Name: 末梢血の低下に由来するT細胞に結合したPD-1遮断抗体のモニタリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 学ぼう、末梢血を用いてPD-1遮断抗体とT細胞の結合をフローサイトメトリーで評価する方法。少量の血液で抗腫瘍効果や免疫関連有害事象に関与する細胞サブセットを同定でき、がん免疫療法のモニタリングに応用可能です。

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日本学術振興会(日本医学会KAKENHI)、日本医療研究開発機構(JP18cm0106335、19cm0106310)のS.K.への助成金による支援を行いました。

サンプリングは、ルーチン臨床処置中に行った。すべてのヒトサンプルは、ヘルシンキ宣言に従い、また、大阪大学医学部の倫理審査委員会(15383、752)の承認を得て、被験者の同意を得た後に得られた。
1. 全血サンプルの準備と染色
<ol><li>エチレン・ジアミンテトラ酢酸(EDTA)を含む血液採取管に全血試料を採取する。 注:血液採取は、通常の針または血液ランセットのいずれかを使用して行うことができます。</li>
	<li>全血サンプル20μLを5 mL丸底ポリスチレンフローサイトメトリーチューブに移します。 注:細胞のチューブへの非特異的結合を減らすために、リン酸緩衝生理食塩血(PBS)の2%ウシ血清(FBS)の1 mLをチューブに加え、サンプルに適用する前に10分間渦でボルテックスする。</li>
	<li>PBSに2%FBSの20 μLを加えます。</li>
	<li>ヒト特異的FcRブロッキング試薬を10μL添加します。よく混ぜ、室温で15分間インキュベートします。</li>
	<li>500 μLの赤血球リシスバッファーを加えます。よく混ぜ、室温で10分間インキュベートします。</li>
	<li>PBSに2%FBSの4 mLを加え、4°Cで5分間400 x g(1,500 rpm)で細胞をスピンダウンします。吸引によって上清を取り除く。</li>
	<li>ステップ 1.6 で説明した洗浄および吸引プロセスを繰り返します。</li>
	<li>PBSで100 μLの2%FBSで細胞を再懸濁し、それぞれ50μLの2つのチューブに分けます。</li>
	<li>表面マーカー抗体を追加する (表1)。よく混ぜ、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。 注: T 細胞の免疫状態をプロファイリングする場合、マーカーの数はフロー サイトメトリー マシンの品質に基づいて増加できます。</li>
	<li>ステップ 1.6 で説明したサンプル 2x を洗浄します。</li>
	<li>PBSで2%FBSの200 μLの細胞を再懸濁します。</li>
</ol>2. フロー細胞分析
<ol><li>流れサイトメーターにチューブを挿入し、基本的に推奨プロトコル9に従って細胞を取得します。</li>
	<li>10,000 件のイベントをリンパ球ゲートとして記録し (図 1A)、分析用の .fcs ファイルとしてフロー データをエクスポートします。</li>
	<li>分析ソフトウェアでファイルを開きます。前方散乱(FSC)(A)対側散布(SSC)(A)プロットおよびゲートリンパ球上の細胞を可視化する(図1A)。</li>
	<li>FSC (H) vs. FSC (W) と SSC (H) 対 SSC (W) (図 1B) を使用して単一のセルを選択し、それらを CD3 vs. CD8 または CD3 対 CD4 プロットに表示した後、それぞれ CD8 T セルと CD4 T セルをゲートします (図 1C)。</li>
	<li>ゲート付き細胞を選択し、PD-1対ヒトIgG4プロットに表示した後、アイソタイプ制御に基づいてPD-1-ブロッキング抗体結合CD8およびCD4 T細胞を同定します(図1D)。</li>
</ol>

<ol><li>Gong, J., Chehrazi-Raffle, A., Reddi, S., Salgia, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+PD-1+and+PD-L1+inhibitors+as+a+form+of+cancer+immunotherapy%3A+a+comprehensive+review+of+registration+trials+and+future+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Development of PD-1 and PD-L1 inhibitors as a form of cancer immunotherapy: a comprehensive review of registration trials and future considerations.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 6 (1), 8(2018).</li>
<li>Borghaei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Nonsquamous+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Nonsquamous Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (17), 1627-1639 (2015).</li>
<li>Brahmer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nivolumab+versus+Docetaxel+in+Advanced+Squamous-Cell+Non-Small-Cell+Lung+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nivolumab versus Docetaxel in Advanced Squamous-Cell Non-Small-Cell Lung Cancer.</a> The New England Journal of Medicine. 373 (2), 123-135 (2015).</li>
<li>Herbst, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pembrolizumab+versus+docetaxel+for+previously+treated%2C+PD-L1-positive%2C+advanced+non-small-cell+lung+cancer+%28KEYNOTE-010%29%3A+a+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial.</a> The Lancet. 387 (10027), 1540-1550 (2016).</li>
<li>Postow, M. A., Sidlow, R., Hellmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-Related+Adverse+Events+Associated+with+Immune+Checkpoint+Blockade%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immune-Related Adverse Events Associated with Immune Checkpoint Blockade.</a> The New England Journal of Medicine. 378 (2), 158-168 (2018).</li>
<li>Weber, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+Profile+of+Nivolumab+Monotherapy%3A+A+Pooled+Analysis+of+Patients+With+Advanced+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Safety Profile of Nivolumab Monotherapy: A Pooled Analysis of Patients With Advanced Melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 35 (7), 785-792 (2017).</li>
<li>Champiat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+immune+checkpoint+blockade+dysimmune+toxicities%3A+a+collaborative+position+paper%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of immune checkpoint blockade dysimmune toxicities: a collaborative position paper.</a> Annals of Oncology. 27 (4), 559-574 (2016).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+single-agent+anti-programmed+death-1+%28MDX-1106%29+in+refractory+solid+tumors%3A+safety%2C+clinical+activity%2C+pharmacodynamics%2C+and+immunologic+correlates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (19), 3167-3175 (2010).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Lowe, D. B., Kaufman, H. L., Rabkin, S. D., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parametric+flow+cytometry+staining+procedure+for+analyzing+tumor-infiltrating+immune+cells+following+oncolytic+herpes+simplex+virus+immunotherapy+in+intracranial+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-parametric flow cytometry staining procedure for analyzing tumor-infiltrating immune cells following oncolytic herpes simplex virus immunotherapy in intracranial glioblastoma.</a> Journal of Biological Methods. 6 (2), 112(2019).</li>
<li>Osa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implications+of+monitoring+nivolumab+immunokinetics+in+non-small+cell+lung+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Clinical implications of monitoring nivolumab immunokinetics in non-small cell lung cancer patients.</a> JCI Insight. 3 (19), 59125(2018).</li>
<li>Zelba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+quantification+of+T-cells+expressing+PD-1+in+patients+on+anti-PD-1+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Accurate quantification of T-cells expressing PD-1 in patients on anti-PD-1 immunotherapy.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 67 (12), 1845-1851 (2018).</li>
<li>Simoni, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bystander+CD8%28%2B%29+T+cells+are+abundant+and+phenotypically+distinct+in+human+tumour+infiltrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bystander CD8(+) T cells are abundant and phenotypically distinct in human tumour infiltrates.</a> Nature. 557 (7706), 575-579 (2018).</li>
<li>Chiu, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+general+method+for+quantifying+IgG-based+therapeutic+monoclonal+antibodies+in+human+plasma+using+protein+G+purification+coupled+with+a+two+internal+standard+calibration+strategy+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a general method for quantifying IgG-based therapeutic monoclonal antibodies in human plasma using protein G purification coupled with a two internal standard calibration strategy using LC-MS/MS.</a> Analytica Chimica Acta. 1019, 93-102 (2018).</li>
</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

本稿では、フローサイトメーターを用いて、ニボルマブ検出10用に開発した末梢血の滴下に由来するT細胞に結合したPD-1遮断抗体を検出する方法を報告する。この手法は非常に簡単で実行しやすいが、正確な結果を得るためには、2つの重要な点に留意すべきである。一つは、PD-1分子を検出するために、ニボルマブおよびペンブロリズマブと競合する適切な抗体を使用すべきである。この問題は、以前の研究11で評価されました。もう一つは、RBCのリシスは、表面染色前に十分に行われるべきである。IgG4陽性クラスターのゲートを決定するために各アッセイにアイソタイプ制御が確立されている限り、周波数は影響を受けません。しかし、このプロトコルでは、RBCリシスが不十分な場合には、リンパ球門におけるT細胞数と各表面マーカーの強度の両方の減少が生じる可能性がある。また、RBCのライシス工程は表面染色前に行わなければならず、それ以外の場合は抗IgG4抗体(HP6025)が正常に機能しない。
この方法の制限は、PD-1-ブロッキン...

PD-1-ブロッキング抗体は、非小細胞肺癌(NSCLC)1、2、3、4を含む様々なタイプの癌の治療のための標準的な選択肢となっている。それらは、従来の細胞傷害性化学療法に反応していない癌患者のサブセットにおいて顕著な治療効果を示す。しかし、PD-1遮断抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤(ICI)は、免疫関連有害事象(irAE)5と呼ぶ有害事象のユニークで明確なスペクトルを引き起こす可能性がある。irAEは、ほとんどすべての組織に影響を与えることができますが、それらは、消化管、内分泌腺、皮膚、肝臓で最も一般的に観察され、それらは、掻痒、発疹、吐き気、下痢、甲状腺疾患6、7を引き起こす可能性があります。一般に、ほとんどのirAEは、ICIの開始後1〜2ヶ月以内に現れます。しかし、場合によっては、治療開始後1年より遅く、あるいは治療停止後6、7の後に発生する可能性がある。彼らはまた、他の病理から区別することが困難である可能性があり、様々な症状を引き起こします.したがって、irAEを迅速に診断し、適切に治療することは困難です。irAEはすべての組織に影響を及ぼし、その発症は循環免疫細胞、特にPD-1遮断抗体に結合したT細胞によって強く影響されます。したがって、抗体標的T細胞を監視する簡単で低侵襲的な方法は、臨床現場で重要です。
ここでは、ニボルマブやペンブロリズマブを受けたがん患者の末梢全血を一滴用にT細胞に対するPD-1遮断抗体の結合を評価する簡単な方法を開発しました。この手法を用いて、以下の各々をモニターすることができた:1)T細胞に対する抗体結合の持続時間、2)治療用抗体によるT細胞PD-1分子の占有率、および3)T細胞の活性化状態および免疫学的特徴。このメソッドは、以前に報告されたテクニック8の変更です。必要な血液量は、グルコース検査に必要な量とほぼ同じであり、このアプローチは、単核細胞の濃縮やPD-1遮断抗体との共培養を必要としません。我々は、この方法が、末梢血単核細胞(PBMCs)および胸水、心膜滲出液、気管支肺胞洗浄液、脳脊髄液の細胞を含む凍結試料を用いて行われることも確認し、この戦略が多施設研究の文脈で有用である可能性を示唆した。この方法は、irAEの早期診断を容易にし、また、それらの症状を制御し、PD-1阻害剤の後に続く治療を開始するための最適な時間を特定するための適切な免疫抑制治療を決定するのに役立つ可能性があります。

<table><tbody><tr><td>10X RBC Lysis Buffer (Multi-species)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4300-54</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 anti-human CD4 Antibody</td><td>BioLegend</td><td>300518</td><td>Clone RPA-T4</td></tr><tr><td>BD FACS Canto II Flow Cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 510 anti-human CD8a Antibody</td><td>BioLegend</td><td>301048</td><td>Clone RPA-T8</td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate緩衝生理食塩水</td><td>nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Falcon 丸底ポリスチレンチューブ</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>352058</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>FcR ブロッキング試薬、ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>2 mL</td></tr><tr><td>FLOWJO</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco Fetal Bovine Serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12676029</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>マウスIgG1モノクローナル-アイソタイプ制御</td><td>abcam</td><td>ab81200</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗ヒトIgG4 Fc</td><td>abcam</td><td>ab99825</td><td>クローンHP6025</td></tr><tr><td>パシフィックブルーマウス 反ヒトCD3</td><td>BD</td><td>558117</td><td>クローンUCHT1</td></tr><tr><td>PE-Cy7 マウス反ヒトCD279 (PD-1)</td><td>BD</td><td>561272</td><td>クローンEH12.1</td></tr><tr><td>PE-Cy7マウスIgG1 &κ;アイソタイプコントロール</td><td>BD</td><td>557646</td><td></td></tr></tbody></table>

末梢血の低下に由来するt細胞に結合したpd-1遮断抗体のモニタリング

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

PD-1遮断抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤は、様々なタイプの癌における治療結果を有意に改善した。これらの免疫療法の薬理学的有効性は、持続的な血液濃度のために、彼らの注射の中止を超えても延長し、長期的である。ここでは、PD-1遮断抗体ニボルマブおよびペンブロリズマブのT細胞結合状態を評価する簡単なフローサイトメトリーアッセイを開発した。グルコース検査と同様に、このアッセイは末梢血を一滴だけ必要とします。T細胞上での抗体結合の可視化は、抗体血中濃度を測定するよりも信頼性が高い。また、必要に応じて、PD-1-ブロッキング抗体に結合したT細胞上の多くの特徴的な免疫関連マーカーを分析することができます。したがって、これは癌患者におけるPD-1遮断抗体の薬理学的効果を分析するための単純で低侵襲的な戦略です。

GAT化戦略とフローサイトメトリー分析(図1)は、NSCLC患者末梢血の滴から得られたT細胞へのPD-1遮断抗体結合を検出することができる。PD-1-ブロッキング抗体が投与される前に、ヒトIgG4陽性CD8またはCD4 T細胞は存在しない、およびPD-1発現はPD-1検出抗体(EH12.1)によって確認できる(図2A)。ニボルマブまたはペンブロリズマブ投与後、抗IgG4抗体(HP6025)によってT細胞上でIgG4(ニボルマブ、ペンブロリズマブ)を検出できるのに対し、PD-1検出抗体EH12.1は治療用PD-1抗体がEH12.1結合のためにT細胞上のPD-1を認識しない。これは、PD-1-検出抗体の結合の欠如に基づいて、間接的にPD-1-ブロッキング抗体の治療結合を測定していることを意味します。代表的なデータは、PD-1-ブロッキング抗体の異なる結合状態を示す(図2A)。T細胞上でのニボルマブ...

PD-1-ブロッキング抗体とT細胞への結合を評価する簡単なフローサイトメトリーアッセイを開発し、がん患者からの末梢血の滴のみを必要とする。

末梢血の低下に由来するT細胞に結合したPD-1遮断抗体のモニタリング

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

この方法は、患者からの末梢血を用いてPD-1-ブロッキング抗体結合細胞を決定するため、抗腫瘍効果および免疫関連有害事象を担う特異的サブセットを同定することができる。この方法は、血液サンプルの少量を必要とし、分析プロセスはかなり簡単かつ迅速です。それはちょうどフローサイトメトリーマシンを必要とします。まず、全血サンプルをEDTAを含む採血管に採取する。PBSで2%のウシ胎児血清の1ミリリットルで各5ミリリットル丸いポリスチレンフローサイトメトリーチューブを扱います。10秒間渦。その後、全血サンプルの20マイクロリットルを治療した5ミリリットルの丸底管に移す。PBSに2%FBSの20マイクロリットルとヒト特異的FC受容体遮断試薬の10マイクロリットルを加えます。よく混ぜて室温で15分間インキュベートします。次に、500マイクロリットルの赤血球のリシスバッファーを加えます。よく混ぜて室温で10分間インキュベートします。PBSに2%FBSの4ミリリットルを加え、400倍gの細胞を摂氏4度で5分間スピンダウンします。吸引によって上清を取り除く。洗浄と吸引のプロセスを繰り返します。PBSで2%FBSの100マイクロリットルで細胞を再懸濁し、それぞれ50マイクロリットルの2つのチューブに分割します。表面マーカー抗体を追加します。よく混ぜて、暗闇の中で室温で20分間インキュベートします。PBS でサンプルを 2 回 PBS で洗浄します。PBSで2%FBSの200マイクロリットルで細胞を再懸濁します。フローサイトメーターにチューブを挿入し、推奨されるプロトコルに従って細胞を取得します。リンパ球ゲートとして10,000のイベントを記録し、分析のためにFCSファイルとしてフローデータをエクスポートします。解析ソフトウェアでファイルを開き、アイソタイプコントロールのファイルをクリックして、前方散乱線と側散乱プロットおよびゲートリンパ球上の細胞を視覚化します。FSCH 対 FSCW および SSCH 対 SSCW を使用して単一セルを選択し、CD3 対 CD8 または CD3 対 CD4 プロットで表示します。CD8 T細胞とCD4 T細胞をそれぞれゲートします。ゲートセルを選択し、PD-1とヒトIgG4プロットに表示します。そして、アイソタイプコントロールに基づいて、Q3を選択してPD-1ブロック抗体結合CD8およびCD4 T細胞を同定します。本研究では、測定戦略およびフローサイトメトリー分析により、患者末梢血の滴から得られたT細胞に結合するPD-1遮断抗体を検出した。PD-1対ヒトIgG4プロットは、T細胞上のPD-1遮断抗体の結合状態を示す。オレンジ色のドットと黒色のドットは、それぞれ抗IgG4抗体とアイソタイプコントロール染色を示します。PD-1遮断抗体を投与する前に、ヒトIgG4陽性CD8またはCD4 T細胞は存在しなかったし、PD-1の発現はPD-1検出抗体によって確認された。ニボルマブまたはペンブロリズマブ投与後、IgG4は抗IgG4抗体によってT細胞上で検出され、一方PD-1検出抗体EH12.1はT細胞上のPD-1を認識しない。赤、青、緑のゲートは、完全な結合、部分的な結合および結合の喪失をそれぞれ示します。ニボルマブおよびペンブロリズマブを中止した患者の後、CD8 T細胞に結合するPD-1遮断抗体の状態が低下した。部分的な結合があり、最終的にバインディングが完全に失われました。RBCのライシスと血液サンプルを混ぜるようにしてください。また、この方法では、表面マーカー染色前にRBCライシスを混合することが重要なステップである。研究者が高度なフローサイトメトリーマシンにアクセスできる場合、PD-1ブロッキング抗体結合T細胞は、PD-1ブロッキング抗体によって引き起こされる有害事象を担うT細胞型のフェノタイプのプロファイリングに適用することができるこの戦略に関連するより多くのマーカーで評価することができる。この戦略の有用性を評価するには、開発された有害事象を有する患者からのサンプリングが重要である。

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PD-1/PD-L1相互作用のPDL1-Vaxxペプチドワクチン誘導抗体遮断の磁気蛍光ビーズベースのデュアルレポーターフロー分析

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