Name: 慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: 学ぶ慢性緑膿菌創傷感染モデル。免疫正常マウスで異物埋め込みや免疫抑制なしに、24時間遅延接種で7〜10日間持続する感染を確立する方法です。細菌病原性と宿主病原体相互作用の研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

pUT-Tn5-EM7-lux-Km1発光構築ベクトルは、J.ハーディからの優雅な贈り物でした。回路図はBioRender.comで作成されました。私たちは、創傷感染モデルに関する彼らのアドバイスのためにG.ガートナーの研究室に感謝します。また、スタンフォード・イン・ビボ・イメージングイノベーションセンターのT・ドイルの技術的専門知識に感謝します。この作品は、R21AI133370、R21AI133240、R01AI12492093の助成金によってサポートされ、スタンフォードSPARK、フォーク医学研究信託、嚢胞性線維症財団(CFF)からP.L.B.C.R.Dへの助成金はT32AI007520によってサポートされました。ガビラン・スタンフォード大学大学院理工学研究科とルベール・ストリアー・バイオ-Xスタンフォード学際大学院フェローシップがJ.M.S.を支援しました。

ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 細菌の作製と増殖
<ol><li>研究者の機関的なバイオセーフティ委員会および動物使用委員会のガイドラインに従って、BSL-2の予防措置を講じ、P.エルギノーサおよび動物とすべての作業を行う。P. eeruginosa(マウス接種を含む) に関するすべての手順をバイオセーフティキャビネットで行います。</li>
	<li>P. アルギノーザの発光PAO1:lux株は、要求によって私たちの研究室から入手可能です。ストリークPAO1は、凍結グリセロールストックとして保存され、リソゲニーブロス(LB)寒天上に。発光性PAO1:lux株の場合、LB寒天には選択的抗生物質(100 μg/mLカルベニシリンおよび12.5 μg/mLカナマイシン)が含まれている必要があります。細菌インキュベーターで一晩37°Cで成長する。</li>
	<li>単離されたコロニーを選び、3ml LB培地、pH 7.4で37°Cで一晩成長する。発光株の場合、ブロスには100 μg/mLカルベニシリンが含まれている必要があります。揺れ、有酸素条件下で成長します。</li>
</ol>2. 手順準備
<ol><li>手術を行うすべての人員に、清潔なガウン/ラボコート、フェイスマスク、ヘアネット、手袋を着用してもらいます。</li>
	<li>はさみや鉗子を含むすべての外科用具をオートクレーブ。無菌技術を使用して、動物間のツールを殺菌します。</li>
	<li>エタノールで外科テーブルをきれいにし、きれいな外科分野を準備しなさい。</li>
</ol>3.脱毛
<ol><li>1%~3%のイゾフルランを用いて8~12週齢のC57BL/6Jマウスを麻酔する。調査官は、イソフルランを使用する場合、麻酔のための彼らの機関の獣医スタッフのガイドラインに従う必要があります。<ol>
<li>麻酔を開始するには、1%~3%のイソファフルランを送り、酸素の流量を1.5L/分に調整します。</li>
		<li>マウスのつま先をつまんで麻酔の深さを評価します。マウスが刺激に反応しなくなったら、誘導室から取り出し、鼻をイソファフルランのノーズコーンに入れた状態で外科用ベンチに置きます。</li>
		<li>両眼に眼潤滑剤を塗布します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウスを秤量して、ベースラインプリプロシージャ重量を得る。</li>
	<li>マウスを起こりやすい位置に置きます。あらかじめ温めた無菌の0.9%の塩化ナトリウム、各脇腹に250μL、合計500μLのマウスを皮下に注入します。</li>
	<li>電動の剃り子を使ってマウスの後ろを剃ります。傷の毛髪汚染を防ぐために、シェービングは外科の場所とは異なる場所で起こるべきである。</li>
	<li>脱毛ローションの薄い層を適用します。ローションを20~60sに座らせ、ガーゼをぬるま湯で髪と余分なローションを取り除きます。脱毛後、切除創術に進む。</li>
</ol>4. 完全な厚さ切除傷手術
<ol><li>マウスの中間の部分に25G針を使用して、皮下0.6~1mg/kgの徐放性ブプレノルフィンを注射します。遅い放出ブプレノルフィンは48-72時間の上に痛みの軽減を提供する。</li>
	<li>手術部位を消毒する。滅菌ベタジン綿棒で後面を拭きます。余分なベタジンを滅菌アルコール綿棒で拭きます。これは、3回(ベタジンとアルコールの間で交互に)、円形の方法で中心から端に移動することによってスワッピングを行う必要があります。その地域を空気乾燥させます。</li>
	<li>滅菌ガーゼまたはプラスチッククリングラップを使用して、外科現場を囲むドレープを作成します。</li>
	<li>肌を大きく伸ばします。滅菌6mmの直径の皮膚生検パンチを使用して、左下表皮を通して初期切開を行います。右の後表皮を繰り返します。</li>
	<li>鉗子を使用して、左輪郭の巻き傷口の中心から皮膚をテントに入れます。はさみを使用して表皮層と真皮層を切除する。左右に輪郭を描いた創傷領域を繰り返して、対称的な切除傷を作り出す。</li>
	<li>創傷を50μLの滅菌生理液で洗浄します。手術部位と周囲の皮膚を空気乾燥させます。次に、傷とドーサムを透明フィルムドレッシングで覆う。</li>
	<li>マウスを清潔なケージに戻します。ケージあたり1匹の動物を収容します。</li>
	<li>ケージをヒーティングパッドに置き、マウスが目を覚ますまで監視します。</li>
	<li>複数の動物に対して上記の手術を行う場合は、ホットビーズ滅菌装置を使用して、動物間のすべての外科器具を清掃する。</li>
	<li>マウスが外科的処置から回復し、細菌の接種に進む前に創傷に対する暫定的な創傷マトリックスの形成のために24時間を許可する。</li>
</ol>5. P. アルギノーザとの接種
<ol><li>PAO1:lux培養を100 μg/mLカルベニシリンを含むLB培地の75 mLでOD 600 = 0.05に希釈し、培養が初期指数相(OD600≈ 0.3)になるまで細菌を増殖させます。この時間は約 2 ~ 3 時間かかります。</li>
	<li>希釈 PAO1:ルクスの濃度 (7.5 ± 2.5) x 102 CFU/mL.実験後に十分な容積を確保し、めっきを可能にするために、過剰な接種を準備してください。施設間の輸送(すなわち、ラボからビバリウムへ)を輸送する場合は、明確にバイオハザードと記された漏れ防止ボックスに二重封じ込めを使用してください。</li>
	<li>動物バイオセーフティレベル2(ABSL-2)承認された生物学的安全キャビネット(BSC)で承認された個人保護具を使用してP.エルギノーサとマウスとすべての作業を行います。計量スケールなどの再利用可能な機器は、汚染を防ぐためにしがみつくラップで覆われるべきです。</li>
	<li>上記のように3%のイソファフルランを用いた麻酔。マウスの重量を量り、重量を記録します。あらかじめ温めた無菌の0.9%の塩化ナトリウム、各脇腹に250μL、合計500μLのマウスを皮下に注入します。</li>
	<li>マウスの透明フィルムドレッシングが一晩外れた場合は、結果のかさぶたを慎重に取り除き、新しいドレッシングを着てください。</li>
	<li>500 μLのツベルキュリン27G安全キャップシリンジを使用して、各創傷に透明フィルムドレッシングを通してPAO1:lux懸濁液40μLを注入します。異なるマウスは、非接種/PBS創傷コントロールに対して、反対側からの交差汚染を防ぐために使用されるべきである。</li>
	<li>マウスをヒーターパッドのケージに戻し、目が覚めるまで監視します。すべてのマウスは、クロスコンタミネーションを防ぐために、別々のケージに個別に収容する必要があります。</li>
	<li>ケージの床に食品ペレットの間に挟まれた高カロリーの栄養補助食品ペーストを提供します。</li>
	<li>残りの接種を使用してLB寒天プレートをストリークします。コロニーを数え、投与する菌の数を確認する。</li>
</ol>6. 感染した創傷の生体内イメージング
<ol><li>二次容器の使用を含め、イメージング機器との間でマウスを輸送するためのBSL-2封じ込めプロトコルに従ってください。マウスを誘導室や画像器具に移す際に、動物の寝具を転写したり、落下したりしないように注意してください。</li>
	<li>ステップ 3.1 で説明したように、吸入 1% – 3% イソファフルランを誘導チャンバに吸入してマウスの麻酔を誘導します。</li>
	<li>マウスが麻酔されたら、イソファランノーズコーンに鼻を持つ光学イメージングシステムのイメージングチャンバー内の起こりやすい位置に置きます。</li>
	<li>ソフトウェアプログラムを開きます。</li>
	<li>この取得パラメータは、同時に画像化された動物の数と生物発光の強度に基づいて変化する。設定する基本パラメータには、露出時間、ビン分割、f/ストップ、視野(FOV)などがあります。デフォルトの開始設定は、露出時間 30 秒、ビニングロー (2)、f/stop 1.2、および FOV 25 です。研究者のニーズに応じて、必要に応じてこれらの設定を調整します。</li>
	<li>イメージングプログラムを使用して発光データを解析します(材料の表を参照)。発光は、マウスのカラー写真に重ね合った疑似色画像として表される。<ol>
<li>創傷部位に関心領域(ROI)を作成し、検出された平均フラックス(フォトン/秒)を測定します。データは放射輝度(フォトン/秒/cm²/steradian)として報告することもできますが、カメラからのイメージングプラットフォームの距離がイメージング間で一定である限り、フラックスで十分です。</li>
		<li>画像処理プラットフォーム上のランダムな領域で ROI を作成して、背景を測定します。フォトン/秒の背景番号を減算します。</li>
		<li>データをスプレッドシートにエクスポートして、さらに詳しく分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>感染進行を追跡するために、上記のようにイメージングを毎日行う。</li>
</ol>7. 術後管理
<ol><li>研究者のIACUCプロトコルによって設定されたガイドラインに従ってマウスを監視する。最初の4日間、実験終了まで1日おきにすべてのマウスを毎日監視します。BSCでの最初の4日間の手術後のマウスを1日1回計量する。感染後1日と2日目に皮下0.9%の塩化ナトリウムを250μL注入する。</li>
	<li>腰痛の姿勢、不器用なコート、無気力、呼吸困難、顔面の悲しみ、体重減少など、マウスの痛み/苦痛の兆候を確認してください。</li>
	<li>動物が健康状態を悪化させる兆候を示す場合は、獣医師に相談してください。痛み/苦痛の悪化の兆候と20%以上の減量を示すように見えるマウスは安楽死させるべきです。</li>
</ol>8. 創傷切除
<ol><li>実験終了時に、CO2吸入を用いてマウスを屠殺し、続いて頸部脱臼を行った。施設のABSL-2プロトコルに従って動物の死体を処分してください。</li>
	<li>BSCで滅菌はさみと鉗子を使用して傷ついたベッドを物品化する。1.5 mLポリプロピレンチューブに1mL滅菌PBSに各創傷床を入れる。傷口組織をはさみでミンチします。すべての創傷は、感染していると見なされない場合でも、ASBL-2として扱われるべきである。</li>
	<li>4°Cで2時間300rpmでシェーカーをインキュベートする。10sの各チューブをボルテックスし、PBS中の細菌廃液を連続的に希釈する。希釈した細菌排水をLB寒天にプレートして、細菌の負担を列挙します。</li>
	<li>創傷内の発光シグナルがバックグラウンド発光を上回り、創傷流出液で、PBSを制御する創傷よりも多くの細菌が検出された場合に感染した創傷を考慮する。</li>
</ol>

<ol><li>Sen, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+wounds%3A+a+major+and+snowballing+threat+to+public+health+and+the+economy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Human skin wounds: a major and snowballing threat to public health and the economy.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).</li>
<li>Serra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+wound+infections%3A+the+role+of+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Anti-infective+Therapy%22%5BJournal%5D)">Chronic wound infections: the role of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus.</a> Expert Review of Anti-infective Therapy. 13 (5), 605-613 (2015).</li>
<li>Obritsch, M. D., Fish, D. N., MacLaren, R., Jung, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nosocomial+infections+due+to+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa%3A+epidemiology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Nosocomial infections due to multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa: epidemiology and treatment options.</a> Pharmacotherapy. 25 (10), 1353-1364 (2005).</li>
<li>Secor, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+Bacteriophage+Produced+by+Pseudomonas+aeruginosa+Alters+the+Inflammatory+Response+and+Promotes+Noninvasive+Infection+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Filamentous Bacteriophage Produced by Pseudomonas aeruginosa Alters the Inflammatory Response and Promotes Noninvasive Infection In Vivo.</a> Infection and Immunity. 85 (1), (2017).</li>
<li>Rice, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+life+cycle+and+virulence+of+Pseudomonas+aeruginosa+are+dependent+on+a+filamentous+prophage%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The biofilm life cycle and virulence of Pseudomonas aeruginosa are dependent on a filamentous prophage.</a> The ISME Journal. 3 (3), 271-282 (2009).</li>
<li>Bayes, H. K., Ritchie, N., Irvine, S., Evans, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+early+Pseudomonas+aeruginosa+lung+disease+with+transition+to+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A murine model of early Pseudomonas aeruginosa lung disease with transition to chronic infection.</a> Scientific Reports. 6, 35838(2016).</li>
<li>van Gennip, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+polymorphonuclear+leukocytes+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+on+silicone+implants+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between polymorphonuclear leukocytes and Pseudomonas aeruginosa biofilms on silicone implants in vivo.</a> Infection and Immunity. 80 (8), 2601-2607 (2012).</li>
<li>Trøstrup, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+aggravates+skin+inflammatory+response+in+BALB%2Fc+mice+in+a+novel+chronic+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm aggravates skin inflammatory response in BALB/c mice in a novel chronic wound model.</a> Wound Repair and Regeneration. 21 (2), 292-299 (2013).</li>
<li>Zhao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+course+study+of+delayed+wound+healing+in+a+biofilm-challenged+diabetic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Time course study of delayed wound healing in a biofilm-challenged diabetic mouse model.</a> Wound Repair and Regeneration. 20 (3), 342-352 (2012).</li>
<li>Brubaker, A. L., Rendon, J. L., Ramirez, L., Choudhry, M. A., Kovacs, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+neutrophil+chemotaxis+and+infiltration+contributes+to+delayed+resolution+of+cutaneous+wound+infection+with+advanced+age%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Reduced neutrophil chemotaxis and infiltration contributes to delayed resolution of cutaneous wound infection with advanced age.</a> Journal of Immunolology. 190 (4), 1746-1757 (2013).</li>
<li>Watters, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+perturb+wound+resolution+and+antibiotic+tolerance+in+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms perturb wound resolution and antibiotic tolerance in diabetic mice.</a> Medical Microbiology and Immunology. 202 (2), 131-141 (2013).</li>
<li>Lee, C., Kerrigan, C. L., Picard-Ami, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide-induced+neutropenia%3A+effect+on+postischemic+skin-flap+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide-induced neutropenia: effect on postischemic skin-flap survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 89 (6), 1092-1097 (1992).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+to+Chronic+Pseudomonas+aeruginosa+wound+infection+in+immunocompetent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">The immune response to Chronic Pseudomonas aeruginosa wound infection in immunocompetent mice.</a> Advances in Wound Care. , (2019).</li>
<li>Sweere, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteriophage+trigger+antiviral+immunity+and+prevent+clearance+of+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection.</a> Science. 363 (6434), (2019).</li>
</ol>

著者らは、開示する競合する財政的利益を持っていません。

我々は、新しい遅延接種P.アルギノーザ創傷感染モデルを開発した。切除傷後24時間まで細菌による接種を遅らせるという戦略は、1週間の時間枠にわたって創傷感染の評価を可能にする。P. eeruginosaの発光株を用いることによって、感染経過過程を通して感染進行を追跡することが可能である。他のP.緑口症感染モデルと比較して感染の長いコースは、宿主と病原体の相互作用とP.緑口創傷感染症を標的とする新しい治療法を研究するための新しい機会を可能にする。例えば、我々はすでにこのモデルを使用して、P.アルギノーサが宿主免疫系を回避することを可能にする抗ウイルス免疫応答を刺激する際のPfバクテリオファージの役割を実証した14。
切除創手術と細菌接種の間に24時間の回復時間を含めることは、この創傷感染モデルにおいて重要なステップである。これは、動物が感染する前に創傷手術から回復することを可能にし、少なくとも7日間生き残る能力に役割を果たす可能性が高い。さらに、接種...

緑膿菌(P.エルギノーサ)は、ヒトの健康と病気との関連性が高まるグラム陰性の棒状の細菌である。これは、特に免疫不全患者1、2における創傷感染を伴う、無ソコミアル設定における広範な罹患率および死亡率を担う。この病原体の多剤耐性株の出現は、P.アルギノーサ病原性、P.アルギノーサ系抗生物質耐性のメカニズム、およびこの致命的な感染症の予防と治療のための新しい方法に寄与する要因の調査のためのさらなる刺激を提供している3。したがって、これらの研究問題を調査するためのツールとしての慢性創傷感染の動物モデルの必要性はかつてないほど高まっています。
残念なことに、P. エルギノーザ感染の多くの動物モデルは、敗血症による感染症の急速な分解能または急速な減少をシミュレートする傾向があります4,5,これは、これらの感染症のしばしば慢性的な性質を適切にシミュレートしません。この欠点に対処するために、一部のモデルは、寒天ビーズ、シリコーンインプラント、またはアルギン酸ゲル6、7、8などの異物の移植を利用する。他のモデルは、高度な年齢、肥満、または糖尿病のために免疫不全であるマウスを使用し、またはシクロホスファミド誘発性好中球減少症9、10、11、12などの薬理学的手段を介して使用する。しかし、異物や免疫が損なわれた宿主の使用は、局所的な炎症過程を変化させる可能性が高く、それ以外の場合は正常な免疫系を有する宿主における慢性創傷感染に関与する病態生理学の理解を得ることは困難である。
切除後の細菌による接種の遅延を伴うマウスにおけるP.アルギノーザ創傷感染の慢性モデルを開発した。接種の遅れにより、細菌の負担を少なくとも7日間まで評価する実験が可能になります。このモデルは、P.緑菌慢性感染症の病因と新しい治療法の両方を調査するための新しい機会を開きます。

<table><tbody><tr><td>0.9%塩化ナトリウム注射</td><td>ホスピーラ</td><td>2484457</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 滅菌針</td><td>BD</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>25 G x 1 1/5 滅菌針</td><td>BD</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>アルコール スワブ</td><td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>オーラ イメージング ソフトウェア</td><td>スペクトル機器 イメージング</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン</td><td>パデュー フレデリック カンパニー</td><td>19-065534</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR LAB</td><td>Zoopharm</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 雄マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>使い捨て生検パンチ、6mm</td><td>Integra</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>細かいはさみ - 炭化</td>タングステン <td>ファイン サイエンス ツール</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>ガラス ビーズ乾燥滅菌器</td><td>ハーバード デバイス</td><td>61-0183</td><td></td></tr><tr><td>粒状寒天</td>フィ<td>ッシャーバイオ試薬</td><td>BP9744</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッド</td><td>ミリヤード</td><td>804879481218</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器 28 G ニードル付き</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Lago X イメージングシステム</td><td>スペクトル機器 イメージング</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Leur-Lok 1 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>ミニ アルコ アニマル トリマー</td><td>ウォール プロフェッショナル</td><td>919152</td><td></td></tr><tr><td>ネア ヘア リムーバル ローション ベビー オイル</td><td>教会とドワイト</td><td>n/a</td><td>どの薬局でも入手可能</td></tr><tr><td>八角形 鉗子</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>11041-08</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>ファルコン</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1x</td><td>コーニング</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>プレス&シールラップ</td>ラップう<td>れしい</td><td>n / aSafetyGlide</td><td></td></tr><tr><td>インスリンシリンジ、30G針付き</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>Safetyglideインスリンシリンジ、1/2 mL、30 G x 5/16 TW</td><td>BD</td><td>305934</td><td></td></tr><tr><td>スケール</td><td>オーハウススカウトプロ</td><td>SP202</td><td></td></tr>サプリメント栄養<tr><td>補助食品</td><td>ヘンリーシャインアニマルヘルス</td><td>29908</td><td></td></tr>テ<tr><td>ガダーム、6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td></td></tr></tbody></table>

慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection

緑膿菌(P.エルギノーサ)は、特に糖尿病患者および入院患者における慢性創傷感染の設定において、ヒトの健康および疾患に対する関連性を高める主要な院内感染体である。創傷病因の調査とこの病原体に対する新しい治療法の開発を支援するために、慢性感染モデルが緊急に必要とされている。ここでは、完全厚切除傷の24時間後に遅延接種を使用するプロトコルについて説明する。この時点で存在する暫定的な創傷マトリックスの感染は、迅速なクリアランスまたは感染の普及のいずれか、代わりに異物の移植や免疫抑制を必要とせずに7-10日間持続する慢性感染症を確立します。このプロトコルは、ヒトにおける術後感染の典型的な一時的な経過を模倣する。発光P.アルギノーサ株(PAO1:lux)の使用は、P.アルギノーザ創傷感染に対する細菌負担の定量的な毎日の評価を可能にする。この新しいモデルは、細菌病原体の調査および慢性P.緑菌創傷感染に対する新しい治療法の開発に有用なツールである可能性がある。

luxABCDEレポーターシステム(PAO1:lux)をコードするプラスミドを有するPAO1の発光株を用いて、マウスに切除創を行い、これらの創傷をプランクトンP.エルギノーサ24時間経過後に接種し、経時の細菌負担を測定した(図1および図2)。撮像光学系を用いて得られた代表的な画像は、このモデルが検出可能な発光をもたらすことを示している(図3A)。感染は接種後3日目にピークを迎え、生物発光とコロニー数の両方に基づいて接種後7日間持続した(図3B-C)。このモデルを使用して、我々は確実に細菌の株とマウスの背景に応じて7-10 ays持続する創傷を生成することができます。創傷から分離された細菌の培養は、検出された発光と相関するCFU/創傷を定量することを示し...

我々は、免疫担当マウスにおける慢性創傷感染を発生させる遅延接種プロトコルを記述する。

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) is a major nosocomial pathogen of increasing relevance to human health and disease, particularly in the setting of ...

このプロトコルは、異物移植や免疫抑制を必要とせずに慢性の緑膿菌創傷感染のモデルを記述しているため、重要である。完全な厚さの切除創傷の24時間後に緑膿菌による遅れた接種は、細菌の急速なクリアランスと普及を引き起こし、7〜10日間続く感染症を確立する。このユニークなモデルは、細菌病因の調査、宿主病原体相互作用、および慢性シュードモナス緑膿症創傷感染症のための新しい治療法の開発のための有用なツールとなるでしょう。手順のデモンストレーションで私を支援することは、ダン・リュウ、ボリキー研究所の医学生になります。処置を開始する前に、麻酔を受けた8〜12週齢のマウスの重量を量ってベースラインの重さを得て、マウスを起こしやすい位置に置きます。ペダル反射への応答の欠如を確認した後、皮下に各側面に250マイクロリットルの事前温めた無菌0.9%塩化ナトリウムをマウスに注入する。電気剃毛を使用して、マウスの後ろ面から毛髪を取り除き、露出した皮膚に脱毛クリームの薄い層を塗布します。20~60秒後、ガーゼをぬるま湯で湿らせた髪と余分なローションを取り除きます。完全な厚さの切除傷の外科のために、最初に25ゲージの針を使用して、マウスの中部の下方領域で1キログラムあたり0.6〜1ミリグラムの持続放出ブプレノルフィンを注入し、3つの代替無菌ベタジンとアルコール綿棒で円形に外科部位を拭く。外科部位の上にプラスチック製のクリングラップドレープを置き、皮膚のトートを大胆に伸ばします。皮膚が乾燥したら、直径6ミリの無菌皮膚生検パンチを使用して、左後ろ座表皮を通して最初の切開を行い、続いて右下振れ表皮に2回目の切開を行う。鉗子を使用して、左の輪郭を描いた傷領域の中央から皮膚をテントにし、はさみを使用して表皮および真皮層を切除します。右側の輪郭を描いた傷領域の切開を繰り返して対称的な切除傷を作成した後、両方の創傷を50マイクロリットルの無菌生理食塩水で洗浄する。手術部位および周囲の皮膚が乾燥したら、透明なフィルムドレッシングで傷口とドーサムを覆い、完全な再発まで監視する加熱パッドのきれいなケージにマウスを置きます。手術の24時間後、再麻酔マウスを再び計量し、両方の側面に250マイクロリットルの事前温めた無菌0.9%塩化ナトリウムを皮下注射する。次に、27ゲージ針を備えた500マイクロリットルの結核安全キャップシリンジに100マイクロリットルの発光P.aeruginosaひずみ懸濁液を負荷し、各創傷に透明なフィルムドレッシングを通して40マイクロリットルの細菌懸濁液を注入する。細菌懸濁液が十分に混合され、透明なドレッシングがそのままであることを確認します。針ベゼル側を上にして透明なドレッシングを1回だけ穿刺してください。その後、監視と加熱ページ上のケージにマウスを返し、ケージの床に食品ペレットの間に挟まれた高カロリー栄養サプリメントペーストを提供します。LB寒天プレートに残りの接種をプレートし、投与された細菌の数を確認するためにコロニーを数えます。感染した創傷のインビボイメージングの場合、マウスとイメージング機器との間でのマウスの輸送のための生体安全レベル2封じ込めプロトコルに従い、麻酔付きマウスをイメージングチャンバー内の起こりやすい位置に置きます。イメージングソフトウェアでは、実験に適した露出時間、ビニング、fストップ、視野を設定します。次に、創傷部位に関心領域を作成し、1秒間に検出された光子の平均検出されたフラックスを測定する。背景を測定するには、イメージングプラットフォーム上のランダム領域上に対象領域を作成し、1 秒あたりのフォトンの背景数を減算します。実験の最後に、バイオセーフティキャビネットで、滅菌はさみと鉗子を使用して創傷床を切除し、各ベッドを1.5ミリリットルのポリプロピレンチューブに1ミリリットルの無菌PBSに入れる。創傷組織をハサミでミンチし、シェーカーの組織片を毎分300回転で2時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに、各チューブを10秒間渦液してからPBSで細菌廃液を連続的に希釈し、LB寒天で希釈した細菌廃液をめっきして細菌の負担を定量化する。この代表的な画像は、撮像光学系を用いて得られた、このモデルが検出可能な発光を生じることを示す。この実験では、感染は3日目の接種後にピークに達し、生物発光とコロニー数の両方に基づいて接種後7日間持続した。創傷から分離された細菌の培養は、創傷当たりの定量コロニー形成ユニットが検出された発光と相関することをさらに示す。注射直後に最初の急速な体重減少がありますが、生理学注射と補足栄養はマウスを最初の体重に戻すことができます。創傷の50%が実質的に感染する量の算出された接種量は、ミリリットル当たり第2コロニー形成単位に約7.7倍の10倍であると判断した。ミリリットル当たりの第4コロニー形成単位に10倍より高い用量は、100%の感染率をもたらす。様々な局所および全身治療は、シュードモナス緑膿症の新しい潜在的な治療法を調査するために、創傷および接種手順の後に適用することができる。シュードモナス・エルギノーサと感染したマウスとのすべての作業は、研究者の制度的なバイオ安全および動物使用委員会のガイドラインに従ってBSL-2安全対策を講じるべきである。

a-delayed-inoculation-model-chronic-pseudomonas-aeruginosa-wound

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: デ・フリース、C. R.、 et.al。慢性 緑膿菌 創傷感染の遅延接種モデル。 J. Vis. Exp. (2020年)この動画は、透明なフィルムドレッシングで覆われた全層の背側皮膚創を持つマウスに発光性プ セウドモナス・エルギノーサ...

慢性緑膿菌皮膚創傷感染のマウスモデル開発 

我々は、マウスモデルにおいて、長期持続性の慢性緑膿菌気道感染を確立する寒天ビーズ法を記載している。...

長期的な慢性<em&gt;緑膿菌</emマウスにおける&gt;気道感染

私たちは、緑膿菌の気管内注射によるマウス肺損傷モデルを開発しました。このモデルは、肺炎時の肺損傷を模倣しており、臨床的に関連しています。...

緑膿菌誘発肺傷害モデル

宿主と病原体の相互作用に関するin vitro研究は特定の免疫応答の特性評価を可能にしますが、複雑な反応の影響を観察するにはin...

微生物群集を学びます<em&gt;インビボ</em&gt;：ホスト間の媒介の相互作用のモデル<em&gt;カンジダ</em&gt;と<em&gt;緑膿菌</em&gt;航空で

ここで我々 はリアルタイム、非侵襲的発光緑膿菌のバイオ フィルム創傷感染の監視のヘアレス マウスを用いた新規糖尿病マウスモデルをについて説明します。このメソッドは、他の菌種と複数種バイオ フィルムを含む、遺伝子組換え微生物の感染症を評価および antibiofilm...

光側に来る: In Vivo糖尿病ヘアレス マウス モデルにおける慢性創傷における緑膿菌バイオ フィルム感染症の監視

ここでカンジダ皮内注射後皮膚サンプルの組織学的および分子の解析を可能にするプロトコルについて述べる。このプロトコルは、皮膚の構造的な整合性を維持でき、病原体の分布と同様、組織居住者や新人の免疫細胞の局在化のため。...

深い皮膚注入として、モデルカンジダ皮膚感染症病理組織学的解析のための

慢性創傷は、全厚の皮下創傷の後に高レベルの酸化ストレスを誘発することによって、糖尿病マウスモデルの急性創傷から発症する。創傷は、カタラゼおよびグルタチオンペルオキシダーゼの阻害剤で治療され、皮膚微生物叢に存在する細菌による治癒およびバイオフィルムの発達を損なう結果生じる。...

糖尿病マウスの慢性創傷を作成するためのプロトコル

危険な病原体によって引き起こされる人工関節周囲感染症(PJI)は、臨床整形外科で一般的です。既存の動物モデルでは、PJIの実態を正確に再現することはできません。本研究では、 カンジダ・アルビカンス...

マウスにおける人工関節周囲カン ジダ・アルビカンス 感染モデル

抗生物質に耐性のある慢性創傷は、医療システムにとって大きな脅威です。バイオフィルム感染症は頑固で敵対的であり、機能不全の創傷閉鎖を引き起こす可能性があります。我々は、バイオフィルムに感染した全層慢性創傷の臨床的に関連する豚モデルを報告する。このモデルは、メカニズム研究だけでなく、介入のテストにも強力です。...

バイオフィルム感染と不可視創傷のブタモデル

現在、慢性細菌感染症に対する薬物スクリーニングに適した in vivo モデルが不足しています。ここでは、ゼブラフィッシュの幼生に持続的な感染を引き起こす ための緑膿菌...

負傷したゼブラフィッシュ幼生における持続性 緑膿菌 感染のモデル化

学ぶ慢性緑膿菌創傷感染モデル。免疫正常マウスで異物埋め込みや免疫抑制なしに、24時間遅延接種で7〜10日間持続する感染を確立する方法です。細菌病原性と宿主病原体相互作用の研究に有用です。

慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

さらに動画を探す