Name: レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qPCRを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: 学ぶレーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体RT-qPCRを用いた単一細胞転写プロファイル解析法。アミグダラの神経細胞、ミクログリア、アストロサイトから高精度に細胞を採取し、遺伝子発現を測定することで神経科学の研究に貢献します。

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ここで発表された作品は、JSとRVに授与されたNIH HLB U01 HL133360、JSとEVBに授与されるNIDA R21 DA036372、およびSJOの支援としてヤン・フックに授与されたT32 AA-007463を通じて資金提供されました。

この研究は、トーマス・ジェファーソン大学とドレクセル大学医学部の動物ケアと使用委員会(IACUC)の勧告に従って行われました。このプロトコルは、トーマス・ジェファーソン大学とドレクセル大学医学部IACUCによって承認されました。
1. 動物モデル
<ol><li>成人オスのスプレイグ・ドーリーラットに2つの75mgの徐放性モルヒネ硫酸ペレットまたは2つのプラセボペレットを皮下に挿入する。<ol>
<li>軽い無菌手術のために適切にガウンと手袋を使用してください。必要に応じて、ラットのドーサムをバリカンで剃ります。</li>
		<li>動物の目に獣医の軟膏を適用します。イオブルラン吸入でラットを約20s吸入して麻酔をする。麻酔は意識喪失によって確認される。</li>
		<li>ビーズ滅菌鈍いはさみでラットドーサムに中線切開を行い、ビーズ滅菌プローブで真皮を体壁から分離します。真皮の下にペレットをビーズ滅菌鉗子で挿入します。切開を無菌針で閉じた縫合部。 注:全体の手順は、ラットあたり約5分かかります。新鮮な滅菌手袋は、各ラットに使用されます。</li>
		<li>ラットを隔離ケージに入れて術後回復を行います。心拍と規則的な呼吸リズムを確認してください。意識が回復するまで、ラットを観察します。術後の痛みを評価する。</li>
		<li>ラットを評価 8 h 術後と回復および感染の後 12 時間ごとに.ラットは手術から完全に回復したら、コホートの残りの部分とケージに入れます, 約 24 時間手術後.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6日間のモルヒネ暴露の後、Gおよび離脱コホートに腹腔内ナルトレキソン注射(75mg/kg)を与える。 注: この代表的な実験には、4 つのラット コホートがありました (図 1を参照)。</li>
</ol>2. サンプル採取
<ol><li>脳を収穫 6 日後ペレット挿入または 24 ナルトレキソン注射後 24 時間.<ol>
<li>動きの欠如と呼吸数の低下によって示される約30秒間、または意識の喪失が起こるまで、イオフルランチャンバーに動物を置く。</li>
		<li>急激なギロチンを使用して、動物の首を切り落とします。</li>
		<li>動物の頭蓋骨から脳を解剖する。</li>
		<li>鋭いハンドヘルドカミソリを使用して、取り除かれた脳に次の総切開を行います:まず、小脳をスライスして捨てます。第二に、脳幹を脳を脳の前脳から横断切開で分離する。第三に、中線矢状切開で前脳および/または脳幹を半球化する。</li>
		<li>前脳と脳幹を、金型の底部に3〜4 cmの最適な切断温度化合物(OCT)を含むプラスチック組織埋め込み型に入れます。サンプルの残りの部分を OCT でカバーします。</li>
		<li>すぐに、OCTで覆われたサンプルとプラスチック組織埋め込み型をドライアイスとメタノールを含む浴に入れます。メタノールを組織埋め込み型にこぼれさせないでください。組織の採取が終了するまで、メタノールアイス浴中に脳サンプルと埋め込み型を保持します(最大10〜15分)。</li>
		<li>脳サンプルを-80°Cの冷凍庫にできるだけ早く入れる。</li>
	</ol>
</li>
	<li>腸のサンプルを同時に収穫する。<ol>
<li>急速な切断の後、メスで動物の腹部に正中線の切開を行います。</li>
		<li>cecumを見つけて、上向きの結腸への接続を切断します。</li>
		<li>15 mL円錐形チューブにセカール内容物を絞ります。</li>
		<li>直ちに円錐形チューブをドライアイスの上に置き、できるだけ早く-80°Cの冷凍庫に入れます。 注:小腸の内容物は、陰性コントロールと同じ方法を使用して収集することもできます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. スライス
<ol><li>凍結スタットを使用して、片分のラットの前脳をスライスします。<ol>
<li>-80°C冷凍庫から前脳を備えたプラスチック埋め込み型を取り除き、-20°Cのクライオスタットに入れます。</li>
		<li>埋め込み型から、OCT埋め込まれたヘミセクトされた前脳サンプルを取り除きます。必要に応じて、プラスチック埋め込み金型の角を縦にスライスするためにカミソリを使用します。10月を使用してクライオスタットチャックに尾動脈の前脳を取り付けます。 注:CeAを識別するための解剖学的ランドマークは、視管とストリア端子部を含む(図2B)。視管は視性気膜から分岐し、脳が尾部を尾にスライスすると、後頭横を追跡する。光学路がラットの脳アトラスブレグマ-2.12 mm10に見られるものと同様の形態を有する場合、テストスライスは顕微鏡で見ることができる。視管およびストリア末端の形態は、ラット脳アトラス10で確認して、ブレグマを同定し、CeAがストリア末端を取り囲むかどうかを確認することができる。</li>
		<li>CeAを含むセクションに達するまで、ヘミセックされた前脳のロストラルから尾大に10μmの厚いコロナルセクションをスライスします。 メモ:セクションの幅と高さは約200mmです。</li>
		<li>10 μmセクションを平滑ガラススライドに解凍して、CeAまたは好ましい脳領域を含む10 μmのセクションを収集します。すぐにドライアイスの上に置いた金属鍋の上にガラススライドを置きます。脳の切片を含むスライドを-80 °Cの冷凍庫にできるだけ早く入れます。 注:同じスライドに複数のスライスを配置できます。同じスライド上のスライスに異なる細胞型染色を使用する場合は、スライス間に約100mm放置して、疎水性ペンを使用してスライド上の細胞型特異的抗体溶液を分離できるようにします。スライドの端から約20mm離します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 免疫蛍光染色
<ol><li>免疫蛍光を用いて、選択した脳細胞(例えば、ニューロン、ミクログリア、アストロサイトなど)の前脳切片を染色する。<ol>
<li>-80 °C冷凍庫からCeAの10μmセクションのスライドを1つ以上取り外します。</li>
		<li>スライドを30sの75%エタノールで固定します。</li>
		<li>1xリン酸緩衝液生理食塩(PBS)で2%ウシ血清抗原(BSA)で30sのスライスをブロックします。PBSで1倍洗います。</li>
		<li>2分間のスライドに一次抗体溶液を追加し、2%BSA溶液で1xを洗浄します。 注:一次抗体溶液は、上記のブロッキングステップに対して2%の一次抗体、1%RNase Out、および同じBSA PBS溶液の96%で構成されています(ステップ4.1.3)。代表的な実験では、抗NeuN抗体、抗Cd11β抗体、抗GFAP抗体を次の量で使用しました:3 μLの一次体原、1.88 μLのRNA阻害剤、および145.12 μLのBSA溶液を使用しました。</li>
		<li>2次抗体溶液をスライドに3分間追加し、PBSで1xを洗浄します。 注:二次抗体溶液は、1 μLのヤギ抗マウス 488 nm蛍光タグ(1:500)、2.5 μLのRNA阻害剤、1.3 μLのDAPI(1:10,000)、2%BSAの196.5 μLから構成されています。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.エタノールおよびキシレン脱水シリーズ
<ol><li>スライドを30秒間75%エタノールに浸し、その直後に95%エタノールに30秒浸し、その直後にスライドを30秒間100%エタノールに浸し、30秒間100%エタノールを含む第2の容器にスライドを浸す。</li>
	<li>エタノール脱水シリーズに続いて、スライドを1分間注ぎたばかりのキシレンに浸し、スライドを2番目の容器に4分間浸します。</li>
	<li>キシレンバスからスライドを取り出し、暗闇の中で空気を5分間乾燥させます。</li>
	<li>さらに乾燥するために5分間乾燥剤にスライドを置きます。</li>
</ol>6. レーザーキャプチャマイクロディシブ
<ol><li>染色した場合は、顕微鏡にスライドを入れ、解剖学的ランドマーク(すなわち、視性チアズムおよびストリア末端)を使用して関心領域(CeA)を見つける。</li>
	<li>蛍光を使用して、対象領域の染色された細胞の種類とその核を特定します。単一セルのプールされたサンプルを実行する場合は、1 つまたは複数のセルを選択します。LCM ソフトウェアを使用して、対象のセルをマークします。</li>
	<li>LCM キャップを対象領域のスライスの上に置きます。</li>
	<li>赤外線 (IR) レーザーのテスト ショットを使用して、選択した単一セルの領域上でのみ LCM キャップ接着剤が溶けないように、IR レーザーの強度、サイズ、および持続時間を調整します。これにより、選択したセル以外のセルが収集されません。 注:この代表的な実験では、同じ細胞タイプの10個の細胞プールを単一のサンプルとして使用し、同じ治療を行うサンプル間の遺伝子発現における細胞間の変動を制限しました。しかし、この方法は、真の単一細胞実験1,3に使用することができる。</li>
	<li>LCMソフトウェアツールを使用して、分析のために収集する個々のセルを選択します(図2C)。選択された細胞は、ラット脳アトラスとブレグマ10に基づいて、CeA(または選択した脳領域)の解剖学的領域内になければなりません。細胞は、隣接する染色された核から少なくとも3μmであるべきである。</li>
	<li>IRレーザーを発射して、同定された単一細胞を収集します。</li>
	<li>キャップを品質管理(QC)ステーションに配置し、目的のセルのみが選択されていることを確認するためにそれを表示します。他の細胞が誤って選択された場合、キャップがQCステーションに残っている間、紫外線レーザーを使用して不要な細胞を破壊することができます。</li>
	<li>細胞が採取された組織セクションの写真を撮り、解剖学的特異性を文書化する。ラット脳アトラスを基準10として使用して適切であればブレグマからのスライスの距離を記録する。</li>
	<li>LCMキャップをQCステーションから取り外し、サンプル抽出装置と5.5μLのリシスバッファーをサンプルに取り付けます。 注:溶解バッファーソリューションは、0.5 μL の溶解エンハンサーと 5 μL のリサスペンション バッファーから構成されています。</li>
	<li>ExtracSureデバイスを0.5 mLマイクロ遠心分離チューブに取り付け、ホットプレートの上に75°Cで15分間置きます。</li>
	<li>サンプルとリシスバッファーを低速(0.01-0.02 x g)で30 s回転させ、収集したサンプルを-80°Cの冷凍庫に入れます。</li>
</ol>7. 単細胞マイクロ流体RT-qPCR
<ol><li>96.96ダイナミックアレイチップ用シングルセルmRNAの事前増幅<ol>
<li>事前および逆のmRNA qPCR遺伝子プライマーを組み合わせて、プリアンプ(プライマー濃度500nM)を事前に測定するためにプライマープールでアッセイされるすべての遺伝子について、例えば、100 μM プライマーの 1 μL を 80 μL に加えて、120 μL の DNA 懸濁液バッファーを使用します。 注:代表的な実験に使用されるプライマーシーケンスは、O'Sullivanら 4.にあります。</li>
		<li>新しい96 x 96 PCRプレートで、1 μLの5x VILOを各ウェルに追加します。</li>
		<li>-80 °Cで保存されたサンプルからLCM単細胞サンプルを取り除き、短い間に、遠心分離機を低速(0.01-0.02 x g)で短時間に解凍し、5.5 μLの単細胞サンプルをPCRプレートに加えます。各サンプルは、独自のウェルに追加されます。</li>
		<li>サンプルとVILOを入れ、熱を65°Cで1.5分間加熱し、1,300 x gで1分間回転させ、プレートを氷の上に置きます。</li>
		<li>10x cDNA合成マスターミックスの0.15 μL、0.12 μL T4遺伝子32タンパク質、および0.73 μLのDNA懸濁液バッファーを各ウェルに追加します。</li>
		<li>PCRプレートをサーモサイクルに入れ、25°Cで5分間、50°Cで30分間、55°Cで25分間、60°Cで5分、70°Cで10分間、4°Cで終了します。</li>
		<li>各ウェルにTaqポリメラーゼマスターミックス7.5 μLを加えます。</li>
		<li>各ウェルにプライマープール(上記参照)の1.5 μLを追加します。</li>
		<li>PCRプレートをサーモサイクラーに入れ、次のプリアンプ化プロトコルを実行します:95°C 10分間、96°Cの22サイクルを5秒間、60°Cで4分間実行します。</li>
		<li>エキソヌクレアーゼI反応バッファー10x、1.2 μLエキソヌクレアーゼI、および4.2μLのDNA懸濁液バッファーを各ウェルに加えます。</li>
		<li>PCRプレートをサーモサイクラーに入れ、30分間37°C、80°Cで15分間、プロトコルを実行します。</li>
		<li>各ウェルに54 μLのTEバッファを追加します。PCR プレートを 5 分で 1,300 x gで回転させます。次のステップのために12時間以上待っている場合は-20°Cで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>96.96ダイナミックアレイチップ用サンプルプレートを用意します。<ol>
<li>新しい96ウェルPCRプレートで、20x DNA結合色素の0.45 μLと低ROXマスターミックスの4.55 μLを各ウェルに追加します。</li>
		<li>各ウェルに3μLのプリアンプサンプルを加え、PCRプレートを1,300 x gで回転させ、プレートを氷の上に置きます。</li>
	</ol></li>
	<li>96.96ダイナミックアレイチップ用のアッセイプレートを準備します。<ol>
<li>新しい96ウェルPCRプレートに、2x GEアッセイローディング試薬3.75 μLと1.25μLのDNA懸濁液バッファーを各ウェルに加えます。</li>
		<li>対応する各ウェルに2.5 μLの10 μM qPCRプライマーを加えます。PCRプレートを1,300 x gで5分間回転させます。</li>
	</ol></li>
	<li>96.96ダイナミックアレイチップをロードして実行します。<ol>
<li>チップに制御線の流体を盛り付けろ。</li>
		<li>IFCコントローラHXにチップを配置し、プライム(136X)スクリプトを実行します。</li>
		<li>PCR サンプルプレートからサンプルの 6 μL を 96.96 ダイナミックアレイチップの対応するサンプルウェルに追加します。</li>
		<li>PCRアッセイプレートからサンプルの6 μLを96.96ダイナミックアレイチップの対応するアッセイウェルに追加します。</li>
		<li>96.96ダイナミックアレイチップの井戸に気泡をポップするために針を使用してください。</li>
		<li>96.96 ダイナミック・アレイ・チップを IFC コントローラー HX に配置し、ロード・ミックス (136x) スクリプトを実行します。</li>
		<li>IFCコントローラHXからチップを取り外し、保護ステッカーを剥がし、96.96ダイナミックアレイチップをマイクロ流体RT-qPCRプラットフォームに配置します。GE Fast 96 x 96 PCR プロトコル(30 サイクル)を実行します。 注: RNA の品質と結果の有効性は、ゲル電気泳動によるアッセイ検証、溶融温度曲線、サンプルおよびアッセイ複製、および標準的な希釈系列プロットを含む、複数の方法で評価されます。さらに、転写結果は、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイを含む脳の固血切りに関する独立した方法によって検証することができる。</li>
	</ol></li>
</ol>8. マイクロ流体RT-qPCRによる細菌量の測定
<ol><li>スツールDNA抽出キットの指示に従って細菌DNAを抽出します。</li>
	<li>qPCRを用いて細菌DNA濃度を推定する。</li>
	<li>抽出した細菌DNAを新しいPCRプレートに追加します。抽出した細菌DNA 1 μL と 9 μL の DNA 懸濁液を加えます。</li>
	<li>48.48ダイナミックアレイチップ用のアッセイプレートを準備します(ステップ7.2.1~7.2.2を参照)</li>
	<li>48.48ダイナミックアレイチップ用サンプルプレートを準備します(ステップ7.3.1~7.3.2を参照)<ol>
<li>新しい96ウェルPCRプレートで、20x DNA結合色素の0.45 μLと4.55 μLの低ROXマスターミックスを48ウェルに加えます。</li>
		<li>細菌DNAを含むPCRプレートからサンプルの3μLを48ウェルに加え、PCRプレートを1,300 x gで5分間回転させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>48.48 ダイナミックアレイチップをロードして実行します(ステップ7.4.1~7.4.7を参照)。</li>
</ol>

<ol><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inputs+drive+cell+phenotype+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Inputs drive cell phenotype variability.</a> Genome Research. 24, 930-941 (2014).</li>
<li>Park, J., Ogunnaike, B., Schwaber, J., Vadigepalli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+functional+gene+regulatory+network+phenotypes+underlying+single+cell+transcriptional+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying functional gene regulatory network phenotypes underlying single cell transcriptional variability.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117, 87-98 (2015).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Transcriptional+Analysis+Reveals+Novel+Neuronal+Phenotypes+and+Interaction+Networks+Involved+in+the+Central+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Transcriptional Analysis Reveals Novel Neuronal Phenotypes and Interaction Networks Involved in the Central Circadian Clock.</a> Frontiers in Neuroscience. 10, 481(2016).</li>
<li>O'Sullivan, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Glia+and+Neuron+Gene+Expression+in+the+Central+Amygdala+in+Opioid+Withdrawal+Suggests+Inflammation+With+Correlated+Gut+Dysbiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Glia and Neuron Gene Expression in the Central Amygdala in Opioid Withdrawal Suggests Inflammation With Correlated Gut Dysbiosis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 665(2019).</li>
<li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single+cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nature Biotechnology. 33, 155-160 (2015).</li>
<li>Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+to+explore+immune+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunolology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity.</a> Nature Reviews Immunolology. 18, 35-45 (2018).</li>
<li>SEQC/MAQC-III Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+assessment+of+RNA-seq+accuracy%2C+reproducibility+and+information+content+by+the+Sequencing+Quality+Control+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comprehensive assessment of RNA-seq accuracy, reproducibility and information content by the Sequencing Quality Control Consortium.</a> Nature Biotechnology. 32, 903-914 (2014).</li>
<li>Rowin, J., Xia, Y., Jung, B., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+inflammation+and+dysbiosis+in+human+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Gut inflammation and dysbiosis in human motor neuron disease.</a> Physiological Reports. 5, (2017).</li>
<li>Tamboli, C. P., Neut, C., Desreumaux, P., Colombel, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiosis+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Dysbiosis in inflammatory bowel disease.</a> Gut. 53, 1-4 (2004).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%3A+Hard+Cover+Edition%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates: Hard Cover Edition</a>. , (2006).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

単細胞生物学は、細胞の発現型の不均一性と組織機能の堅牢性を実証した。これらの知見は、マクロおよびマイクロスケールの両方で生物学的システムの組織に関する洞察を提供してきた。ここでは、LCMとマイクロ流体qPCRの2つの方法の組み合わせを説明し、比較的低コストで解剖特異性および転写精度を提供する単細胞転写法を得る(図1)。私たちのグループは、システム生物学のアプローチを取り、多くの場合、同じ動物の複数の組織を測定します。これらの方法は、転写レベルでの様々な課題に対する生物学的システムの対応方法を決定する上で、柔軟かつ実りあるものであると考えています。また、これらの方法は、ベースライン条件における細胞型の解剖学的マッピングに用いられます。
私たちは、CeAがオピオイド依存と離脱に対してどのように反応するかを探る最近の出版物からのデータと修正された数字を提供します4.この例では、同じマイクロ流体qPCRプラットフォームを使用して、腸内微生物叢の相対的な存在量を測定しました。方法とワー...

単一細胞の遺伝子発現プロファイルを測定すると、組織内で広範な表現型ヘテロジニティが実証されています。この複雑さは、組織機能を支配する生物学的ネットワークの理解を複雑にしています。私たちのグループと他の人々は、多くの組織や条件1、2、3、4、5、6でこの現象を探求してきました。これらの実験は、遺伝子発現ネットワークの調節がそのような不均一性の根源であることを示唆するだけでなく、単細胞分解能が組織レベルの分解能が理解できない組織機能の複雑さを明らかにすることを示唆している。実際、少数の細胞が特定の状態や課題に反応するかもしれませんが、それらの細胞が全体的な生理学に与える影響は大きいかもしれません。さらに、多変量法を複数の細胞タイプおよび組織からの高次元データセットに適用するシステム生物学アプローチは、システム全体の治療効果を解明することができる。
LCMとマイクロ流体RT-qPCRを組み合わせて、そのようなデータセットを取得します。ここでは、蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して単一細胞を収集し、RNAシーケンシング(RNA-seq)を使用してトランスクリプトームを測定する方法とは対照的に、このアプローチを取ります。FACSに対するLCMの利点は、単一細胞の正確な解剖特異性をLCMで比較的絶対的に文書化できることです。また、RNA-seqはRT-qPCRというより多くの特徴を測定できるが、マイクロ流体RT-qPCRは安価であり、感度と特異性が高い7。
本代表的な実験では、扁桃体の中心核におけるラット神経、ミクログリア、およびアストロサイト遺伝子発現に対するオピオイド依存性およびナルトレキソン沈殿したオピオイド離脱の影響を調べた。4つの治療群を分析した:1)プラセボ、2)モルヒネ、3)ナルトレキソン、および4)離脱(図1)。我々は、オピオイド依存性が遺伝子発現を実質的に変化させなかったが、オピオイド離脱が炎症性遺伝子、特にTnfの発現を誘発することを発見した。アストロサイトは最も影響を受けた細胞型であった。腸内微生物叢は、腸内ジスビオシス8,9の確立されたマーカーであるバクテロイデス比に対するフィルミキュートの減少によって示されるように、オピオイド離脱によって深く影響を受けた。

<table><tbody><tr><td>20X DNA結合染料</td><td>Fluidigm</td><td>100-7609</td><td>NA</td></tr><tr><td>2x GE Assay Loading Reagent</td><td>Fluidigm</td><td>85000802-R</td><td>NA</td></tr><tr><td>48.48 遺伝子発現用ダイナミックアレイIFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-48.48</td><td>NA</td></tr><tr><td>96.96 遺伝子発現用ダイナミックアレイIFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-96.96</td><td>NA</td></tr><tr><td>Anti-Cd11&beta;抗体</td><td>Genway Biotech</td><td>CCEC48</td><td>ミクログリア染色</td></tr><tr><td>抗NeuN 抗体、クローン A60</td><td>EMD ミリポア</td><td>MAB377</td><td>ニューロン染色</td></tr><tr><td>ArcturusXT レーザーキャプチャ マイクロダイセクションシステム</td><td>Arcturus</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA Biomark HD</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td>RT-qPCR platform</td></tr><tr><td>ウシ血清抗原</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LCM0211</td><td>NA</td></tr><tr><td>CellDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11753500</td><td>Lysis Buffer solution</td></tr><tr><td>components DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td>Nucleus Stain</td></tr><tr><td>DNA Suspension Buffer</td><td>TEKnova</td><td>T0221</td><td></td></tr><tr><td>Exonuclease I</td><td>New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0293S</td><td>NA</td></tr><tr><td>ExtracSure サンプル抽出装置</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>LCM0208</td><td>NA</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド スーパーフロストプラス 顕微鏡スライド</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-037-246</td><td>プレーンガラススライド</td></tr><tr><td>GeneAmp 薄肉反応チューブ</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>N8010611</td><td></td></tr><tr><td>GFAP モノクローナル抗体</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A-21294</td><td>アストロサイト染色</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG (H+L)、スーパークローナル&トレード;リコンビナント二次抗体、Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A28175</td><td>Seconadry 抗体</td></tr><tr><td>IFC Controller</td><td>Fluidigm</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>NA RNaseOut</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>SsoFast EvaGreen Supermix with Low Rox</td><td>Bio-Rad</td><td>PN 172-5211</td><td>Rox Master mix</td></tr><tr><td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td><td>ThermoFisherScientific</td><td>Labs</td>は<td>、VILOとSuperScript</td></tr><tr><td>T4 Gene 32</td>タンパク質を含む<td>科学11754250 New Englnad BioLabs, Inc.</td><td>M0300S</td><td>NA</td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4391128</td><td>NA</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>TEKnova</td><td>T0225</td><td>NA</td></tr></tbody></table>

レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qpcrを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ

Combining Laser Capture Microdissection and Microfluidic qPCR to Analyze Transcriptional Profiles of Single Cells: A Systems Biology Approach to Opioid Dependence

解剖学的に隣接する単一細胞における深い転写ヘテロジニティは、細胞表現型多様性によって堅牢な組織機能が達成される可能性があることを示唆している。生体系のネットワークダイナミクスを調べている単細胞実験は、生物学的に意味のある分解能で様々な条件に対する細胞および組織応答を実証する。ここでは、解剖学的に特定の場所から単一細胞を収集し、その遺伝子発現プロファイルのサブセットを正確に測定する方法を説明する。レーザー捕捉マイクロディスセクション(LCM)とマイクロ流体逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)を組み合わせたものです。また、この微流量RT-qPCRプラットフォームを使用して、腸内含量の微生物の存在量を測定します。

単一細胞の選択は、視覚的および分子的に検証された。視覚的には、細胞形態は細胞コレクションの前に見られた。次にQCステーションで採取した細胞を見て、細胞核染色(DAPI)を単一細胞選択マーカー蛍光と重なった。図2Aは、CeAを含むヘミセックラット前脳を有するスライドの代表的な画像を示す。その後の画像(図2B-D)は、単一細胞の選択と、転写分析のための組織からの除去を示す。分子的に、細胞型特異的マーカーは、その細胞型における発現の増加を示した(図1C)。ニューロン、ミクログリア、アストロサイトを調べ、それぞれNeuN、Maf、Gfapの発現を測定しました。 その数字はもともとオサリバンら4社に掲載さ...

このプロトコルは、レーザーキャプチャマイクロ解剖を使用して、扁桃体の中心核から単一のニューロン、ミクログリア、およびアストロサイトを高精度かつ解剖特異性で収集する方法を説明します。さらに、これらの細胞のトランスクリプトームのサブセットを測定するためのマイクロ流体RT-qPCRの使用について説明する。

レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qPCRを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ

Profound transcriptional heterogeneity in anatomically adjacent single cells suggests that robust tissue functionality may be achieved by cellular ...

これは、単一細胞レベルでの遺伝子発現を理解するための非常に正確で費用対効果の高い方法です。この手法の主な利点は、1 つのバッチで 96 サンプルを収めることができるということです。この多くのサンプルは、解剖特異性を持つ細胞下フェノタイプを同定することを可能にする。この方法のパイプラインは、任意の生物学的問題、任意のシステム、任意の組織に適用することができ、疾患または他の任意の障害に対する個々のニューロンまたは他の細胞タイプの個々の細胞応答に関する問い合わせのために、任意の機能。そして、さらに進み、それらの細胞応答が解剖学的アーキテクチャを持っているかどうかを尋ねる。組織採取ボックスから脳を取り出し、クライオスタットチャックの上に置きます。扁桃体または他の好ましい脳領域の中心核を含む10ミクロンのセクションを、10ミクロンのセクションを平野ガラススライド上に取り付けて解凍して収集する。すぐにドライアイスの上に置いた金属鍋の上にガラススライドを置きます。脳の切片を持つスライドをできるだけ早くマイナス80度のフリーザーに入れます。エタノールとキシレンの脱水系列を実行するには、まず、スライドを75%エタノールに30秒間浸します。その直後に、95%エタノールに30秒間浸します。その後、スライドを100%エタノールに30秒間浸します。最後に、スライドを100%エタノールの2番目の容器に30秒間直接浸します。エタノール脱水シリーズに続いて、スライドを1分間注ぎたばかりのキシレンに浸します。その直後に、テキストプロトコルに記載されているように乾燥する前に、スライドをキシレンの2番目の容器に4分間浸します。蛍光を使用して、対象領域の染色された細胞の種類とその核を特定します。単一セルのプールされたサンプルを実行する場合は、1 つまたは複数のセルを選択します。レーザーキャプチャマイクロディスセクションまたはLCMソフトウェアを使用して、関心のあるセルをマークします。LCMキャップを対象領域のスライスの上に置き、テキストプロトコルに記載されているように、選択した単一セルの領域にLCMキャップ接着剤を溶かします。LCM ソフトウェア ツールを使用して、分析用に収集する個々のセルを選択します。選択された細胞は、ラット脳アトラスおよびブレグマに基づく扁桃体の中心核の解剖学的領域内にある必要があります。細胞は、隣接する染色された核から少なくとも3ミクロンであるべきである。その後、赤外線レーザーを発射し、同定された単一細胞を収集する。キャップをQCステーションに配置し、目的のセルのみが選択されていることを確認するためにそれを表示します。他の細胞が誤って選択された場合、キャップがQCステーションに残っている間、紫外線レーザーを使用して不要な細胞を破壊することができます。細胞が採取された組織セクションの写真を撮り、解剖学的特異性を文書化する。ラットの脳アトラスを基準として使用して適切な場合は、ブレグマからのスライスの距離を記録します。QCステーションからLCMキャップを取り外し、サンプル抽出装置を取り付けます。次いで、サンプル上に5.5マイクロリットルのリシスバッファーをピペットします。抽出装置を0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに取り付け、ホットプレートの上に摂氏75度で15分間置きます。サンプルとリシスバッファーを低速で30秒間回転させ、収集したサンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。動的アレイチップ用の単一細胞mRNAの事前増幅を行うために、まず新しい96 x 96 PCRプレートの各ウェルに5X VILOの5マイクロリットルを追加します。LCM単細胞サンプルをマイナス80°Cから取り除き、簡単に解凍させます。低速での遠心分離に続いて、PCRプレートに5.5マイクロリットルの単細胞サンプルを追加し、各サンプルを独自のウェルに追加します。サンプルとVILOを用いたPCRプレートをサーモサイクラーに入れ、摂氏65度で1分半加熱します。その後、1、300倍gと4度で1分間プレートを回転させ、氷の上にプレートを置きます。10X cDNA合成マスターミックス、T4遺伝子32タンパク質、およびDNA懸濁液バッファーを各ウェルに加えます。サンプルプレート1のPCRプレートをサーモサイクラーに入れ、テキストプロトコルで詳細に実行します。サイクル後、96ウェルPCRプレートの各ウェルに9マイクロリットルのTaqポリメラーゼ溶液を加えます。9マイクロリットルは、Taqポリメラーゼマスターミックスの7.5マイクロリットルとプライマープールの1.5マイクロリットルで構成されています。次に、PCR プレートをサーモサイクラーに配置し、テキスト プロトコルで詳しく説明されている事前増幅プログラムを実行します。事前増幅プロトコルに従って、96ウェルPCRプレートの各ウェルに6マイクロリットルのエキソヌクレアーゼ溶液を添加します。エキソヌクレアーゼ溶液は、0.6マイクロリットルのエキソヌクレアーゼ-1反応バッファー、1.2マイクロリットルのエキソヌクレアーゼ-1、および4.2マイクロリットルのDNA懸濁液バッファーから構成されています。PCR プレートをサーモサイクラーに配置し、テキスト プロトコルに記載されているプログラムを実行します。最後に、サンプルプレート1の各ウェルにTEバッファの54マイクロリットルを加えます。PCRプレートを1、300倍gで5分間回転させます。すぐに次のステップに進む場合は、摂氏4度で保存してください。サンプルプレート2の新しい96ウェルPCRプレートに、5マイクロリットルのDNA結合染料とマスターミックス溶液を加えます。サンプルプレート1からサンプルプレート2の対応するウェルに、3マイクロリットルの事前増幅サンプルを追加します。PCRプレートを1、300倍gで回転させ、氷の上に置きます。アッセイプレート2の新しい96ウェルPCRプレートに、5マイクロリットルのアッセイローディング溶液を各ウェルに加えます。アッセイローディング溶液は、2X GEアッセイローディング試薬3.75マイクロリットルと、井戸当たりの1.25マイクロリットルのDNA懸濁液バッファーで構成されています。次に、アッセイプレート1から2.5マイクロモルqPCRプライマーをアッセイプレート2に対応するウェルに添加します。PCRプレートを1、300倍gで5分間回転させます。動的アレイチップをロードして実行するには、まずチップに制御線液を盛り付けます。次に、IFC コントローラ HX にチップを配置し、prime 136X スクリプトを実行します。サンプルプレート2から6マイクロリットルを96 by 96ダイナミックアレイチップの対応するサンプルウェルに追加します。次に、アッセイプレート2から6マイクロリットルを96 by 96ダイナミックアレイチップの対応するアッセイ井戸に追加します。96 by 96のダイナミックアレイチップの井戸に気泡をポップするために針を使用してください。次に、IFC コントローラ HX にチップを配置し、負荷ミックス 136X スクリプトを実行します。次に、IFCコントローラHXからチップを取り外します。96 by 96 のダイナミックアレイチップをマイクロ流体 RT-qPCR プラットフォームに配置し、GE ファスト 96 by 96 PCR プロトコルを実行します。単一細胞の選択は、視覚的および分子的に検証された。視覚的には、細胞形態は細胞コレクションの前に見られた。ここに示されているのは、扁桃体の中心核を含むヘミセックラット前脳を有するスライドの代表的な画像である。その後の画像は、単一細胞の選択と、トランスクリプトーム分析のための組織からの除去を示す。分子的に、細胞型特異的マーカーは、それぞれの細胞型において発現の増加を示した。具体的には、NeuNの発現の増加は、ニューロン、ミクログリアにおけるMaf、およびアストロサイトにおけるGfapにおいて観察された。ヒートマップは、40のアッセイされた遺伝子にわたるすべてのサンプルの発現を示しています。行は引張プールサンプルで、数字はサンプルクラスターを示し、列は遺伝子です。多変量解析法は、離脱群のアストロサイトが最も影響を受けた細胞型であることを示す。他の研究の文脈でこれらのデータに基づいて,アストロサイトはオピオイド離脱中に扁桃体の中心核の炎症に重要な役割を果たす可能性が高い。この技術について覚えておくべきことは、気泡の数を制限するために適切なピペットを使用することです。これらの実験からの転写所の所見は、同じ組織上の免疫蛍光やウェスタンブロットなどのタンパク質測定法を用いて検証することができる。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

レーザーマイクロダイセクションは、ローカライズされたRNAi実験に供ショウジョウバエの翅のディスクの特定のコンパートメントでの遺伝子発現プロファイリングの解析に適用した...

から細胞のサブセットの遺伝子発現プロファイリングへの応用レーザーマイクロダイセクションショウジョウバエウィングディスク

この記事では、ラット初代ニューロン培養とaRNAの増幅を使用して、その後のトランスクリプトーム解析から単一細胞の収穫のための簡単​​な方法を説明します。このアプローチは、任意の細胞型への一般化です。...

単一細胞のトランスクリプトーム解析

マウス脳の特定の領域におけるRNA発現プロファイリングには、正確で再現性のある組織採取戦略が必要です。ここでは、冠状断による脳切断と組織コーラーを用いたマイクロダイセクションの両方を併用するプロトコルについて説明します。得られたサンプルから抽出した全RNAの収量と品質により、本手法の有用性が確認されています。...

トータルRNAの単離およびダウンストリーム次世代シーケンシングと遺伝子発現プロファイリングのための離散マウスの脳領域のマイクロダイセクションのための非レーザーキャプチャー顕微鏡のアプローチ

我々は、海馬ニューロンまたは定量的リアルタイムPCRおよび/または全ゲノムマイクロアレイを用いてその後の遺伝子発現解析のために負傷したラット脳の凍結切片からの単一ニューロンの濃縮された集団を得るためにレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）を使用する方法について説明します。...

外傷性脳損傷後の神経細胞や遺伝子発現解析のための単一ニューロンの濃縮された集団のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション

個々のドーパミンニューロンの単離または直接または間接的な免疫組織化学との腹側被蓋領域は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクションを用いて実証されている。赤外線レーザーを用いてガラススライドから組織を単離するため、赤外および紫外レーザーの組み合わせを使用して膜のスライドからパラメータが議論されている。...

レーザーキャプチャーマイクロダイセクション - 個々のドーパミンニューロンの単離と全体の腹側被蓋領域の実証

ここでは、転写プロファイリングのための特定の植物細胞タイプのレーザー支援マイクロダイセクションのためのプロトコルを提示します。このプロトコルはさまざまな種や細胞タイプに適していますが、焦点は、アブラナ科Boechera属の有性生殖およびアポミティック生殖に重要な雌性生殖細胞の非常にアクセスしにくい細胞にあります。...

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

一括遺伝子発現測定クラウド個々 のセル違い異種細胞集団で。ここでは、プロトコルについて述べる方法単一細胞遺伝子発現解析とインデックスの不均一性の線引きによって蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) を並べ替えを結合でき、immunophenotypically...

組合せの単一セルは分子を特徴付ける方法・肺浸潤異質性ひと幹と前駆細胞集団

このプロトコルは、マウス胚の新鮮な凍結切片から軟骨および骨を分離するためのレーザー捕捉マイクロセクションを記述する。軟骨および骨はクレシルバイオレット染色によって急速に視覚化され、正確に集めることができるので、トランスクリプト工学的分析のための高品質のRNAを得ることができます。...

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。...

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションとマイクロ流体RT-qPCRの組み合わせは、単一ニューロンおよびグリアのトランスクリプトームを測定する際に解剖学的およびバイオテクノロジーの特異性を提供します。精神疾患に対するシステムの生物学的アプローチによる創造的な方法を適用することは、依存症における神経炎症反報酬仮説などの理解と治療におけるブレークスルーにつながる可能性があります。...

解剖学的に特異的な単一細胞遺伝子発現法による依存行動における反報酬の要因の調査

本プロトコルは、パラホルムアルデヒド固定および最適切断温度化合物埋め込みマウス肝組織の定義された組織領域からRNAをレーザーキャプチャマイクロ解剖を用いて単離し、ターゲットを絞った下流遺伝子発現解析を可能にする方法を説明しています。...

パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

学ぶレーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体RT-qPCRを用いた単一細胞転写プロファイル解析法。アミグダラの神経細胞、ミクログリア、アストロサイトから高精度に細胞を採取し、遺伝子発現を測定することで神経科学の研究に貢献します。

レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qPCRを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ

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