レーザーキャプチャー微小解剖とマイクロ流体qPCRを組み合わせて単一細胞の転写プロファイルを解析する:オピオイド依存へのシステム生物学アプローチ

これは、単一細胞レベルでの遺伝子発現を理解するための非常に正確で費用対効果の高い方法です。この手法の主な利点は、1 つのバッチで 96 サンプルを収めることができるということです。この多くのサンプルは、解剖特異性を持つ細胞下フェノタイプを同定することを可能にする。

この方法のパイプラインは、任意の生物学的問題、任意のシステム、任意の組織に適用することができ、疾患または他の任意の障害に対する個々のニューロンまたは他の細胞タイプの個々の細胞応答に関する問い合わせのために、任意の機能。そして、さらに進み、それらの細胞応答が解剖学的アーキテクチャを持っているかどうかを尋ねる。組織採取ボックスから脳を取り出し、クライオスタットチャックの上に置きます。

扁桃体または他の好ましい脳領域の中心核を含む10ミクロンのセクションを、10ミクロンのセクションを平野ガラススライド上に取り付けて解凍して収集する。すぐにドライアイスの上に置いた金属鍋の上にガラススライドを置きます。脳の切片を持つスライドをできるだけ早くマイナス80度のフリーザーに入れます。

エタノールとキシレンの脱水系列を実行するには、まず、スライドを75%エタノールに30秒間浸します。その直後に、95%エタノールに30秒間浸します。その後、スライドを100%エタノールに30秒間浸します。

最後に、スライドを100%エタノールの2番目の容器に30秒間直接浸します。エタノール脱水シリーズに続いて、スライドを1分間注ぎたばかりのキシレンに浸します。その直後に、テキストプロトコルに記載されているように乾燥する前に、スライドをキシレンの2番目の容器に4分間浸します。

蛍光を使用して、対象領域の染色された細胞の種類とその核を特定します。単一セルのプールされたサンプルを実行する場合は、1 つまたは複数のセルを選択します。レーザーキャプチャマイクロディスセクションまたはLCMソフトウェアを使用して、関心のあるセルをマークします。

LCMキャップを対象領域のスライスの上に置き、テキストプロトコルに記載されているように、選択した単一セルの領域にLCMキャップ接着剤を溶かします。LCM ソフトウェア ツールを使用して、分析用に収集する個々のセルを選択します。選択された細胞は、ラット脳アトラスおよびブレグマに基づく扁桃体の中心核の解剖学的領域内にある必要があります。

細胞は、隣接する染色された核から少なくとも3ミクロンであるべきである。その後、赤外線レーザーを発射し、同定された単一細胞を収集する。キャップをQCステーションに配置し、目的のセルのみが選択されていることを確認するためにそれを表示します。

他の細胞が誤って選択された場合、キャップがQCステーションに残っている間、紫外線レーザーを使用して不要な細胞を破壊することができます。細胞が採取された組織セクションの写真を撮り、解剖学的特異性を文書化する。ラットの脳アトラスを基準として使用して適切な場合は、ブレグマからのスライスの距離を記録します。

QCステーションからLCMキャップを取り外し、サンプル抽出装置を取り付けます。次いで、サンプル上に5.5マイクロリットルのリシスバッファーをピペットします。抽出装置を0.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに取り付け、ホットプレートの上に摂氏75度で15分間置きます。

サンプルとリシスバッファーを低速で30秒間回転させ、収集したサンプルをマイナス80°Cの冷凍庫に入れます。動的アレイチップ用の単一細胞mRNAの事前増幅を行うために、まず新しい96 x 96 PCRプレートの各ウェルに5X VILOの5マイクロリットルを追加します。LCM単細胞サンプルをマイナス80°Cから取り除き、簡単に解凍させます。

低速での遠心分離に続いて、PCRプレートに5.5マイクロリットルの単細胞サンプルを追加し、各サンプルを独自のウェルに追加します。サンプルとVILOを用いたPCRプレートをサーモサイクラーに入れ、摂氏65度で1分半加熱します。その後、1、300倍gと4度で1分間プレートを回転させ、氷の上にプレートを置きます。

10X cDNA合成マスターミックス、T4遺伝子32タンパク質、およびDNA懸濁液バッファーを各ウェルに加えます。サンプルプレート1のPCRプレートをサーモサイクラーに入れ、テキストプロトコルで詳細に実行します。サイクル後、96ウェルPCRプレートの各ウェルに9マイクロリットルのTaqポリメラーゼ溶液を加えます。

9マイクロリットルは、Taqポリメラーゼマスターミックスの7.5マイクロリットルとプライマープールの1.5マイクロリットルで構成されています。次に、PCR プレートをサーモサイクラーに配置し、テキスト プロトコルで詳しく説明されている事前増幅プログラムを実行します。事前増幅プロトコルに従って、96ウェルPCRプレートの各ウェルに6マイクロリットルのエキソヌクレアーゼ溶液を添加します。

エキソヌクレアーゼ溶液は、0.6マイクロリットルのエキソヌクレアーゼ-1反応バッファー、1.2マイクロリットルのエキソヌクレアーゼ-1、および4.2マイクロリットルのDNA懸濁液バッファーから構成されています。PCR プレートをサーモサイクラーに配置し、テキスト プロトコルに記載されているプログラムを実行します。最後に、サンプルプレート1の各ウェルにTEバッファの54マイクロリットルを加えます。

PCRプレートを1、300倍gで5分間回転させます。すぐに次のステップに進む場合は、摂氏4度で保存してください。サンプルプレート2の新しい96ウェルPCRプレートに、5マイクロリットルのDNA結合染料とマスターミックス溶液を加えます。

サンプルプレート1からサンプルプレート2の対応するウェルに、3マイクロリットルの事前増幅サンプルを追加します。PCRプレートを1、300倍gで回転させ、氷の上に置きます。アッセイプレート2の新しい96ウェルPCRプレートに、5マイクロリットルのアッセイローディング溶液を各ウェルに加えます。

アッセイローディング溶液は、2X GEアッセイローディング試薬3.75マイクロリットルと、井戸当たりの1.25マイクロリットルのDNA懸濁液バッファーで構成されています。次に、アッセイプレート1から2.5マイクロモルqPCRプライマーをアッセイプレート2に対応するウェルに添加します。PCRプレートを1、300倍gで5分間回転させます。

動的アレイチップをロードして実行するには、まずチップに制御線液を盛り付けます。次に、IFC コントローラ HX にチップを配置し、prime 136X スクリプトを実行します。サンプルプレート2から6マイクロリットルを96 by 96ダイナミックアレイチップの対応するサンプルウェルに追加します。

次に、アッセイプレート2から6マイクロリットルを96 by 96ダイナミックアレイチップの対応するアッセイ井戸に追加します。96 by 96のダイナミックアレイチップの井戸に気泡をポップするために針を使用してください。次に、IFC コントローラ HX にチップを配置し、負荷ミックス 136X スクリプトを実行します。

次に、IFCコントローラHXからチップを取り外します。96 by 96 のダイナミックアレイチップをマイクロ流体 RT-qPCR プラットフォームに配置し、GE ファスト 96 by 96 PCR プロトコルを実行します。単一細胞の選択は、視覚的および分子的に検証された。視覚的には、細胞形態は細胞コレクションの前に見られた。

ここに示されているのは、扁桃体の中心核を含むヘミセックラット前脳を有するスライドの代表的な画像である。その後の画像は、単一細胞の選択と、トランスクリプトーム分析のための組織からの除去を示す。分子的に、細胞型特異的マーカーは、それぞれの細胞型において発現の増加を示した。

具体的には、NeuNの発現の増加は、ニューロン、ミクログリアにおけるMaf、およびアストロサイトにおけるGfapにおいて観察された。ヒートマップは、40のアッセイされた遺伝子にわたるすべてのサンプルの発現を示しています。行は引張プールサンプルで、数字はサンプルクラスターを示し、列は遺伝子です。

多変量解析法は、離脱群のアストロサイトが最も影響を受けた細胞型であることを示す。他の研究の文脈でこれらのデータに基づいて,アストロサイトはオピオイド離脱中に扁桃体の中心核の炎症に重要な役割を果たす可能性が高い。この技術について覚えておくべきことは、気泡の数を制限するために適切なピペットを使用することです。

これらの実験からの転写所の所見は、同じ組織上の免疫蛍光やウェスタンブロットなどのタンパク質測定法を用いて検証することができる。