Name: ヒト血小板における筋萎縮性側索硬化症の潜在的バイオマーカーを探索するためのキャピラリー電気泳動免疫学的研究法の使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: 学ぶ キャピラリー電気泳動免疫学的研究法を用いて、ヒト血小板リゼートからALSの血液バイオマーカーを高効率に探索する手法です。TDP-43などのタンパク質を迅速に検出し、大規模臨床試験での病態進行モニタリングに貢献します。

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この研究は、A.A.に授与された壁内助成金によって後援されました。この研究は、カンザス大学フロンティア医療センター:ハートランド臨床・トランスレーショナル研究研究所(#UL1TR606381)に授与されたNCATSからのCTSA助成金によって支えられた。内容は著者の責任であり、必ずしもNIHまたはNCATSの公式見解を表すものではありません。私たちは、健康なボランティアとALS患者から血液サンプル採取のためのIRB承認を得たカンザス大学医療センターALSクリニックに個人的に感謝しています。著者らは、原稿の校正に対するエムレ・アグバスに感謝している。

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著者らは、プロテインシンプル社がこの原稿の出版費用をカバーした以外は、競合する金銭的利益はないと宣言している。

毛管電気泳動系免疫測定法は、ハイスループットのサンプル分析および薬物スクリーニング25に対して現在選択の方法である。小さいサンプル容積、よく最適化されたアッセイコンポーネント、使いやすいアッセイプラットフォームおよび計装、試薬費、および低CVパーセントは、主な利点26、27である。異なるアッセイモダリティでタンパク質を分離するためのいくつかの方法がありますが、ここで説明する抗体ベースのCEIは、血液ベースのバイオマーカーの開発に従事している小さな研究所によって適応することができます。ここで使用されるCEIアッセイ技術は、TDP-4328とそのリン酸化誘導体5に対して、信頼性が高く、再現性があり、高感度な測定値を提供します。
CEIシステムはまた、TDP-43とそのリン酸化誘導体を同時に分析し、精製または組み換え標的タンパク質が利用可能である場合に標的タンパク質の直接定量を提供するという多重選択を提供する。完全長組換え TDP-43 タンパク質は市販されています。しかしながら、組換えリン酸化TDP-43誘導体はそうではない。リン酸化されたTDP-43は市販されていないので、ALS患者におけるTDP-43プロファイルを評価するために予測リン酸化値(PPV)を実施した。パンTDP-43およびリン酸化TDP-43量は、フルオロフォアで永久にラベル付けされた;したがって、TDP-43 プロファイルは、定量単位 (つまり、ng/mL、pg/mL など) の有無にかかわらず同じままです。TDP-43およびそのリン酸化誘導体の絶対量を決定する(すなわち、P[S409-410-12]TDP-43)より定量的な測定を提供するが、PPVの算出は、標準化のための組換えリン酸化TDP-43の必要性を排除し、商業的に利用できないからである。
CEIは、アッセイが失敗した場合に問題を正確に特定するために、アッセイプラットフォーム内のいくつかのチェックポイントを提供します。これにより、障害を排除し、より良い実験設計を提供します。アッセイ手順は、サンプルプレートを充填する以外は完全に自動化されています。これは、標準的なウェスタンブロッティング解析と比較して重要な特徴です。この機能は、実行から実行への一貫性を提供します。すべての研究室には独自の標準的な操作手順がありますが、人為的ミスを最小限に抑えるプラクティスに従うことが重要です。例えば、ルミノールに過酸化物を添加すると酵素反応が始まり、ルミノール基質を消費するため、プレートローディングの直前にルミノール-S/過酸化物混合物を調製することが重要です。サンプルと一次/二次抗体を気泡なしでプレートウェルにロードすることも非常に重要なステップです。
さらに、プレートウェルは容積が小さく、井戸間にスペースがないため、他のすべてが自動化されているため、最も重要なステップであるピペッティング中は注意が必要です。サンプル、抗体、およびその他の試薬の積載順序は、アッセイの一貫性のために重要である(図1)。プレート調製のプロセスは約40〜45分かかります。したがって、まず必要なアッセイ成分をプレートにロードし、ピペット処理の直前にルミノール-S/過酸化物混合物を準備することをお勧めします。このようにして、一貫した一連の試薬添加があり、かつ一貫した発光信号強度が達成される。それは主に過酸化物の強度に影響を与えるため、期限切れのルミノール-S/過酸化物試薬を使用することは推奨されません。スプリットバッファシステムを導入し、化学および洗剤の適合範囲を含む最近の進歩は、アッセイの品質を高め、より再現性と予測可能な結果を生み出しました。現在、同じメーカーの新しいコンボアナライザーは、化学発光と蛍光共役抗体で標識されたサンプルを同じ実行で分析する機能を備えています。この新機能により、2つの個別のプレートを連続して実行する必要がなくなり、実行間の変動が排除されます。
アッセイプレートは、周囲温度で保存する必要があります。アッセイプレートを4°Cの冷蔵庫に保管するように選択した場合、プレートはアッセイの前夜に取り出し、周囲温度に持ち込む必要があります。誤ってサンプルウェルをロードした場合は、適切なサンプルを追加する前に、キットに用意されたバッファで広範囲に洗浄(4~5回)する必要があります。各一次抗体および生物学的サンプルはユニークです。したがって、抗体/タンパク質の最適化は、生物学的液体中の標的タンパク質のサンプルを分析する前に行う必要があります。
ここでは、一次抗体インキュベーション時間をデフォルトで30分間設定した。シグナルが弱い場合、ユーザは、蛍光シグナルバーンアウトなしで所望のシグナル強度に達するまで、一次抗体インキュベーション時間を増加することを検討する必要があります。ヒト血小板の場合、患者からのプールされたサンプルを調製し、最適化アッセイに使用した。サンプルプーリングは、標的生体分子間の変動をより良く表す。CEIには、総ライセートまたは総ホモジネートではなく、明確な上清を使用することをお勧めします。
血小板全体のライセート混合物中の高濃度のタンパク質は、シグナル対ノイズ比を低下させる可能性があります(図2)。これは、一次抗体結合に悪影響を及ぼすため、サンプルの繰り返し凍結解凍サイクルは避けるべきです。いくつかの試薬はCEI29と互換性がないため、ライセートバッファーの成分は重要です。サンプル調製前に、メーカーのウェブサイトに用意されている互換性のある試薬のリストをクロスチェックすることをお勧めします。これは、サンプル調製のための高いストリンジェンシー条件を許容しないシステムの制限である。個々のサンプルを分析するためにプールされたサンプルを使用してアッセイランパラメータ(すなわち、一次抗体希釈、タンパク質濃度、一次抗体インキュベーション時間など)を最適化することをお勧めします。

ここで説明するCEIの全体的な目標は、ヒト血小板中の標的タンパク質を分析するための更新された段階的プロトコルを提供することです。血液型シグネチャー分子の割り当ては、アルツハイマー病(AD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭葉などのヒト神経変性疾患におけるバイオマーカー開発の分野における最も重要な課題の1つです。変性症(FTLD)、パーキンソン病(PD)、封入体筋炎(IBM)、およびその他のタンパク質凝集関連病理状態。多くの干渉剤を用いて大量の血液中のこのようなシグネチャータンパク質の微量の検出は課題である。従って、特異性、感度、多数のサンプルを扱う能力、および選択された方法の再現性が重要である。
ヒト血小板は、神経変性疾患の潜在的なバイオマーカータンパク質を同定し、割り当てるミリューとして機能することができます。血小板は、神経細胞1、2、3のいくつかの特徴を反映する代理一次細胞モデルとして機能する機会を提供します。血小板をバイオマーカー候補タンパク質およびその化学誘導体を分析する好ましい手段の1つにする特定の特徴があります。第一に、血小板は、ドナー(すなわち、静脈穿刺)から血液を採取することによって、またはコミュニティの血液バンクから大量に血液を採取することによって、より侵襲性の低いアプローチを使用して容易に獲得することができる。第二に、血小板は、最小限の設備の実験室4、5で最小限の準備作業で全血から容易に分離することができます。第三に、血小板は核を持たない。したがって、それらは転写調節なしに代謝の変化を研究する良いモデル細胞である。第4に、血小板の生体分子含有量がカプセル化される。したがって、血小板マイクロ環境は、血清干渉物質(すなわちプロテアーゼ)からその内容物を保護する。第5に、血小板富化血漿は代謝活性を失うことなく7~8日間室温で貯蔵することができる。したがって、血小板は、外部因子を最小化し、制御する作業モデルを提供します。
免疫ブロット法(例えば、ウェスタンブロッティング)および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの従来の免疫測定法は、特定のタンパク質分析においてより広く使用されています。ただし、これらの 2 つの方法には、複数のアッセイ手順、有害な化学物質および試薬の要件、大きなサンプル サイズ、アッセイの再現性に関する問題、およびデータ変動の実行に関する問題など、いくつかの欠点があります。これらは、より少ないステップでより簡単で、比較的短期間で達成可能な方法の開発を促しました。古典的なウェスタンブロット法は依然として一般的な実験方法であるが、その多段階手順、供給、有毒廃棄物(すなわち、アクリルアミド、メタノールなど)およびアッセイ時間は、ハイスループット定量を行う際には望ましくなくなってきているタンパク質分析。
自動化されたCEIアプローチは、ハイスループットタンパク質アッセイ6を行うラボのための選択の方法になりつつあります。CEIはゲル、ゲル電気泳動装置、膜、電気泳動および電気伝達装置、およびより多くの物理的な取り扱いの関与のための必要性を除去する。適切に設計されている場合、CEIアッセイは、定量的なデータ分析、公表品質のエレクトロフェログラム、統計分析を用いたグラフなど、約3.5時間以内に完了する必要があります。CEI システムのもう 1 つの優れた優位性は、10x–20x 少ないタンパク質濃度の要件であり、臨床試験 7、8で使用されるヒトサンプルでの使用に最適です。
CEIの最も重要な部分は、異なるベンダーから購入した抗体の種類、抗体の種類(モノクローナル対ポリクローナル)、最適なタンパク質濃度、サンプル調製、試料変性温度、およびキャピラリーに適用される電気泳動電圧のアッセイ条件を最適化することです。新しいアッセイの前に実装する必要があるCEIの単一アッセイ形式の最適化方法を開発し、時間とリソースを節約しました。この最適化ステップの後、トランス活性化応答DNA/RNA結合タンパク質(TARDP)の総リン酸化誘導体とリン酸化誘導体の両方の自動定量評価が行われます。そのサイズ(43 kDa)により、頭字語のTDP-43はこの論文全体で使用されます。ここで、ALS患者から得られたヒト血小板ライセート中のTDP-43タンパク質は、予測リン酸化値(PPV)を潜在的な予後バイオマーカーとして開発するのに役立つ評価を行う。
TDP-43は、ALSの新しい潜在的な疾患バイオマーカー候補である。TDP-43は全ての有核細胞における全存在タンパク質である;したがって、様々な正常な細胞イベント中および神経変性疾患におけるTDP-43の機能は、9、10、11、12、13、14で調べられてきた。TDP-43は核タンパク質15であるが、核局在配列及び核輸出配列16、17、18、19の存在に起因して核と細胞質の間を往復する能力を有する。細胞質TDP-43は、mRNAの安定性や輸送、ストレス応答、ミトコンドリア機能、オートファゴソーム20などの様々な細胞イベントに関与している。しかしながら、神経変性疾患21の病因に関与するTDP-43のリン酸化誘導体の役割については、あまり知られていない。
このプロトコルは、CEIアプローチを用いてTDP-43およびその血小板中のリン酸化誘導体の内容物を分析するためにアッセイ条件を最適化する方法を示しています。リン酸化されたTDP-43は市販されていないので、ALS患者におけるTDP-43プロファイルを評価するために予測リン酸化値(PPV)を用いることが提案されている。このCEIシステムは、少量のサンプル混合物(キャピラリーあたり2.5~3.0 μL)を使用します。アッセイの総音量設定は、製造業者のプロトコルに基づいてキャピラリーあたり8.0 μLです。したがって、研究者は2つの別々の実行のために1つのサンプル混合物調製を利用することができます。メーカーは、完全に排除されていない場合でも、ピペットエラーが最小限に抑えるようにアッセイプロトコルを設計しました。24個のヒト血小板ライセートサンプル混合物を半量(すなわち、サンプル当たり2.5~3.0 μL)に分割し、~7時間以内に2種類の抗体によって連続的に分析した。ここで説明するCEIシステムは、望ましい高スループットアッセイモダリティを提供する。ユーザーは、大規模なスクリーニングを行う前に、さまざまなベンダーからの抗体と標的タンパク質のサンプル調製モダリティをテストする必要があります。

<table><tbody><tr><td>12-230 kDa分離キット</td><td>ProteinSimple</td><td>SM-W004</td><td>充填済みアッセイプレートと25チャンネルキャピラリーカートリッジを含む</td></tr><tr><td>3000G サーモサイクラー</td><td>Techne</td><td>FTC3G/02</td><td>サンプルミックスの加熱にこのサーモサイクサーを使用し</td></tr>ました <tr><td>アンチマウス検出キット</td><td>ProteinSimple</td><td>042-205</td><td>HRP標識二次抗体、バッファー、ルミノール試薬、分子量マーカーが含まれています</td></tr><tr><td>アンチP(S409-410) TDP-43</td>抗体 <td>プロテインテック</td><td>22309-1-AP</td><td>リン酸化TDP-43を認識する一次抗体</td></tr><tr><td>アンチP(S409-412) TDP-43抗体</td><td>コスモバイオ-US</td><td>TIP-PTD-P02</td><td>リン酸化TDP-43を認識する一次抗体</td></tr><tr><td>アンチウサギ検出キット</td><td>プロテインシンプル</td><td>DM-001</td><td>HRP標識二次抗体、バッファー、ルミノール試薬、分子量を含むマーカー</td></tr><tr><td>抗TDP-43 (pan) 抗体</td><td>ProteinTech</td><td>10782-2-AP</td><td>TDP-43 タンパク質全体を認識する一次抗体</td></tr><tr><td>Compass for SimpleWestern (SW)</td><td>ProteinSimple</td><td>Ver.4.0.0.</td><td>Compass for SWは、SimpleWestern機器用の制御およびデータ解析アプリケーションです</td></tr><tr><td>ソニック・ディメンブレーター;モデル100</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>ソニケーター。細胞膜を破裂させるために使用されます。このモデルは生産終了です(モデルXL2000-350)</td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>22625004</td><td>モデル# 5810 スイングプレート付き バケット</td></tr><tr><td>Wesアナライザー</td><td>ProteinSimple</td><td>55892-WS-2203</td><td>キャピラリーゲル電気泳動を行います</td></tr></tbody></table>

ヒト血小板における筋萎縮性側索硬化症の潜在的バイオマーカーを探索するためのキャピラリー電気泳動免疫学的研究法の使用

Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets

キャピラリー・ウェスタン技術としても知られるキャピラリー電気泳動免疫測定法(CEI)は、臨床試験における疾患関連タンパク質および薬物のスクリーニング方法になりつつあります。再現性、感度、小さいサンプル容量要件、同じサンプルにおける複数のタンパク質標識に対する多重抗体、最大24個のサンプルを分析する自動ハイスループット能力、および短時間の要件によりCEI古典的なウェスタンブロット免疫測定法よりも有利である。この方法には、勾配ゲルを利用できない(4%~20%)など、いくつかの制限があります。マトリックス、未精製の生物学的サンプルを有する高い背景、および個々の試薬の商業的利用不能。本論文では、複数のアッセイ設定でCEIを実行する効率的な方法、1つのアッセイプレートにおけるタンパク質濃度と一次抗体滴定を最適化し、サンプル調製のための使いやすいテンプレートを提供する方法について説明する。また、血液ベースのバイオマーカー開発における神経変性疾患の一環として、血小板リセートサイトゾル中のパンTDP-43およびリン酸化TDP-43誘導体を測定する方法も記載されている。

血小板細胞質タンパク質濃度の最適化と一次抗体滴定 シグナルの変化は血小板細胞質のタンパク質の変化に直接比例するため、血小板細胞質タンパク質の線形ダイナミックレンジを確立することが重要です。アッセイで血小板ライセート混合物全体を使用すると、標的タンパク質(TDP-43およびP(S409-412)TDP-43)のシグナル強度が低下し、高いバックグラウンドシグナルに寄与する可能性があります。したがって、このアッセイでは、血小板破裂後に透明上清(細胞性画分)を使用した(図2)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig02v2.jpg"> 図2:信号の明瞭さは、サンプルの品質に依存します。(A) 血小板全体のライセートホモジネートは抗TDP-43抗体結合を妨害する。したがって、騒がしいエレクトロフェログラムが観察された。(B)血小板細胞分離分は、全体のライセートを遠心分離(16,000 x g 30分間)に供することから得られた。ほとんどの膜タンパク質は除去された。それゆえ、TDP-43タンパク質に対する抗TDP-43抗体結合が増強された(青色線トレース)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig2alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
血小板細胞質タンパク質濃度の線形動的範囲は0.2~0.8 mg/mLで確立した。タンパク質濃度と一次抗体滴定の両方を1つのアッセイで行うことができるように、アッセイテンプレートを採用しました(図3)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig03v2.jpg"> 図3:血小板細胞質タンパク質濃度の線形ダイナミックレンジ(A) タンパク質濃度と抗体滴定は、同じ走行中に1つのプレートに最適化した。(B) タンパク質の線形働き範囲(0.2~0.8 mg/mL)を確立しました。0.5 mg/mLタンパク質負荷を陽性対照としてa-ERK抗体によって標識した(キャピラリー25)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig3alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
なお、試料調製管中のグリセロール含有量は20%未満(最終)でなければならないが、そうでなければ高いグリセロール濃度は一次抗体結合に悪影響を及ぼす。
最適な露光時間の決定 ソフトウェアの古いバージョンでは、最適な露光時間は、タンパク質濃度(mg/mL)に対してピーク領域をプロットすることによって決定する必要がありました。新しいバージョンでは、ハイ ダイナミック レンジ (HDR) 検出プロファイルという新しいツールが提供されます (図 4)。画像パネルを使用して、すべての露光時間(すなわち、5s、15s、30s、60s、120s、240 s、480 s)を一緒に表示するオプションを提供しました。コンピュータソフトウェアは、すべての暴露時間を分析し、自動的に最良の暴露時間(HDR)を特定しました。HDR検出プロファイルはCEIの感度が高いため、ダイナミックレンジが大幅に広がっており、より大きなサンプル濃度範囲でより優れた検出と定量を実現します。しかし、ユーザーは、実験目標を満たす露出時間を選択するオプションをまだ持っています。この特徴を用いて、TDP-43タンパク質に対して最適な露光時間が見られた。ピークは最適な露光時間を表します(図4A)。1~512 s(図4B)の範囲で全9回の露光時間を確認した後、この抗体に対して単一の暴露時間(4s)を定義した。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig04v2.jpg"> 図4:標的タンパク質に対する高ダイナミックレンジ(HDR)検出プロファイル(A)TDP-43タンパク質ピークは、標的タンパク質に対する最適な露光時間を表す。a-TDP-43 Ab滴定は1:300であり、血小板細胞質タンパク質濃度は0.5mg/mLであった。ソフトウェア定義の青い線は、最適な露光時間を示します。(B) この図は、1~ 512 s の範囲の 9 回の露出時間をすべて確認した後のユーザー定義の単一露光時間 (4 s) を表します<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig4alarge.jpg" target="_blank">。</a>
ALS患者のヒト血小板細胞質におけるTDP-43レベル 血液ベースバイオマーカーの開発を行った。最適化されたアッセイ条件を用いて、ALS患者から得られた血小板ライセート細胞質画分を2組の抗体を用いて分析した(すなわち、抗TDP-43[Pan]抗体、TDP-43タンパク質のリン酸化誘導体を認識する抗体;ここで、A-P[S409/410-2]TDP-43を用いた)。このデモンストレーションでは、疾患特異的TDP-43およびそのリン酸化誘導体を提示します(図5)。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig5a.jpg"> 図5:TDP-43の予測リン酸化値(PPV)の表現。リン酸化されたTDP-43とパンTDP-43の絶対量は、ALSと対照群との間に大きな差を示さなかった。しかし、PPVはALSコホートのわずかな増加を示したが、被験者数が不足しているため2つの群の間に統計的な差はなかったが(ALS=25、対照=27)。ALSと対照群の手段との間の低いCohenのd値は、小さいサンプルサイズのために2つの群間の低い効果サイズを示した(制御=25、ALS=27)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig5alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
合計TDP-43を較正曲線を用いて定量した(図6)
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig06v2.jpg"> 図6:標準キャリブレーション曲線市販の組換えTDP-43タンパク質濃度を用い、標準的な曲線を構築した。各データは、3 つ平均を表します。タンパク質バンド強度は濃度依存性(インセット)であった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig6alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
リン酸化TDP-43タンパク質の定量は、このタンパク質の商業的に利用できないことにより不可能であった。その代わりに、TDP-43のリン酸化種の割合を定義する予測リン酸化値(PPV)が確立された。PPVは、以下の式を用いて同一サンプルについて2つのシーケンシャルCEIアッセイから決定した。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60638/60638equ01B.jpg">
プールされたヒトALS血小板細胞分裂画における変動性のイントラおよびインターランアッセイを試験した(図7)
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60638/60638fig07v2.jpg"> 図7:アッセイのバリエーション。(A) 同じサンプルを搭載した2本の毛細管をCEIで分析し、実行内アッセイの変動をCV%=14.9と計算した。(B) 同じサンプルを3つの異なるアッセイ日および3つの異なるアッセイランで分析した。ラン間アッセイの変動は、CV% = 18.7と計算した。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60638/60638fig7alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ラン内(キャピラリーからキャピラリーへの変動)係数の変動値は許容範囲(CV%= 14.9)に低下しましたが、ラン間アッセイ値は比較的高かった(CV%= 18.7)。この変動は、キャピラリーカートリッジと異なるロットのサンプルプレートを使用しているためであると解釈されます。再現性の調査は、同じロット番号を持つ CEI コンポーネントで実行することをお勧めします。
表1:CEIアッセイプレートローディングテンプレート<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60638/Table_1_Wes_Assay_Layout_single_sheet.xlsx" target="_blank">こちらをクリックして、このテーブルをダウンロードしてください。</a>
表 2: インタラクティブなサンプル混合物調製テンプレート。未知のサンプルからストックタンパク質濃度を入力した後、インタラクティブ細胞は、サンプルミックスを調製するために使用する必要がある量を自動的に計算します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60638/Table_2_Wes_Assay_Sample_mix_preparation_template_UD.xlsx" target="_blank">こちらをクリックして、このテーブルをダウンロードしてください。</a>

大規模な臨床研究を実施するためには、神経変性疾患の血液ベースのバイオマーカーが不可欠です。信頼性と検証済みの血液検査は、少量のサンプル量を必要とするだけでなく、より低侵襲のサンプリング方法、手頃な価格、再現性が必要です。本論文は、ハイスループットキャピラリー電気泳動免疫アッセイが、潜在的なバイオマーカー開発の基準を満たしていることを実証する。

Capillary electrophoresis immunoassay (CEI), also known as capillary western technology, is becoming a method of choice for screening disease relevant ...

このプロトコルは、単一のアッセイプレート内のタンパク質および一次抗体濃度の両方を最適化し、単一のサンプル調製物を使用して2つのアッセイを実行するために使用できます。この技術の主な利点は、データ分析を含む2 1/2日のラボ作業を3時間半で完了できることです。この技術は、ALS用の血液ベースのバイオマーカーを開発するための高スループットアッセイフォーマットを提供し、大規模な臨床試験を行うための理想的な方法です。この方法は、疾患予後の間に標的タンパク質プロファイルに関する洞察を提供し、興味深い臨床試験の薬物の効果の監視を容易にすることができる。ALS患者および健康な被験者から100マイクロリットルのヒト血小板ライセートを採取した後、毛細管レイアウトおよびサンプル調製のための社内生成テンプレートを記入してください。サンプル混合調製表は動的であり、ソースから削除するボリュームの量を自動的に計算します。すべてのアッセイ試薬を氷の上に置きます。室温に残る必要があります標準パックを除く。蛍光マスターミックスを調製するには、DTTの透明なチューブに40マイクロリットルの脱イオン水を加え、20マイクロリットルの10倍サンプルバッファーを加えます。そして、調製された400ミリモルDTT溶液の20マイクロリットルを、アッセイキットからピンクのチューブに。ビオチン化された梯子を準備するために、16マイクロリットルの脱イオン水、10Xサンプルバッファーの2マイクロリットルおよび準備された400ミリモルDTT溶液の2マイクロリットルをキットに提供される白い管に加える。穏やかな混合の後、ラダー溶液を変性前に200マイクロリットルのPCRチューブに移します。氷の上にチューブを置く前に、10Xサンプルバッファーの1.5マイクロリットルと148.5マイクロイオン水を600マイクロ遠心チューブと渦に加え、混合します。目的の抗体を直接、表に示されているように希釈剤に加え、ピペットチップを同種の抗体溶液で複数回洗い流します。キャピラリーサンプルミックスを調製するには、すべてのPCRチューブを開き、逆ピペット法を使用して表に示されているように、蛍光5Xサンプルバッファーの1.6マイクロリットルのアリコートを各チューブに加えます。バッファーが追加されると、各チューブを直ちに閉じます。すべてのバッファーが追加されたら、すべてのチューブを開き、表に示されているように、ボリュームに 0.1X サンプル バッファーを追加し、バッファーが追加されると、各チューブをすぐに閉じます。次に、すべてのチューブを開き、表に示されているようにタンパク質サンプルを追加し、各チューブキャップをすぐに閉じます。すべてのサンプルを追加したら、ベンチトップ遠心分離機のチューブをすべて簡単に遠心分離します。再び試料を混合し、遠心分離する渦。2回目の遠心分離の終わりに、すべてのチューブを熱い蓋をしたサーモサイクラーに入れます。そして、示された条件下でサンプルを変性する。変性の終わりに、遠心分離機、ミックス、遠心分離を再びサンプルを混合し、氷の上のチューブラックにすべてのチューブを配置します。図をガイドとして使用し、ストレプトアビジン・ワサビペルオキシダーゼを10マイクロリットルウェルD1に加え、 ウェルD2からD5までの適切な二次抗体の10マイクロリットル、行Bの各ウェルに10マイクロリットルの抗体希釈液、およびウェルC1、ウェルC2からC25に適切な一次抗体の10マイクロリットル、PCRチューブ番号1からよくA1へのビオチン化ラダーの5マイクロリットル、A2からA25までの3マイクロリットルのサンプルと、正しい順序で小さな井戸にサンプルミックスと試薬をピペット処理する各ウェルに、作製したルミノール過酸化物の15マイクロリットルは、実験の成功に不可欠であるため、非常に慎重に行う必要があります。その後、指定された各洗浄バッファーに500マイクロリットルの洗浄バッファーを追加します。そして、遠心分離によってプレートの内容物をスピンダウン。アッセイプレートでキャピラリー解析を実行するには、キャピラリーアナライザをオンラインシステムに接続し、アナライザーソフトウェアで[計測器と接続]をクリックします。ポップアップメニューから計測器のシリアル番号を選択し、「接続」をクリックします。アッセイタブを選択し、新規アッセイを選択し、アッセイパラメータを入力してファイル名と場所を保存します。次に、アナライザーの点滅する青色インジケータが青で点灯していることを確認し、キャピラリーカートリッジをパッケージから取り外します。アッセイプレートから保護シールを取り外し、気泡の事前充填されたウェルを目視で観察します。プレートホルダにアッセイプレートを置き、キャピラリーカートリッジを斜めに保持し、カートリッジをキャピラリースロットに挿入し、アナライザドアを閉めます。次に、アナライザー ソフトウェアで [開始] をクリックします。アッセイで血小板リセート混合物全体を使用すると、標的タンパク質のシグナル強度を低下させ、高いバックグラウンドシグナルに寄与する可能性があります。従って、本アッセイでは、血小板を破裂させた後に透明上清を用いた。血小板サイトゾルタンパク質濃度の線形ダイナミックレンジを1ミリリットル当たり0.2~0.8ミリグラムに確立し、タンパク質濃度と一次抗体の滴定の両方を単一のアッセイで行うことができるように作文テンプレートを採用した。高ダイナミックレンジ検出プロファイルは、キャピラリーアッセイの感度が高いため、大幅に広いダイナミックレンジを提供し、より大きなサンプル濃度範囲に対するより良い検出と定量をもたらします。個々の露光時間も定義できます。最適化アッセイ条件を用いて、2組の抗体を用いてALS患者から得られた血小板ライセート細胞種画分のこの分析により、疾患特異的TDP-43とそのリン酸化誘導体をサンプル内で同定することができます。その後、合計TDP-43をキャリブレーション曲線を使用して定量化することができます。そして、イントラアッセイおよびインターランアッセイ変動性を、プールされたヒトALS血小板細胞体画分で試験した。この方法により、一次抗体を使用することができ、1回のアッセイで同じサンプル内で最大5つの異なる標的タンパク質の同定が容易になります。この技術はタンパク質分析時間を大幅に短縮するだけでなく、マイクロリットルのサンプル量を必要とし、高度な再現性を持つ結果を生成します。このアッセイで使用される化学物質の一部とすべてのヒトサンプルは、生物的危険であると考えられるので、これらの実験を行う際には、適切な個人用保護具を常に使用する必要があります。

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