineering

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出典:ヘメリッヒ、J.ら。自動マイクロバイオリアクター技術を用いた異質タンパク質生産の最適化プロトコル。J. Vis.

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