Name: 直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 学ぶ直交膵腫瘍の外科的生成と急速消化法による腫瘍浸潤T細胞の分離・刺激。PMAとイオノマイシンを用いた細胞傷害性応答の解析により、膵がん免疫環境の理解と新規治療戦略の評価に貢献する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

動物技術者サービスとアルツベタ・タラロヴィコワ博士(バーツがん研究所、ロンドン、ロンドン、イギリスのクイーンメアリー大学)は、オルソトピック手術中の彼らの援助に感謝したいと思います。また、ジェニファー・モートン博士(英国グラスゴー・グラスゴーがん研究所)の外科技術に関する指導をいただき、クリスティーナ・ギレリ博士(バーツがん研究所、ロンドン、ロンドン、ロンドン、イギリス)の腫瘍消化に関するアドバイスとファビエンヌ・マクラナハン博士(バーツがん研究所、ロンドンのクイーン・メアリー大学)に感謝申し上げます。 また、医学研究評議会(MRC)、膵臓がん研究基金(PCFR)、卵巣がんアクションのご協力にも感謝申し上げます。

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li>
<li>Conroy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+standards+and+new+innovative+approaches+for+treatment+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Current standards and new innovative approaches for treatment of pancreatic cancer.</a> European Journal of Cancer. 57, 10-22 (2016).</li>
<li>Lee, J. W., Komar, C. A., Bengsch, F., Graham, K., Beatty, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+mouse+models+of+pancreatic+cancer%3A+The+KPC+model+%28LSL-KrasG12D%2F%2B%3BLSL-Trp53R172H%2F%2B%3BPdx-1-Cre%29%2C+its+variants%2C+and+their+application+in+immuno-oncology+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered mouse models of pancreatic cancer: The KPC model (LSL-KrasG12D/+;LSL-Trp53R172H/+;Pdx-1-Cre), its variants, and their application in immuno-oncology drug discovery.</a> Current Protocols in Pharmacology. 2016, (2016).</li>
<li>Tseng, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Orthotopic+Model+of+Invasive+Pancreatic+Cancer+in+an+Immunocompetent+Murine+Host%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Development of an Orthotopic Model of Invasive Pancreatic Cancer in an Immunocompetent Murine Host.</a> Clinical Cancer Research. 16 (14), 3684-3695 (2010).</li>
<li>Majumder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Immunocompetent+Mouse+Model+of+Pancreatic+Cancer+with+Robust+Stroma%3A+a+Valuable+Tool+for+Preclinical+Evaluation+of+New+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastrointestinal+Surgery%22%5BJournal%5D)">A Novel Immunocompetent Mouse Model of Pancreatic Cancer with Robust Stroma: a Valuable Tool for Preclinical Evaluation of New Therapies.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 20 (1), 53-65 (2016).</li>
<li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp53R172H+and+KrasG12D+cooperate+to+promote+chromosomal+instability+and+widely+metastatic+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.</a> Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).</li>
<li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Witkiewicz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Patient-Derived+Models+Delineate+Individualized+Therapeutic+Vulnerabilities+of+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Integrated Patient-Derived Models Delineate Individualized Therapeutic Vulnerabilities of Pancreatic Cancer.</a> Cell Reports. , (2016).</li>
<li>Nicolle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+Adenocarcinoma+Therapeutic+Targets+Revealed+by+Tumor-Stroma+Cross-Talk+Analyses+in+Patient-Derived+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Pancreatic Adenocarcinoma Therapeutic Targets Revealed by Tumor-Stroma Cross-Talk Analyses in Patient-Derived Xenografts.</a> Cell Reports. , (2017).</li>
<li>Spear, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrepancies+in+the+Tumor+Microenvironment+of+Spontaneous+and+Orthotopic+Murine+Models+of+Pancreatic+Cancer+Uncover+a+New+Immunostimulatory+Phenotype+for+B+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Discrepancies in the Tumor Microenvironment of Spontaneous and Orthotopic Murine Models of Pancreatic Cancer Uncover a New Immunostimulatory Phenotype for B Cells.</a> Frontiers in Immunology. 10, 542(2019).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF1%2FCSF1R+blockade+reprograms+tumor-infiltrating+macrophages+and+improves+response+to+T-cell+checkpoint+immunotherapy+in+pancreatic+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CSF1/CSF1R blockade reprograms tumor-infiltrating macrophages and improves response to T-cell checkpoint immunotherapy in pancreatic cancer models.</a> Cancer Research. , (2014).</li>
<li>Lee, J. J., Huang, J., England, C. G., McNally, L. R., Frieboes, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictive+Modeling+of+In+vivo+Response+to+Gemcitabine+in+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Predictive Modeling of In vivo Response to Gemcitabine in Pancreatic Cancer.</a> PLoS Computational Biology. , (2013).</li>
<li>Clark, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+Immune+Reaction+to+Pancreatic+Cancer+from+Inception+to+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the Immune Reaction to Pancreatic Cancer from Inception to Invasion.</a> Cancer Research. 67 (19), 9518-9527 (2007).</li>
<li>Fukunaga, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+together+with+CD4%2B+tumor-infiltrating+lymphocytes+and+dendritic+cells+improve+the+prognosis+of+patients+with+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes together with CD4+ tumor-infiltrating lymphocytes and dendritic cells improve the prognosis of patients with pancreatic adenocarcinoma.</a> Pancreas. 28 (1), 26-31 (2004).</li>
<li>Tewari, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+tumor-associated+lymphocytes+confers+a+good+prognosis+in+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%3A+an+immunohistochemical+study+of+tissue+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">The presence of tumor-associated lymphocytes confers a good prognosis in pancreatic ductal adenocarcinoma: an immunohistochemical study of tissue microarrays.</a> BMC Cancer. 13 (1), 436(2013).</li>
<li>Royal, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+2+Trial+of+Single+Agent+Ipilimumab+%28Anti-CTLA-4%29+for+Locally+Advanced+or+Metastatic+Pancreatic+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Phase 2 Trial of Single Agent Ipilimumab (Anti-CTLA-4) for Locally Advanced or Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma.</a> Journal of Immunotherapy. 33 (8), 828-833 (2010).</li>
<li>Brahmer, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+Activity+of+Anti%E2%80%93PD-L1+Antibody+in+Patients+with+Advanced+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Safety and Activity of Anti–PD-L1 Antibody in Patients with Advanced Cancer.</a> New England Journal of Medicine. 366 (26), 2455-2465 (2012).</li>
<li>Winograd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T-cell+Immunity+Overcomes+Complete+Resistance+to+PD-1+and+CTLA-4+Blockade+and+Improves+Survival+in+Pancreatic+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of T-cell Immunity Overcomes Complete Resistance to PD-1 and CTLA-4 Blockade and Improves Survival in Pancreatic Carcinoma.</a> Cancer Immunology Research. 3 (4), 399-411 (2015).</li>
<li>Beatty, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+Agonists+Alter+Tumor+Stroma+and+Show+Efficacy+Against+Pancreatic+Carcinoma+in+Mice+and+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CD40 Agonists Alter Tumor Stroma and Show Efficacy Against Pancreatic Carcinoma in Mice and Humans.</a> Science. 331 (6024), 1612-1616 (2011).</li>
<li>Lutz, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+converts+nonimmunogenic+pancreatic+tumors+into+immunogenic+foci+of+immune+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy converts nonimmunogenic pancreatic tumors into immunogenic foci of immune regulation.</a> Cancer Immunology Research. 2 (7), 616-631 (2014).</li>
<li>Barry, M., Bleackley, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocytes%3A+all+roads+lead+to+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocytes: all roads lead to death.</a> Nature Reviews. Immunology. 2 (6), 401-409 (2002).</li>
<li>Mojic, M., Takeda, K., Hayakawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dark+side+of+IFN-%CE%B3%3A+Its+role+in+promoting+cancer+immunoevasion%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The dark side of IFN-γ: Its role in promoting cancer immunoevasion.</a> International Journal of Molecular Sciences. , (2018).</li>
<li>Castro, F., Cardoso, A. P., Gonçalves, R. M., Serre, K., Oliveira, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+at+the+crossroads+of+tumor+immune+surveillance+or+evasion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma at the crossroads of tumor immune surveillance or evasion.</a> Frontiers in Immunology. , (2018).</li>
<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nature Immunology. , (2011).</li>
<li>Betts, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+viable+identification+of+antigen-specific+CD8%2B+T+cells+by+a+flow+cytometric+assay+for+degranulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+ T cells by a flow cytometric assay for degranulation.</a> Journal of Immunological Methods. 281 (1-2), 65-78 (2003).</li>
<li>Schuerwegh, A. J., De Clerck, L. S., Bridts, C. H., Stevens, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intracellular+cytokine+production+with+extracellular+cytokine+levels+using+two+flow+cytometric+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Comparison of intracellular cytokine production with extracellular cytokine levels using two flow cytometric techniques.</a> Cytometry. 55 (1), 52-58 (2003).</li>
<li>Partecke, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+syngeneic+orthotopic+murine+model+of+pancreatic+adenocarcinoma+in+the+C57%2FBL6+mouse+using+the+panc02+and+6606PDA+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22European+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A syngeneic orthotopic murine model of pancreatic adenocarcinoma in the C57/BL6 mouse using the panc02 and 6606PDA cell lines.</a> European Surgical Research. , (2011).</li>
<li>An, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotyping+of+Orthotopic+Homograft+%28Syngeneic%29+of+Murine+Primary+KPC+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), (2018).</li>
<li>Jiang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+orthotopic+pancreatic+cancer+mouse+model%3A+Cells+suspended+and+injected+in+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Establishment of an orthotopic pancreatic cancer mouse model: Cells suspended and injected in Matrigel.</a> World Journal of Gastroenterology. , (2014).</li>
<li>Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+enzymatic+tissue+disintegration+on+the+level+of+surface+molecule+expression+and+immune+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Microbiology+%26+Immunology%22%5BJournal%5D)">Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function.</a> European Journal of Microbiology & Immunology. 2 (2), 112-120 (2012).</li>
<li>Trapecar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Optimized+and+Validated+Method+for+Isolation+and+Characterization+of+Lymphocytes+from+HIV%2B+Human+Gut+Biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">An Optimized and Validated Method for Isolation and Characterization of Lymphocytes from HIV+ Human Gut Biopsies.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. , (2017).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+enzymatic+digestion%2C+cell+culture+and+preservation+conditions+on+surface+CD62L+expression+of+primary+murine+CD3%2BCD4%2BT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Research+%28India%29%22%5BJournal%5D)">Effects of enzymatic digestion, cell culture and preservation conditions on surface CD62L expression of primary murine CD3+CD4+T cells.</a> Biomedical Research (India). 29 (10), 2153-2159 (2018).</li>
<li>Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+processing+time+and+duration+of+collagenase+digestion+on+human+and+murine+fat+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. , (2015).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO Journal. , (2013).</li>
<li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. , (2015).</li>
<li>Misra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+organotypic+culture+system+of+precision-cut+slices+of+human+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Scientific Reports. , (2019).</li>
<li>Moran, A. E., Polesso, F., Weinberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunotherapy+Expands+and+Maintains+the+Function+of+High-Affinity+Tumor-Infiltrating+CD8+T+Cells+In+Situ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunotherapy Expands and Maintains the Function of High-Affinity Tumor-Infiltrating CD8 T Cells In Situ.</a> The Journal of Immunology. , (2016).</li>
<li>Stromnes, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+Engineered+against+a+Native+Antigen+Can+Surmount+Immunologic+and+Physical+Barriers+to+Treat+Pancreatic+Ductal+Adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">T Cells Engineered against a Native Antigen Can Surmount Immunologic and Physical Barriers to Treat Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.</a> Cancer Cell. , (2015).</li>
<li>Singh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+targeted+long-read+single+cell+sequencing+reveals+the+clonal+and+transcriptional+landscape+of+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes.</a> Nature Communications. 10 (1), 3120(2019).</li>
<li>Jiang, N., Schonnesen, A. A., Ma, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion+Ushering+in+Integrated+T+Cell+Repertoire+Profiling+in+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Opinion Ushering in Integrated T Cell Repertoire Profiling in Cancer.</a> Trends in Cancer. 5, 85-94 (2019).</li>
<li>Schietinger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Specific+T+Cell+Dysfunction+Is+a+Dynamic+Antigen-Driven+Differentiation+Program+Initiated+Early+during+Tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Tumor-Specific T Cell Dysfunction Is a Dynamic Antigen-Driven Differentiation Program Initiated Early during Tumorigenesis.</a> Immunity. 45 (2), 389-401 (2016).</li>
<li>Raghav, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exhaustion+of+tumor-specific+CD8%2B+T+cells+in+metastases+from+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Exhaustion of tumor-specific CD8+ T cells in metastases from melanoma patients.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+identifies+the+patient-specific+in+filtrating+human+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">PD-1 identifies the patient-specific in filtrating human tumors.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2014).</li>
<li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+exhausted+CD8+%2B+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subsets of exhausted CD8 + T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. , (2019).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

膵臓癌の生体内モデルは、疾患の進行を理解し、新しい治療薬の標的を評価するための貴重なツールを提供します3.特にオルソトピックモデルは、マウスの大きなコホートに同時に適用できる費用対効果の高い再現性の高いモデルである4、27である。オルソトピックモデルはまた、腫瘍増殖のための認知微小環境および無傷の免疫系を提供し、皮下およびPDXモデルよりも適切である。しかしながら、免疫浸潤のいくつかの要素は、オルソトピックモデルとKPCマウスとの間で異なっていくことができることを発見した、金標準マウスモデル10。この理由の1つは、オルソトピックモデルに見られる加速腫瘍増殖である可能性がある。免疫細胞サブセットの密度のさらなる違いは、オルソトピックモデルと皮下モデル3、28との間に記載されている。したがって、トランスジェニックKPCモデルはより高価で可変6ですが、可能であればKPCマウスの小さなコホートで主要な所見を検証する必要があります。
オルソトピック手術のための腫瘍細胞の調製は、プロトコルの重要なステップである。細胞は常に増殖の対数段階にあり、マイコプラズマと感染のないものでなければなりません。腫瘍細胞の増殖に懸念がある場合は、直交外科手術を延期すべきである。基底膜の使用は、それ29なしで注射細胞上の腫瘍発生率を改善し、したがって、細胞漏出を減少させ、したがって腹膜広が27。しかし、一度基底膜に懸濁すると、腫瘍細胞は細胞損失を避けるために迅速に注射されるべきである(2時間以内)。腫瘍を生成するために必要な腫瘍細胞の数は、細胞株依存性である可能性が高く、細胞番号の範囲(例えば、100〜100,000から)をテストする必要があり、これはエンドポイントに到達する時間を決定することもあります。注射のためにマウスあたり1,000細胞を準備する際に誤差のマージンがある可能性があります。したがって、複数の日数の手術が必要な場合は、バッチ効果を制御するために、グループの治療を数日にわたって均等に分散する必要があります。ほとんどの外科的ステップは、好みに応じて変更することができます。しかし、腹腔内の膵臓を交換したり、腹壁を閉じたりする際には、基底膜を乱さないように注意する必要があります。基底膜漏出は腹膜壁に腫瘍細胞の増殖を引き起こし、急速に形成され、動物を早期に犠牲にしなければならないことがある。
理想的には、膵臓腫瘍は、収穫後に迅速に消化し、すぐにex生体内刺激のために調製されるべきである。しかし、収穫する腫瘍の大きなバッチがある場合、これは不可能な場合があり、この場合、腫瘍は氷上に保持し、バッチで消化する必要があります。消化酵素への曝露の種類、濃度及び長さは、いずれも免疫細胞30、31、32上の多数の表面分子に影響を及ぼすことが示されている。消化時間も意図的に短く、細胞死33を制限する。消化された細胞は、長期保存のための凍結培地で凍結することができます。ただし、解凍時に一部の細胞損失が発生します。コラゲターゼインキュベーションの前に腫瘍片が十分にダイシングされていない場合、消化プロセスは最適以下であり、これは消化後に硬い腫瘍片がフィルターに残ることを明らかにするでしょう。コラゲターゼ濃度は、健康な膵臓または初期の腫瘍で働く場合に低下させることができる;健康な膵管細胞の抽出に関する報告は、有意に低い濃度34を使用する。高い程度の上皮細胞死は消化中に期待される。しかし、免疫細胞は、プロセスを十分に許容する必要があります。オルガノイド増殖35に対して生存可能な上皮細胞を単離するか、または組織アーキテクチャ36を保存するための代替方法が存在する。
刺激プロトコルに対する改変は、分析された所望の読み出しおよび免疫細胞(例えば、マクロファージまたはB細胞)に応じて容易に行うことができる。汎刺激試薬PMA/イオノマイシンの使用はTCR抗原特異性を区別せず、抗原が知られていない場合に有用である。しかしながら、IFNの産生はTCR関与37と密接に関連しており、IFN及びTNFα産生の両方がPDAC抗腫瘍応答38において重要である。PMA/イオノマイシン刺激は、腫瘍微小環境内のT細胞によって産生される場合と産生されない場合があるサイトカインを産生するT細胞の最大容量を反映する。内因性の生産は、刺激を必要とせずに測定することができます。ただし、レベルははるかに低いか、検出できない場合があります。T細胞を刺激する別の方法があります:抗CD3/28コーティングビーズは、抗原や実際に他の免疫細胞集団を必要としません。この方法の利点は、分離方法を必要とせずに特定のT細胞サブセットによるサイトカイン産生の定量を可能にする。細胞傷害性の他のマーカー(グランザイムBおよびペルフォーリンA)、活性(IL-2)または免疫抑制(IL-10)も21を添加することができる。しかし、高品質のフローサイトメトリー抗体は、すべてのサイトカインおよび関心のある因子を検出するために利用できるわけではありません。従って、ELISAのような他の用途がある場合、ブレフェルジンA/モネンシンを含めずに刺激を行うことができ、サイトカインを上清に放出することを可能にする。しかし、これは総細胞サイトカイン放出を可能にし、どの細胞集団が寄与しているかを決定することはできない。
IFNγ産生は、抗腫瘍T細胞応答の主要な特徴であり、TCR抗原認識37、38の代用としてしばしば用いられる。抗原特異的応答をより正確に定義する他の生体内法は、オボアルブミンまたはSV40などの公知の抗原を発現する腫瘍細胞を利用する。普遍的な抗原は、T細胞認識をテストするために、またはTCR制限された宿主マウスと組み合わせてテストするためにex vivoを使用することができる。あるいは、抗原が不明な場合には、T細胞クローン拡張の定量は、バルクTCRシーケンシング、または最近では単一細胞TCRシーケンシング39、40によって行うことができる。腫瘍内T細胞応答の状態を完全に理解するために、疲労または阻害受容体を示すマーカーも測定されるべきである:CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM3、2B4。エフェクターT細胞のマーカー(CD44 hi、CD62lo)および増殖活性と同様に、Ki67+またはCSFE希釈41、42、43、44。全体的に、オルソトピックモデルは、治療戦略を迅速にテストするための有用なプラットフォームを提供し、特に抗腫瘍T細胞応答を調節し得る、トランスジェニック、KPC、マウスのより小さなコホート上で検証することができる。

この方法の詳細は、開始から終了まで、最小限の細胞材料を用いて正形性膵腫瘍を生成するための外科的処置およびT細胞機能のex vivo分析を含む免疫細胞集団の包括的なフローサイトメトリー分析のための確立された腫瘍のその後の急速解離を行う。
膵管腺癌(PDAC)は、5年1を生存する患者のわずか8%を有する積極的な癌である。患者の20%未満は外科的切除2の対象であるため、新鮮な患者サンプルは研究のために容易にアクセスできないため、生体内モデルはこの疾患を調査するのに不可欠なツールを提供します。PDACの複数のマウスモデルがある:オルソトピック、皮下、トランスジェニック、静脈内および患者由来異種移植片(PDX)、ここで広く説明する3。ここで説明するオルソトピックモデルは、免疫担当マウスの膵臓に同系PDAC細胞を注入することを可能にする。これは、野生型または変異型マウスの大規模なコホートで行うことができ、従って治療薬の比較のための費用対効果が高く、一貫したモデルを提供する。重要なことに、オルソトピックモデルは、腫瘍細胞の増殖および転移のための認知微小環境を、臨床的に関連する部位(例えば肝臓)に、臨床的に関連する部位(例えば肝臓)に提供し、皮下または化学的に誘発されたモデルよりも臨床的に関連する。直交トピック腫瘍は、線維芽細胞および細胞外マトリックス沈着5の豊富さとの強力なデスモプラスチック反応のようなPDACの主要な特徴を示す。PDACのトランスジェニックモデルは、マウスモデルのゴールドスタンダードであり、最も一般的に使用されるKPCモデルは、膵臓特異的Pdx-1-Creプロモーター6の下で変異クラスG12D/+およびTrp53R172H/+を発現するKPCモデルである。追加の KPC およびその他の生体内PDAC モデルについては、ここでは7を確認してください。KPCマウスは、ヒトPDAC6の特徴を忠実に複製する疾患進行を有する膵腫瘍を自発的に発症する。しかし、すべてのトランスジェニックモデルに関しては、繁殖プログラムは高価であり、腫瘍の進行は可変であり、したがって、多くの場合、マウスの大きなコホートを必要とする。PDXモデルは、免疫不全マウスにおいて直交またはより頻繁に皮下に増殖される患者由来の腫瘍細胞または断片を使用する。異種移植片モデルは、治療化合物をスクリーニングするための有用なツールを提供し、患者の不均一性を説明します。しかし、それらは完全な免疫微小環境を提供しないので、彼らのアプリケーション8、9を制限します。
いったん確立されると、オルソトピック腫瘍は、通常、(使用される細胞株に応じて)成長するのに約1ヶ月以上かかり、超音波またはMRIによって容易に画像化され、進行を追跡し、治療有効性を決定することができる大きな腫瘍を形成する。しかし、一度指数関数的な成長で、腫瘍増殖の最終段階は迅速であり得るので、ほとんどの治療レジメンは比較的早く(例えば、14日)11、12に開始される。免疫系は、T細胞の相対的な貧弱性および骨髄細胞13の頻繁な存在を有する免疫抑制腫瘍浸潤を特徴とするPDACを含む腫瘍発達において重要な役割を果たす。PDACにおけるT細胞の高い存在は、より良い予後14、15を与える。しかしながら、単一剤として、抗CTLA-416および抗PD-L117などのT細胞免疫抑制を緩和する免疫チェックポイント阻害剤は、PDAC患者において臨床的利益を示しておらず、全体的なT細胞反応性が非常に低いためである可能性が最も高い。しかしながら、抗CD40などの主要なT細胞応答が抗PD-L1/CTLA-4耐性18、19およびGM-CSF分泌同種PDACワクチン(GVAX)によるワクチン接種を克服できる薬剤は、PDAC腫瘍20の免疫原性を高めることができ、T細胞応答を増強することが重要な治療手段を形成することを示す。
抗腫瘍T細胞応答に重要なのは、T細胞受容体(TCR)を介した腫瘍由来抗原の認識および細胞傷害性サイトカインおよび顆粒のその後の産生である。T細胞抗原認識はTCRシーケンシングによって決定できるが、このアプローチはコストと時間がかかる。しかしながら、腫瘍浸潤T細胞サブセットの定量は、抗腫瘍応答の良好な指標を提供する。脱顆粒、サイトカイン産生および他の細胞傷害因子の観点からT細胞活性ex vivoのさらなる検討は、より深い機能分析を提供する。これらのアッセイは、新鮮な腫瘍サンプルに対して行うことができ、T細胞機能の多くのパラメータは、フローサイトメトリーによって迅速に測定することができる。
CD8+およびCD4+T細胞は、免疫応答21を増強するIFNγおよびTNFαなどのサイトカインを産生する。IFN>は、標的細胞に対するMHCIアップレギュレーションを誘導し、免疫細胞の分化とリクルートを誘導し、細胞死を助ける。CD8+T細胞によるIFNγ産生は、抗腫瘍応答の一部であることを十分に特徴付け、腫瘍回帰22、23と相関する。TNFαは、CD8+およびCD4+T細胞の両方によって産生される別の炎症性サイトカインである。それはTCR依存的な活性化およびT細胞の増殖を高め、抗腫瘍応答を助する。TCR関与時に、細胞傷害性CD8+T細胞は脱顆粒を受けることができ、そこで細胞傷害性分子を含む分泌リソソームが免疫学的シナプスに放出され、標的細胞分解を引き起こす21。これらの分子には、標的細胞膜に結合するタンパク質であるPerforinが含まれ、膜の完全性を破壊し、グランザイムBのような他の細胞傷害性分子の拡散21またはエンドサイトーシス24を標的細胞の細胞質に直接浸着させる毛穴を形成する。グランザイムBは、標的細胞内の複数のタンパク質の分解を行うプロテアーゼであり、細胞死21につながる。このような分子の放出は、エンドソームの細胞表面へのエキソソームのエキソサイトーシスを必要とし、そこでエンドソームマーカーCD107a(LAMP−1とも呼ばれる)が細胞膜25に一時的に組み込まれる。
T細胞によるサイトカイン分泌の測定には、フローアシスト細胞選別またはビーズベースの分離アッセイによる単離が必要であり、多数のサンプルに対して同時に容易に行うことができない。しかし、細胞内サイトカインの測定は、事前分離ステップを必要とせず、一度に複数のサンプルに対して簡単に実行できるため、よりスループットの高いアプローチが可能です。サイトカインはT細胞によって急速に分泌されるため、細胞内レベルは検出不能であり、したがってT細胞は基底サイトカイン産生を増加させる刺激を必要とする。抗原駆動サイトカイン産生を評価するには、TCRによって認識される抗原をインビトロでプライミングされたAPCによってT細胞に提示されなければならない。抗原特異性が不明な場合には、広範な刺激アプローチが必要である。TCR刺激は、サイトカイン産生および増殖を誘発するTCR活性化および共刺激の両方を提供する抗CD3/28ビーズを用いて模倣することができる。しかし、より費用対効果の高い代替手段は、PMAとイオノマイシンの使用であり、細胞内サイトカインの合成および放出につながるシグナル伝達経路を広く活性化する。具体的には、PMAはプロテインキナーゼC(PKC)を活性化し、イオノマイシンは細胞内Ca2+イオンを上昇させ、細胞シグナル伝達の増加につながる。サイトカインの細胞内含有量を維持するために、この刺激は、ゴルジ内のタンパク質を遮断し、細胞外放出を防ぐタンパク質輸送阻害剤ブレフェルディンAおよびモネンシンと効果的に組み合わせることができる。PMA/イオノマイシンの使用は、T細胞を刺激するための確立された方法であり、細胞外放出と細胞内サイトカイン26との間に強い相関がある。PMAおよびイオノマイシンを用いたT細胞の刺激はまた、細胞膜へのリソソーム密売を増加させ、したがってCD107aは細胞表面に一過性に統合され、細胞内にリサイクルされる。刺激中に抗CD107a抗体を含むまでに、脱顆粒活性25のマーカーとして用いることができる。
この方法は、単細胞懸濁液を提供するために腫瘍を迅速に消化する。この時点で、個々の集団は、フローサイトメトリーのために直接染色されるか、または下流の方法によって精製することができる:フローアシスト細胞選別または磁気ビーズ分離。フローサイトメトリー分析のための単細胞懸濁液の調製は、複数の免疫細胞集団とその表現マーカーのハイスループット分析を可能にし、免疫細胞数および表現型の正確な定量を提供する。
最後に、ここで説明する消化プロトコルは、細胞表面マーカーの損失を防止し、免疫細胞の生存率を維持し、免疫細胞が必要に応じてさらなる細胞精製工程および培養を受けることを可能にする。しかしながら、この方法は、この消化から上皮細胞を導出するための試験されていない。

<table><tbody><tr><td>6/0ゲージコーティングビクリル吸収性縫合糸Ethicon</td><td></td><td>W9500T</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;m 細孔サイズ細胞ストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11597522</td><td></td></tr><tr><td>9 mm クレイ アダムス クリップ</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015A</td><td></td></tr><tr><td>抗CD107a PE (クローン 1D4B)</td><td>Biolegend</td><td>121612</td><td>1:100 から培養培地</td></tr><tr><td>抗CD16/CD32</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>553142</td><td>最終希釈 1:200</td></tr><tr><td>抗CD3 PerCP eFluor710 (クローン 17A2)</td><td>Biolegend</td><td>46-0032</td><td>最終希釈で使用 1:50</td></tr><tr><td>抗CD4 FITC (クローンGK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td>最終希釈で使用 1:100</td></tr><tr><td>抗CD45 ブリリアントバイオレット 605 (クローン 30-F11)</td><td>バイオレジェン</td>ド <td>103140</td><td>最終希釈で使用 1:200</td></tr><tr><td>抗CD8 ブリリアントバイオレット 421 (クローン 53-6.7)</td>バイオ<td>レジェン</td>ド <td>100738</td><td>最終希釈で使用 1:100</td></tr><tr><td>抗IFN-γ PE/Cy7 (クローン XMG1.2)</td><td>Biolegend</td><td>505826</td><td>最終希釈で使用 1:50</td></tr><tr><td>抗 TNF-α Alexa Fluor 647 (クローン MP6-X)</td><td>Biolegend</td><td>506314</td><td>最終希釈で使用 1:50</td></tr><tr><td>BD マトリゲル基底膜マトリックス 高濃度</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td>氷上でアリコートし、-20 °Cで保存します。C</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Cell Stimulation Cocktail (500x) (ホルボール 12-ミリスチン酸 13-アセテート (PMA) とイオノマイシン)</td><td>eBioscience</td><td>00-4970-03</td><td>1x 最終濃度 PMA 0.081 &mu;M、イオノマイシン1.34&mu;M</td></tr><tr><td>Clay Adams オートクリップ アプライヤー</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>クレイ アダムス オートクリップ リムーバー</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ V 型 Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9263</td><td>2 mg/mL 中 ジ</td></tr><tr><td>メチル スルホキシド (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース (4.5 g/L)L-グルタミン</td><td>PAA</td><td>E15-810</td><td></td></tr><tr><td>DNase (ウシ膵臓II型由来デオキシリボヌクレアーゼI) ストック 10 mg/mL 0.15 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td> 消化<td>培地の最終濃度 0.025 mg/mL</td></tr><tr><td>固定生存率 色素 506 (FVD506)</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td> PBS <td></td></tr><tr><td>胎児子牛血清 (FCS)</td> <td>GE Healthcare</td><td>A15-104</td><td>RPMI</td></tr> <tr><td>10% で 1:200 で使用ハミルトンシリンジ700シリーズ、25 &mu;L容積、22sゲージ針ベベルチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10100332</td><td></td></tr><tr><td>細胞内固定バッファーおよび細胞内透過化バッファー</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td>透過化バッファーをH2O</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>PAA</td><td>15140122で</td>1倍に希釈します <td>100ユニット/mL ペニシリン、100 &mu;g/mL ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>タンパク質輸送阻害剤カクテル (500x) (ブレフェルジンAおよびモネシン)</td><td>eBioscience</td><td>00-4980-03</td><td>1x 最終濃度 ブレフェルジンA 10.6 &mu;M、モネンシン2 &mu;M</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (0.3 g/L グルタミン含有)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>外科用メスブレード No.10</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA 溶液 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>594-18C</td><td>トリプシン (0.1%) EDTA (0.4%) 最終濃度</td></tr><tr><td>U-底 96 マイクロウェルプレート</td><td>VWR</td><td>734-2080</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルコットンチップアプリケーター - 6インチ x 100</td><td>Medisave</td><td>UN982</td><td></td></tr><tr><td>V底 96 マイクロウェル プレート</td><td>VWR</td><td>735-0184</td><td></td></tr></tbody></table>

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤t細胞細胞傷害のex生体内特性評価

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

膵臓癌の生体内モデルは、疾患のダイナミクス、免疫浸潤および新しい治療戦略を研究するための貴重なツールを提供する。オルソトピックマウスモデルは、免疫担当マウスの大きなコホート上で同時に行うことができ、比較的安価であり、認知組織の微小環境を維持する。直交腫瘍内のT細胞浸潤および細胞傷害活性の定量は、抗腫瘍応答の有用な指標を提供する。
このプロトコルは、膵臓に直接5μL基底膜に再懸濁された少数の同種腫瘍細胞の注射による正形性膵腫瘍の外科的生成のための方法論を記述する。オルソトピック腫瘍を有するマウスは、エンドポイントに到達するまでに約30日かかり、その時点で腫瘍が収穫され、腫瘍浸潤T細胞活性の特徴付けのために処理することができる。コラゲナーゼとDNaseを用いた迅速な酵素消化により、腫瘍から単細胞懸濁液を抽出することができます。腫瘍から抽出された免疫細胞の生存率および細胞表面マーカーが保存される。したがって、培養またはRNA抽出のための免疫細胞のフローアシスト細胞選別、免疫細胞集団のフローサイトメトリー分析を含む複数の下流アプリケーションに適しています。ここでは、細胞内サイトカイン定量(IFNγおよびTNFα)および脱顆粒活性(CD107a)に対するT細胞集団のex vivo刺激を、全体的な細胞毒性の尺度として説明する。全腫瘍消化は、サイトカイン産生および脱顆粒をアップレギュレートするために抗CD107a抗体の存在下で、5時間のホモル筋酢酸およびイオノマイシンで刺激された。最後の4時間にブレフェルジンAとモネンシンを添加し、細胞外輸送を遮断し、サイトカイン検出を最大化するために行った。次いで、フローサイトメトリー分析のために細胞の余分および細胞内染色を行い、そこでIFNγ+、TNFα+およびCD107a+CD4+およびCD8+T細胞の割合を定量した。
この方法は、腫瘍微小環境の包括的な分析を行う開始塩基を提供する。

膵臓に1000 TB32048細胞を注入した後、直交話題性腫瘍の発症には約30日かかります(図1A,B)。手術中の基底膜漏出は、皮膚を通して顕著に見える腹膜壁に直接大きな腫瘍を形成させる可能性がある(図1C)。我々はこれらのマウスを研究から取り除くだろう。しかし、良好な外科的スキルを有する場合、漏出の発生率は最小限に抑えられる。エンドポイントで採取された直交腫瘍は、C57BL/6野生型マウスにおいてかなりの大きさに成長する可能性がある(図1D)。収穫されたオルトトピック腫瘍は、単一細胞懸濁液を達成するために20分間コラゲナーゼ/DNaseで消化を必要とする(図2)。この時点で、腫瘍由来細胞は、2 x 106細胞/ウェルでU底板にめっきすることができる。めっきされた細胞の数は、サンプル内のT細胞の有病率に応じて変更することができます。T セルの密度が高い場合は、セル番号を小さくすることができます。コントロール脾臓またはリンパ節サンプルは、刺激のためにこの時点でめっきすることもできる。各ウェルは、5時間のPMAおよびイオノマイシンで刺激され、1時間インキュベーション後に、ブレフェルジンAおよびモネンシンがサイトカインの細胞外放出を遮断するために添加される(図2)。インキュベーション後、フローサイトメトリーによる分析のために細胞外エピトープおよび細胞内サイトカインのサンプルを染色する(図2)。
正形トピック腫瘍を有するマウス由来の脾臓および腫瘍のサンプルをフローサイトメトリーにより分析した。脾臓および正形トピック腫瘍のフローサイトメトリー分析で使用されるゲーティング戦略は、FSC-A、SSC-A、FSC-A/FSC-HおよびSSC-A/SSC-Wによるダブレットを使用して破片を除外し、その後、固定可能な生存性色素の陽性として死細胞またはアポトーシス細胞を除く(図3A)。次に、免疫細胞を CD45+としてゲートし、さらに CD3+ としてゲートされた T 細胞は、そこから CD4+および CD8+サブセットが定義されます (図 3A)。蛍光マイナス1(FMO)は、ゲーティングのためのバックグラウンド蛍光を決定するために行われ、ブレフェルジンA/モネンシンのみの制御は、サイトカインの基底産生を決定するために行われる(図3B-D)。
IFNγの場合、ブレフェルニンA/モネンシンによるインキュベーションは、脾臓および腫瘍サンプルの両方でFMO制御上のIFNγの増加を生じなかった。しかし、PMAとイオノマイシンの添加は、脾臓および腫瘍由来CD4+およびCD8+T細胞の両方で検出可能な細胞内IFNの%を増加させた。
脾臓CD4+およびCD8+T細胞は、陽性対照として使用され、腫瘍浸潤T細胞サブセットよりも比較的高いIFNγ産生を有し、平均6.60±1.5%および12.97±3.4%と比較して、4.81±1.0%および4.13±1.3%と比較して、腫瘍内で免疫抑制が起こることを示す(B3および図3)。TNFαについても同じ戦略を用いて、脾臓CD4+T細胞の割合が高い割合で細胞内TNFα(65.93±2.3%)が腫瘍浸潤CD4+T細胞(22.45±5.4%)と比較して陽性であることを可視化しました。脾臓および腫瘍浸潤CD8+T細胞は、TNFα(25.15±3.7%および19.91±5.1%それぞれ)の類似レベルを産生する(図3C、図4B)。
最後に、CD107aは、細胞傷害性顆粒およびサイトカインのエキソサイトーシスの間に細胞表面上に一過性に発現される内染色マーカーであり、そのように、細胞傷害性の代理マーカーとして使用される。刺激中のCD107aの染色の利点は、すべての一過性細胞表面発現CD107aが蛍光抗体によって捕捉されることです。CD107aの基底レベルは、ブレフェルジンA/モネンシンのみ処理された細胞に示されている。脾臓CD8+T細胞の場合、PMA/イオノマイシンによる刺激は検出されたCD107aのレベルを増加させ、CD8+細胞において最<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig04large.jpg" target="_blank"></a>

このプロトコルは、正形外科膵腫瘍の外科的生成と、新たに単離されたマウス膵腫瘍の急速な消化について説明する。消化後、生存可能な免疫細胞集団は、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン検出のためのT細胞のex生体内刺激を含むさらなる下流分析に使用することができる。

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

この方法は、膵臓癌中の細胞傷害性T細胞応答に影響を与えるか、または増強する新しい治療薬または戦略を、どのようにアセスするのに使用することができる。この技術により、腫瘍を迅速に消化し、インビトロで刺激することができ、同時にT細胞応答の複数のパラメータの分析を可能にし、他のアプリケーションに容易に適応することができる。まず、鉗子を使用して、腫瘍をシャーレに移します。酵素活性の発生を防ぐために、50ミリリットルの消化培地を氷上に5ミリリットル保存します。ペトリ皿の腫瘍をカバーするために、この溶液の小さなアリコートを取る。滅菌メスと鉗子を使用して腫瘍を小片に切り、およそ3ミリメートル未満の長さに切ります。腫瘍片をチューブに削り取り、すべての部分が消化媒体に沈むまでチューブを穏やかに反転させます。チューブを37°Cで20分間揺れる装置に移して消化します。腫瘍のすべての部分が水没し、チューブの端にくっついないようにしてください。消化ステップの直後に、チューブを氷の上に置いて酵素活性を遅くする。EDTAを加えて20ミリモルの最終濃度を達成し、さらに酵素活性を遅くするためにサンプルを混合する短時間渦を加える。チューブを開き、新鮮なRPMI培地でチューブの蓋から任意の腫瘍消化をすすいでください。その後、70ミクロンのストレーナーを準備し、氷の上に50ミリリットルのオープンチューブの上に置きます。フィルターを培地で事前に濡らします。消化した細胞を再び懸濁し、25ミリリットル以上のストリペットを使用してチューブの側面を洗います。ストライプの広い開口部は厚いダイジェストが容易に通過することを可能にする。25ミリリットルのストリペットを使用して、すべてのダイジェストをストレーナーに移します。1ミリリットルのシリンジプランジャーを使用して、フィルターの上の腫瘍を上下にマッシュダウンします。回転数でストレーナーを通して細胞を連続的に洗浄します。細胞を押し通すのに十分な力で洗うようにしてください。すべての細胞がストレーナーを通過するまで洗浄を続けます。チューブをGの300倍、摂氏4度で5分間遠心します。細胞ペレットを慎重に再懸濁し、RPMIを完了し、別のフィルターを直接通過して、細胞外マトリックス、または十分に再懸濁できない大きな細胞塊を除去します。刺激が必要ない場合は、すぐにフローサイトメトリー分析のために単離された細胞を染色するか、10%DMSOおよびFBSの凍結培地で再懸濁し、マイナス80°Cで保存します。刺激を行うために、まず細胞を数える。完全な培地で細胞を希釈し、100マイクロリットルあたり6倍の濃度を達成します。U底96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞をプレートします。PMAの2X調製物、およびイオノマイシンを含む完全な培地の100マイクロリットルを加える。プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、5%の二酸化炭素を1時間置きます。次いで、ブレフェルディンAの10X調製物の20マイクロリットル、およびモネンシンで、完全な培地で、それぞれ1.06マイクロモル、および2.0マイクロモルの最終濃度を達成した。プレートをインキュベーターにさらに4時間戻します。1000 TB32048細胞を膵臓に注入した後、正交性腫瘍の発症に約30日かかります。採取された直交性腫瘍の消化および刺激後、蛍光マイナス1を行い、格化のためのバックグラウンド蛍光を決定した。ブレフェルディンAモネンシンのみ制御が行われ、サイトカインの基礎生産を決定した。ブレフェルディンAおよびモネンシンによるインターフェロンガンマインキュベーションの場合、脾臓および腫瘍サンプルの両方において、FMO対照に対するインターフェロンガンマの増加はなかった。しかし、PMAおよびイオノマイシンを添加すると、脾臓および腫瘍由来CD4陽性およびCD8陽性T細胞の両方で検出可能な細胞内インターフェロンガンマの割合が増加した。脾臓CD4陽性およびCD8陽性T細胞は、陽性対照として使用され、腫瘍浸潤T細胞サブセットよりも比較的高いインターフェロンガンマ産生を有する。腫瘍内で免疫抑制が起こることを示す。TNF αに対して同じ戦略を用い、細胞内TNFαに対して高い割合の脾臓CD4陽性T細胞が陽性であった。腫瘍浸潤CD4陽性T細胞と比較した。脾臓および腫瘍浸潤CD8陽性T細胞は、同様のレベルのTNFαを産生した。腫瘍が十分に切り刻まれ、すべての部分が消化媒体に沈めていることを確認してください。腫瘍をつぶすときは、優しく、細胞を徹底的に洗い流してください。腫瘍消化プロトコルはフローアシスト細胞分類と組み合わせることができ、個々の免疫細胞サブセットを精製して、追加、機能的、または遺伝子発現解析を行うことができます。この方法を用いて、膵臓がん中のB細胞が免疫応答を形成し、B細胞ノックアウトマウスとB細胞枯渇マウスの両方で正腸腫瘍を発生させる方法を特徴付けました。

generation-orthotopic-pancreatic-tumors-ex-vivo-characterization

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

この記事では、インターフェロンガンマやIFN-ガンマなどのサイトカインや腫瘍壊死因子アルファまたはTNF-αなどのT細胞内の細胞内濃度を増加させるためのex vivo T細胞刺激の技術について説明しています。これらのサイトカインは、効果的な抗腫瘍反応を媒介し、腫瘍において治療的役割を果たすことができます。...

膵臓腫瘍におけるex vivo T細胞刺激:T細胞におけるサイトカイン産生を増加させる方法

このビデオでは、膵臓がんの発症のために、がん性ドナーから非がん性レシピエントマウスの膵臓に腫瘍断片を同所性に移植するための段階的な外科的方法を説明しています。同所性に移植されたPDACは、従来の皮下(SC)モデルよりも正確にヒトの膵臓がんの組織微小環境を再捕捉できます。...

同所性ホモグラフト腫瘍移植:膵臓腫瘍マウスモデル作製技術

膵臓癌生物学の理解の向上は非常に重要膵臓癌を治療するための良好な治療選択肢の開発を可能にするために必要とされる。このニーズに対応するために、我々は使用して癌の進行の非侵襲的なモニタリングを可能に膵臓癌の同所性モデルを示す...

膵臓癌の進行の生物発光同所性モデル

実験マウスの同所性同種 PDAC 移植の診療には、腫瘍免疫微小環境のプロファイリングを目指しています。腫瘍は、手術を介して注入したがんです。200-600 mm3の大きさの腫瘍は、収穫され、異なる蛍光標識抗体を用いて免疫マルチ マーカー FACS...

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

本論文では、三次元(3D)胸腺培養系により腫瘍抗原特異的誘導多能性幹細胞由来の甲状腺系(iTE)を生成する新しい方法について説明する。iTEは、増殖、記憶形成、腫瘍抑制の能力を有するナイーブT細胞と密接に関連するT細胞の均質なサブセットである。...

マウス誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的胸腺移民を生成する三次元胸腺培養システム

臨床文脈では、局所性膵臓癌の患者は汎膵切除術を受け、続いてアジュバント治療を受ける。ここで報告されるこのプロトコルは、膵臓癌の正体性移植を経て、遠位汎化切欠切術および脾臓摘出術を通じて、ヌードマウスでこの臨床シナリオをモデル化する安全で効果的な方法を確立することを目的としている。...

膵臓癌の正交性切除マウスモデル

ここでは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍固有および末梢由来腫瘍浸潤リンパ球の特性評価のための腫瘍移植プロトコールを提示する。フローサイトメトリーによるレシピエント由来免疫細胞の流入の特異的追跡は、抗腫瘍免疫応答中のこれらの細胞の表現型および機能的変化のダイナミクスを明らかにする。...

マウスにおける腫瘍浸潤CD8+ T細胞の動態を評価するための腫瘍移植

このプロトコルは、器官型スライス培養物(OTSC)の調製を説明しています。この技術により、無傷の多細胞組織の ex vivo...

原発性膵臓癌および転移における腫瘍微小環境の前臨床モデルとしての器官型スライス培養

ヒト膵臓癌細胞の超音波ガイド下注射とその後の超音波画像によるin vivo...

超音波ガイド下注射による膵臓癌細胞の同所性異種移植片の作製

膵管腺癌(PDAC)の同系マウス同所性同種移植片は、疾患サブタイプの生物学、表現型、および治療反応を再現します。迅速で再現性のある腫瘍進行により、前臨床試験で広く使用されています。ここでは、これらのモデルを生成するための一般的な方法を示し、同系マウスPDAC培養物を膵臓に注入します。...

膵臓癌モデルへの同系マウス同所性同種移植片

マウスの腫瘍浸潤リンパ球(TIL)をフローサイトメトリーを通じて養子細胞移植に利用する方法について説明します。このプロトコルは、同系膵臓がんマウスモデルにおける腫瘍に対するTILの特異的細胞毒性を検証することを目的としており、膵臓がんの養子細胞療法の開発に関する洞察を提供します。...

膵臓癌マウスモデルにおける腫瘍浸潤リンパ球のフローサイトメトリーに基づく単離と治療的評価

学ぶ直交膵腫瘍の外科的生成と急速消化法による腫瘍浸潤T細胞の分離・刺激。PMAとイオノマイシンを用いた細胞傷害性応答の解析により、膵がん免疫環境の理解と新規治療戦略の評価に貢献する。

直交トピック膵腫瘍の生成と腫瘍浸潤T細胞細胞傷害のEx生体内特性評価

さらに動画を探す