Name: 構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶ 構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験アルゴリズム。全ゲノムバイオシーケンスと免疫不全マウスを用いた薬剤有効性検証法。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

メイヨークリニック個人医学センター(CIM)のリン・ヤン博士とフェイ・R・ハリスさん(MS)のメンバーに、実験の支援をいただきありがとうございます。この作品は、ニール・E・エックルズ夫妻のメイヨー個別医療センターへの贈り物によって支えられました。

卵巣癌の同意された患者からの新鮮な組織は、メイヨークリニック機関審査委員会(IRB)によって承認されたプロトコルに従って、脱バルク手術の時点で収集されました。このプロトコルで使用されるすべての動物の手順と治療は、メイヨークリニックの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認され、動物ケアガイドラインに従いました。
1. 合致ペアのシーケンシングと解析
注: 新鮮な組織またはフラッシュ凍結組織は、メイトペア(MPseq)シーケンシングに使用する必要があります。パラフィン埋め込み材料は、断片化したDNAを含むため、適さない。
<ol><li>凍結腫瘍組織からDNAを分離する。外科材料または生検36から得られる元のヒト標本を使用する。</li>
	<li>1000 ng の DNA を使用して、次世代シーケンサー上のレーン当たり 2 サンプルとして MPEQ ライブラリとシーケンスを作成します (材料表を参照)36。</li>
	<li>上記の36,37,37のように大きな染色体収差(欠失、挿入、増幅、反転および転座)を検出するための一連のアルゴリズムを用いてデータを分析する。</li>
</ol>2. 治療対象の選択
<ol><li>オープンアクセスパンダツール(パスウェイと注釈)または類似のツールを使用して、ターゲット可能な変更(http://bioinformaticstools.mayo.edu/Panda)を識別します。<ol>
<li>MSeqによって変更された遺伝子のリストを、標準の受け入れられた遺伝子シンボルを使用して、単純なタブ区切りファイルとして作成します。 注: 含まれているサンプルは、増幅とゲインの分析を特徴としています。</li>
		<li>リストのヘッダー行に「#」記号を追加して、テーブルヘッダーがソフトウェアの経路レベルビューに転送されるようにします。</li>
		<li>[アノテーションセットのアップロード] ナビゲーション タブをクリックして、ファイルをアップロードします。</li>
		<li>メニューから 1 つのアイコンを割り当てて、目的のアイコンをクリックし、[確定] タブをクリックして、基になるデータを表します。</li>
		<li>アノテーション ファイルがアップロードされた後、経路ごとの注釈付き遺伝子数を表示する列を特定します。これは、右側の最後の列です。</li>
		<li>メインウィンドウの左上にある経路フィルタを使用して、目的の遺伝子を含む経路を表示します。</li>
		<li>偶然に予想されるよりも多くのアコード化された遺伝子を持つ経路を特定する。[エンリッチメント] タブの下にある関数を使用します。</li>
		<li>メインウィンドウの左側にある適切なアイコン(例えば、DGIdb、PharmGKB)をチェックして、事前設定アノテーションから潜在的に薬物性の可能性のある遺伝子を表示するデータベースを選択します。</li>
		<li>[経路ビューア] ページに表示される名前をクリックして、視覚化する経路を選択します。 注: 各アノテーションセットを表すアイコンは、関連するジーンの横に表示されます。対象の遺伝子をクリックして、対応するGeneCardsウェブページを開きます。</li>
		<li>関心のある遺伝子(つまり、特定の腫瘍で変化した)とさらなる分析のための潜在的な薬物の「ヒット」を示した経路を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>臨床応用(https://clinicaltrials.gov/)に承認された薬剤を含むデータベースを使用して、同定された標的を相互参照する。</li>
	<li>特定のタイプの腫瘍の生物学との関連性を確認するために文献レビュー(例えば、PubMed)を行うことによって、PDXモデルのさらなるテストのためのターゲット可能な変化を優先する。</li>
</ol>PCRとサンガーシーケンシングによるゲノム再配列の検証
<ol><li>MpPseqデータから取得したシーケンシング読み取りを使用してプライマーを設計します。<ol>
<li>MPseq分析に基づいて、検証の対象となる接合部(すなわち、潜在的な治療目標)を選択します。</li>
		<li>アンプリコンが接合を含むような方向にプライマーを設計します。ジャンクションの両側に2つのプライマーを設計し、合計4で、ジャンクションを増幅する可能性を高めます。 注:ケースと染色体の位置に応じてプライマーに名前を付けます。</li>
		<li>プライマー設計および選択したソフトウェアには、標準 PCR パラメータを使用します。溶解温度(60~62°C)とGC含有量(40~60%)を選択します。プライマーシーケンスがプライマーダイマー、パリンドローム、ヘアピンループを形成していないことを確認します。</li>
		<li>プライマー配列がBLAT(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start)を用いて確認することで、ヒトゲノムの他の領域に対する相同性を欠いていることを確認する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR を実行して、対象の接合部を増幅します。<ol>
<li>水でプライマーを10 mMに希釈し、各プライマーの10 mLを組み合わせて、各フォワードプライマーと各リバースプライマーをプライマーミックスに組み合わせます。 注: 選択した例のプライマーのシーケンスを表1に示します。</li>
		<li>ラベル0.2 mLストリップチューブとして:C1、T1、C2、T2、C3、T3、C4およびT4、C=対照ヒトゲノムDNA(商業)、T=腫瘍DNA、患者またはPDX腫瘍から単離された、および数はプライマーミックスを示す。</li>
		<li>各プライマーミックスの1 mLをラベル付きチューブに加えます。</li>
		<li>表2に記載されている試薬を組み合わせて、必要になるまでフリーザーに酵素を残し、最後の最後にミックスに加えてTaqマスターミックスを準備します。</li>
		<li>各テンプレートDNAに1つずつ、2つのマスターミックスを作り、ヒトDNAと腫瘍DNAを制御する。それぞれのストリップチューブに各Taqマスターミックスの24 mLを追加します。総反応量は25mLです。渦は非常に簡単に、その後、ストリップチューブを下に回転させます。</li>
		<li>サーモサイクラーで PCR を実行します。表 3 に示すパラメーターを使用します。アニーリング温度を、プライマーの溶融温度より少なくとも1°C寒くなるように調整します。</li>
		<li>完成したPCR製品を-20°C(長期)または4°C(短期間)で必要になるまで冷蔵保存してください。</li>
		<li>1-5 V/cmで電気泳動を行い、1.5%アガロースゲルを使用してPCR産物を可視化します。サンガーシーケンシングに使用する製品の2 mLアリコートを残します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンガーシーケンシングを実行してジャンクションを確認し、正確なブレークポイント38を特定します。<ol>
<li>PCR が単一の製品(バンド)を生成した場合は、PCR 産物を使用します。あるいは、バンドをゲルから切り出し、増幅に使用されるプライマーと一緒にサンガーシーケンシングのために精製して提出します。 注:ゲノム解析を行った腫瘍は、マウスの移植に使用されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 腫瘍の生着と維持
<ol><li>PDXマウスモデルに腫瘍を生着させる準備を設定する。ゲノム解析が行われる、または行われた生着腫瘍を選択します。<ol>
<li>専用の研究所や動物施設、熟練した技術スタッフ、詳細な標準的な運用手順など、PDXモデルの開発開始時に、支援インフラストラクチャが整っていることを確認してください。</li>
		<li>細胞の生存率と成功した生着のためには、迅速な輸送と試料の処理を確保します。</li>
		<li>滅菌環境を使用して、標本の処理および生着のための細菌および真菌汚染を低減します。</li>
		<li>血液媒介病原体を収容する可能性があるため、生体有害物質に関する制度上の方針に従って、ヒトの標本を注意深く扱う。</li>
		<li>手術標本を20 mLの組織培養培地で冷やされた50 mLチューブに入れて、生着のために組織(0.5-0.7 cm3の大きさ)を準備します。 注:腫瘍組織は新鮮であるか、以前凍結保存材料5から回復することができます。</li>
		<li>病理医に相談して検体中の腫瘍の内容を確認する。</li>
		<li>腫瘍組織を10〜15mLの冷たいPBSを含む皿に入れるか、または抗生物質を含むRPMI 1640またはDMEMなどの組織培養培地(1%ペニシリンおよびストレプトマイシン)を含む。</li>
		<li>病理学者の助けを借りて、隣接する正常および壊死組織から生存可能な腫瘍材料を同定し、単離する。生殖不能鉗子およびメスを使用して、病理学者によって指摘された壊死性物質を除去する。 注:腫瘍は、腹腔内または皮下のいずれかにマウスに移植することができます。ステップ4.2に従って腹腔内移植を行うか、またはステップ4.3にスキップして皮下の生着を行う。本研究では、ゲノム解析に基づいて選択された標的療法を、腹腔内移植を伴う高等漿性卵巣癌の一連のPDXモデルで試験された。</li>
	</ol></li>
	<li>滅菌鉗子で組織をミンチし、氷の上にメスを注入する腹腔内(IP)移植のための組織を準備し、約1〜1.5mm3の大きさの部分を作り、冷たい培養培地と混合します。16-17ゲージ針を使用して、0.3~0.5 mLの腫瘍スラリーを注入します。 注:すべての外科手術は無菌技術を使用して行われます。滅菌手袋、滅菌器具、消耗品、および埋め込み材料を使用して、感染の可能性を低減した。<ol>
<li>1:1を氷冷培養培地と混合し、少なくとも3匹の雌SCIDマウスに腹腔内100mLを注入する。</li>
	</ol></li>
	<li>滅菌鉗子、メス、または外科用はさみを使用して皮下生着のために腫瘍組織を小さな断片(約2 x 2 x 2 mmの大きさ)に切り、断片化した組織を氷の上の冷蔵ペトリ皿に移します。<ol>
<li>断片化した組織(組織10個あたり約200mL)を含む冷たい基体膜マトリックスを皿に加え、よく混ぜ合わせ、組織断片を冷たい基体膜マトリックスに10分間浸します。</li>
		<li>5匹の雌のNOD/SCIDマウスを麻酔して、生着のためにそれらを準備する。</li>
		<li>各マウスをケタミン(150mg/kg)とキシラジン(10mg/kg)の組み合わせで腹腔内に注入する。</li>
		<li>マウスが外傷性鉗子で尾先をつまんで適切に麻酔されていることを確認します。</li>
		<li>チャンバーから静かに完全に麻酔をかけられたマウスを取り出し、気化器からの入力と廃ガス清掃システムからの出力を持つノーズコーンをマウスに置きます。</li>
		<li>麻酔下で乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を置きます。手術が行われる領域を準備します。無菌技術を使用して手術を行います。</li>
		<li>手術が行われる表面が非多孔質で密封され、手術前に汚染されていることを確認してください。</li>
		<li>滅菌(オートクレーブ、ガスまたは化学滅菌による)器具で手術を開始します。</li>
		<li>手袋を使用して器具を扱い、手術ステップ間のエタノールに浸すことによって、手順全体にわたって器械の先端の無菌性を維持する。</li>
	</ol></li>
	<li>ヨウ素とアルコールの3つの交互のスクラブを適用することによって、外科部位を殺菌する。無菌の外科用ハサミと鉗子を使用して、マウスの両側面に5〜10mm垂直皮膚切開を行います。<ol>
<li>ストレート鉗子を皮下空間にそっと挿入して、脂肪パッドの下に腫瘍片を置くのに十分な大きさのポケットを作ります。</li>
		<li>滅菌ストレート鉗子を使用して、5匹のマウスのそれぞれで以前に準備されたポケットに腫瘍断片を挿入する。 注:1つのポケットに腫瘍組織の3〜4個を置きます。</li>
		<li>組織接着剤を使用して皮膚切開を閉じます。</li>
		<li>リンパ球増殖を阻害するために、注入後に100mLのリツキシマブを各マウスに腹腔内注入する。</li>
	</ol></li>
	<li>麻酔から回復するまで、約20分間、ヒートランプの下のケージにマウスを入れます。マウスのバイタルサインを監視し、十分な水分補給を確認します。</li>
	<li>麻酔から回復し、食べ物と水を持ち始めた後、マウスを他のマウスの会社に戻します。制度上のガイドラインに従って、術後のケアとモニタリングを行います。手術後3日間連続して、毎日痛みや苦痛の兆候がないか確認してください。 注:痛みや苦痛の基準には、壊死または潰瘍、体重減少/身体状態のスコアリング、活動レベル、運動機能および姿勢などの行動徴候が含まれる。</li>
	<li>腫瘍がキャリパーで測定された直径0.5cmに達するまで、マウスの腫瘍形成を隔週で定期的にチェックする。</li>
	<li>各マウスの健康スコアを、外観、行動、および身体状態39から派生したものとして評価する。二酸化炭素吸入によって犠牲になるモリバンドマウスの基準として≤6のスコアを使用してください。</li>
</ol>5. PDXモデルにおける一体的に同定されたターゲットに対する応答のテスト
<ol><li>腫瘍が触知可能で、超音波スキャンで測定された0.5 cm3に達したときに、選択された標的治療を開始する。<ol>
<li>腹部の超音波スキャンを行う前に、マウス腹部の毛皮を除去し、無菌ゼリー潤滑剤を適用します。</li>
		<li>トランスデューサ付きの超音波機械を使用して、断面に位置する腫瘍の画像を取得します。各動物のセッションごとに3つの測定値を行い、腫瘍サイズのより正確な評価のための値を平均します。</li>
		<li>利用可能なソフトウェア40を使用して画像を分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>カルボプラチンの混合物からなる化学療法を投与 51 mg/kg とパクリタキセル 15 mg/kg 腹腔内(IP)で週に1回、4-6週間の全治療期間。射出の総容積が0.2 mLを超えないことを確認してください。</li>
	<li>30%シクロデキストリン(例えば、Captiol)でMK-220641ストック溶液を作り、4週連続で毎日120mg /kgの経口ギャージを介して送達します。</li>
	<li>マウスの頭と手足が固定化されるように、背中の皮膚をつまんで後ろに固定して、それを保持することによって経口ギャバジのためにマウスを準備します。<ol>
<li>プローブが食道に到達するまで、マウスの喉の後ろにガビンプローブを挿入します。マウスの肺が穿穿して死を引き起こす可能性があるため、プローブがあまり遠くに挿入されないようにしてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>25 mg/mL で、MK-866942ストック溶液をエタノールに入れてください。5.2% Tween 80,5.2% PEG400 を含む車両で希釈し、10 mg/kg で 10 mg/kg で 1 週間おきに IP 注射用の無菌水を 4 週間の治療の全期間で行います。 注:マウスに注入される容積は、動物の体重に応じて50〜120mLでなければなりません。</li>
	<li>治療群ごとに7〜8匹のマウスを使用して、差43,44,44を検出するのに十分な統計的パワーを有する。</li>
	<li>毎日の治療でマウスの体重と一般的な状態を評価します。動物の体重が最初の体重から20%以上低下した場合、薬物を差し控える。</li>
	<li>超音波スキャンを使用して、毎週腫瘍のサイズを評価します。腫瘍の成長のモニタリングを行う個人が治療に盲目であることを確認して、応答の公平なスコアリングを確実に行います。 注:小規模な実験室は、治療と超音波モニタリングを管理するために2人の異なる人々を採用することができます。</li>
</ol>

著者らは、利益相反はないと宣言している。

我々は、検査のための最良の選択薬を決定するためにゲノムプロファイリングによって得られる腫瘍の分子特性を利用するPDXモデルで「臨床試験」を行うために使用したアプローチとプロトコルを説明する。現在、全ゲノムシーケンシング、RNAseq、カスタマイズされた遺伝子パネルを含む原発性腫瘍のゲノム特性解析には、複数のシーケンシングプラットフォームが使用されています。高品位の漿液性卵巣癌の場合、MPPeqは構造変化、DNA再構成およびコピー数の変化を同定し、このタイプの腫瘍において観察されるゲノム不安定性の高さのために特に有用である。MPseqプラットフォームの2つ目の利点は、ゲノム全体をカバーしていますが、他の包括的なシーケンシング技術よりも大幅にコストが低いということです。しかし、MPeqは、塩基性被覆率が十分ではなく、8〜10倍に達するため、点突然変異検出には適していない。腫瘍のゲノム特性解析に対してMpPeq単独を使用する限界の1つは、複雑なクラスター化染色体再調整の存在であり、その分析は、影響を受けた対象遺伝子の発現を予測しない。MPEqによって検出されたジャンクションは、フレームシフトまたはプロモーター領域の小さな欠失および挿入のために...

患者由来の異種移植片(PDXs)は、患者の腫瘍片を免疫不全マウスに移植して生成し、パーソナライズされた抗癌ケアを支援する強力な前臨床モデルとして登場した。PDXモデルは、さまざまなヒト悪性腫瘍のために開発に成功しています。これらには、乳癌および卵巣癌、悪性黒色腫、大腸癌、膵臓腺癌、および非小細胞肺癌11、2、3、4、52,3,4,5が含まれる。腫瘍組織は、異所性または異所性に移植することができる。前者は、より正確であるが技術的に困難であると考えられ、腫瘍起源の器官に直接移植することを含む。これらのタイプのモデルは、腫瘍,6,7の「自然」微小環境のために、元の腫瘍の組織学を正確に模倣すると考えられている。例えば、マウス卵巣のブルサへの異形性移植は、腹腔への腫瘍の播種および腹水の産生をもたらし、卵巣癌8の典型的な。同様に、腹部乳腺の代わりに胸部腫瘍を胸部に注入すると、PDXの成功率と行動9に影響を及した。しかし、直交性のモデルには、腫瘍の成長を監視するための高度なイメージングシステムが必要です。固形腫瘍の異所性移植は、典型的には、腫瘍の成長の容易なモニタリングを可能にし、より安価で時間のかかるマウスの皮下側面に組織を移植することによって行われる7。しかしながら、皮下に成長した腫瘍は、正交性移植10の場合に観察されたように転移することはほとんどありません。
生着の成功率は、腫瘍の種類によって異なり、大きく依存することが示されている。より高い割合の腫瘍細胞を含むより積極的な腫瘍および組織標本は、より良い成功率12,13,13を有することが報告された。これと一致して、転移部位に由来する腫瘍は50〜80%の頻度で生着することが示され、原発部位からの腫瘍は14%の低い頻度で生着する。対照的に、壊死細胞を含む組織は、生存可能な腫瘍細胞が少ないが、生着が悪い。腫瘍増殖はまた、元の腫瘍の特性を損なうことなくマウス14への注入時の組織ミックスに基膜マトリックスタンパク質を加えることによって促進することができる。移植を目的とした組織片の大きさと数は、生着の成功率に影響を与えることも判明した。より大きな腫瘍取り速度は、元の腫瘍間質を維持し、宿主間質細胞を提供するサブ腎嚢の能力による皮下移植と比較して、腎臓下のカプセルへの移植のために報告された。
ほとんどの研究は、NOD/SCID免疫不全マウスを使用し、これはナチュラルキラー細胞16を欠き、他の株14と比較して腫瘍の生着、成長および転移を増加させることが示されている。しかし、13歳の早い時期に3~4ヶ月の間に胸腺リンパ腫を発症する可能性があるため、追加のモニタリングが必要である。SCIDマウスで増殖した卵巣腫瘍移植では、B細胞の成長はリツキシマブによって正常に阻害され、リンパ腫の発症を予防するが、卵巣腫瘍17の生着に影響を与えない。
最近では、NSG(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)マウスは、インターロイキン2受容体γ鎖18をコードする遺伝子にヌル突然変異を運び、PDXモデルの生成に頻繁に使用される株となった。確立されたPDXモデルからマウスの将来の世代に継代された腫瘍は、3〜6世代の19、20,20の組織学的および分子特性を保持すると報告されている。多くの研究は、PDXモデルの治療結果が,対応する患者2、3、4、21、22、233,の患者のものを模倣することを示,21,22している。2423非小肺癌および大腸癌に対するPDXモデルにおける化学療法に対する応答率は、同じ薬剤24,25,25の臨床試験におけるそれと同様であった。臨床試験に登録された患者のために開発されたPDXモデルで行われた研究は、対応する患者22、3、43で臨床的に観察されたものと同様の試験薬に対する応答を実証した。
PDXモデルと組み合わせた患者腫瘍のハイスループットゲノム解析は、特定のゲノム変化と治療応答との間の相関関係を研究するための強力なツールを提供します。これらはいくつかの出版物26,27,27に記載されている。例えば、EGFR阻害剤セツキシマブに対する治療応答は、EGFR増幅を担う大腸PDXモデルのセットにおいて、患者28におけるセツキシマブに対する並行した臨床的応答である。
PDX モデルの開発と適用に関連するいくつかの課題があります。その中には、PDX内でより高い増殖能力を有する単一細胞クローンとしての治療応答解釈の精度を損なう可能性のある腫瘍不均一性29、30,30が、他のもの31を上回ることができ、したがって異質性の喪失をもたらす。さらに、PDXの開発に単一腫瘍生検を使用すると、細胞集団の一部が見逃され、最終的な移植片では表されない。この問題を解決するために、同じ腫瘍からの複数のサンプルが移植に推奨されます。PDX腫瘍は、元のドナー腫瘍のすべての細胞型を含む傾向があるが、これらの細胞は、マウス起源3のものに徐々に置換される。PDXモデルにおけるマウス間質とヒト腫瘍細胞の相互作用はよく理解されていない。それにもかかわらず、間質細胞は腫瘍微小環境33を再現することが示された。
これらの制限にもかかわらず、PDXモデルは、患者の治療を選択するための個別化された医療だけでなく、翻訳研究のための最も貴重なツールの一つです。PDXの主な用途には、バイオマーカーの発見と薬物検査が含まれます。PDXモデルは薬剤耐性メカニズムの研究や薬剤耐性34、35,35を克服するための戦略を特定するためにもうまく使用される。本稿に記載されているアプローチは、研究者がヒト腫瘍における潜在的な治療標的を同定し、最初に属的に特徴付けられた生着腫瘍を収容するマウスにおいて生体内の対応する薬物の有効性を評価することを可能にする。プロトコルは、腹腔,内に生着した卵巣腫瘍を使用するが、マウス2、3、123で成長するのに十分2に積極的なあらゆるタイプの腫瘍に適用可能である。12

<table><tbody><tr><td>3Mベトボンド</td><td>3M、株式会社</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>抗AKT抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>抗GAPDH抗体(G-9)</td><td>Santa Cruz Biotech. Inc.</td><td>sc-365062</td><td></td></tr><tr><td>抗MAPK抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9926</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化AKT抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>抗mTOR抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2972</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化mTOR抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2971</td><td></td></tr><tr><td>抗リン酸化S6抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>4858</td><td></td></tr><tr><td>抗体 Cell</td><td>Signaling Technologies, Inc.</td><td>2114</td><td></td></tr><tr><td>抗S6抗体</td><td>Cell Signaling Technologies, Inc.</td><td>2217</td><td></td></tr><tr><td>Captisol</td><td>ChemScene株式会社</td><td>cs-0731</td><td></td></tr><tr><td>カルボプラチン</td><td>ノバプラス(株)</td><td>61703-360-18</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>メディアテック株式会社</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Easy-A Hi-Fi PCRクローニング酵素</td><td>Agilent, Inc.</td><td>600404-51</td><td></td></tr><tr><td>潤滑剤</td><td>カーディナルヘルスケア</td><td>82-280</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング株式会社</td><td></td><td></td>356234</tr><tr><td>マッコイズ・メディア</td><td>テック株式会社</td><td>10-050-CV</td><td></td></tr><tr><td>MK-2206</td><td>エイペックスバイオ</td><td>A3010</td><td></td></tr><tr><td>MK-8669</td><td>アリアドファーマシューティカルズ(株)</td><td></td><td></td>AP23573</tr><tr><td>ネール センシティブスキン</td><td>チャーチ &ドワイト株式会社</td><td>Nairヘアリムーバーシャワーパワーセンシティブ</td><td></td></tr><tr><td>NOD / SCIDマウスCharles</td><td>River、Inc.</td><td>頷く。CB17-Prkdcscid/NCrCrl</td><td></td></tr><tr><td>パクリタキセル</td><td>ノバプラス(株)</td><td>55390-304-05</td><td></td></tr><tr><td>PEG400</td><td>ミリポアシグマ株式会社</td><td>88440-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>パージェタ</td><td>・ジェネテック(株)</td><td>ペルツズマブ</td><td></td></tr><tr><td>リツキシマブ</td><td>ジェネテック</td><td>リタキサン</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>メディアテック株式会社</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>SCIDマウス</td><td>Harlan Laboratories, Inc.</td><td>C.B.-17/IcrHsd-PrkdcscidLystbg</td><td></td></tr><tr><td>SLAx 13-6MHz リニアトランスデューサ</td><td>富士フイルム ソノサイト</td><td>HFL38xp</td><td></td></tr><tr><td>ソノサイト Sシリーズ 超音波装置</td><td>富士フイルム ソノサイト ソ</td><td></td><td></td>ノサイト ソノサイト</tr><tr><td>80</td><td>ミリポアシグマ</td><td>4780-100ミリリットル</td><td></td></tr></tbody></table>

構造dna改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

ここでは、次世代シーケンシングテクノギー、治療対象分析、患者由来異種移植片(PDX)を用いた薬物応答モニタリングを組み合わせた標的療法の有効性をテストするための統合的なアプローチを紹介します。この戦略は、例として卵巣腫瘍を使用して検証されました.mate ペア次世代シーケンシング(MpPeq)プロトコルは、構造変化を特定し、その後、潜在的に標的可能な変更の分析に使用されました。免疫不全マウスで増殖したヒト腫瘍は、ゲノム解析に基づいて選択された薬物で治療した。結果は、PDXモデルにおける予測応答と観測応答との間の良好な相関を示した。提示されたアプローチは、組み合わせ治療の有効性をテストし、特に標準的な治療が失敗し、ラベル外の薬物を使用する必要がある場合に、再発癌患者のためのパーソナライズされた治療を支援するために使用することができる。

脱バルク手術時に切除された卵巣腫瘍からの組織をIRBガイダンスに従って採取し、1)遺伝子組み換えおよび2)免疫不全マウスにおける生着に使用した(図1)。Mateペアシーケンシングプロトコル36,37は36、損失、利益および増幅を含むDNAの構造的変化を同定するために使用された。1つの腫瘍におけるゲノム変化の風景を示す代表的なゲノムプロット(OC101と指定)を図2に示す。高品位の漿液性サブタイプ腫瘍では、複数の利益(青線)および欠失(赤線)が見つかり、高レベルのゲノム不安定性、染色体の損失および利益、すなわち異数理を示す、観察された。平均300〜700の変化の合計は、高等級漿液性サブタイプ腫瘍45で同定される。その後の分析は、臨床的に関連する薬物で標的に可能ないくつかのDNA変化を明らかにした。OC101腫瘍における治療介入のためのトップランクの変化は、E...

ここでは、腫瘍のゲノム構成に基づいて選択された標的療法の有効性を試験するプロトコルを提示する。このプロトコルは、構造的DNA再構成の同定と検証、患者の腫瘍のマウスへの生着、および対応する薬物に対する応答のテストを記述する。

構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

ここで説明するプロトコルは、生体内癌モデルを用いて治療効果をテストするためのアルゴリズムを実証することを目的としている。プロトコルは、いくつかの手法の組み合わせで構成されています。ヒト腫瘍標本の全ゲノムバイオシーケンシングは、ゲノム変化を同定するために使用される。これらには、遺伝子の再調整と遺伝子コピー数の変化の両方が含まれる。したがって、特定された変更の分析は、潜在的に薬物可能な変化を選択するために行われます。ゲノム解析に基づいて選択された薬物は、免疫不全マウスで増殖した対応する腫瘍のインビボ治療に使用される。開発されたアルゴリズムは、がん患者のケアのための治療決定を支援するための有望なアプローチを表しています。パンダツールまたは類似のソフトウェアを使用して、ターゲット可能な変更を特定します。標準的な遺伝子シンボルを使用して単純なタブの区切りファイルとして生じた微小配列決定によって同定された遺伝子をリストアップすることができます。テーブルヘッダーがソフトウェアの経路レベルUに転送されるように、リストのヘッダラインにポンド記号を追加します。対応するナビゲーションタブをクリックしてファイルをアップロードします。選択したアイコンをクリックし、[ファイナライズ] タブをクリックして、基になるデータを表す 1 つのアイコンを割り当てます。患者ファイルがアップロードされたら、ページをプレビューして、経路ごとのアポイントト付き遺伝子数を表示する列を特定します。これは、右側の最後の列です。メイン ウィンドウの左上にある経路フィルターを使用して、表示される経路の数を、対象の遺伝子を含むものに制限します。偶然に予想されるよりも多くの遺伝子に注意を付けた経路を特定するには、濃縮タブの下にある関数を使用します。その後、フィッシャーの正確検定の対応するp値を示すメインテーブルに列が追加されます。メイン ウィンドウの左側にある適切なアイコンをチェックして、事前設定アノテーションから潜在的な薬物性遺伝子を表示するデータベースを選択します。ビジュアライゼーション用の経路を選択するには、経路ビューアページに表示されている名前をクリックします。各アノテーションセットを表すアイコンが、関連するジーンの横に表示されます。経路内の任意の遺伝子をクリックすると、対応する遺伝子カードページが開きます。関心のある遺伝子と、さらなる分析のための潜在的な薬物のヒットを示した経路を選択します。滅菌状態を維持するために層流フードで組織作業を行います。抗生物質を含む冷たいPBSまたは組織培養培地(RPMI、DMEMなど)を含む皿に腫瘍組織を置く。病理学者の助けを借りて、隣接する正常および壊死組織から生存可能な腫瘍材料を同定し、単離する。生殖不能鉗子およびメスを使用して、病理学者によって指摘された壊死性物質を除去する。皮下生着を行うために、滅菌鉗子、メスまたは手術用ハサミで腫瘍組織を小さな断片(およそ2×2×2ミリメートル)に切断する。断片化した組織を氷の上の冷やされたシャーレに移します。断片化した組織、組織の10個あたり約200マイクロリットルで皿に冷たいマトリゲルを入れます。よく混ぜて、組織断片をマトリゲルに10分間浸します。無菌の外科用ハサミと鉗子を使用して、マウスの両脇腹に5〜10ミリメートルの垂直皮膚切開を行います。ストレート鉗子を皮下空間にそっと挿入して、脂肪パッドの下に腫瘍片を置くのに十分な大きさのポケットを作ります。無菌ストレート鉗子を使用して、前に準備したポケットに腫瘍断片を5匹のマウスのそれぞれに挿入します。ティッシュ接着剤を使用して皮膚切開を閉じます。移植後、リンパ球増殖を阻害し、各マウスに100マイクロリットルのリツキシマブを注入する。背中の皮膚をつまんで後ろ向きに曲げて、マウスの頭と唇が固定されるようにして、マウスを経口ギャバジに備えます。プローブが食道に到達するまで、マウスの喉の後ろにガビンプローブを挿入します。マウスの肺が死を引き起こす可能性があるため、プローブが挿入されすぎないようにしてください。代表的なゲノムフロートは、1つの腫瘍におけるゲノム変化の景観を示す。高品位の血清型腫瘍に典型的な、青い線および損失の赤い線を複数得る、ゲノム不安定性の高いレベルを示す同定された。OC101腫瘍における治療介入の最も高い傾向変化は、HER2受容体をコードする遺伝子であるERBB2を含む染色体17での増幅であった。DNAレベルで結果を検証するために、増幅された領域の縁に対していくつかの特定のプライマーセットが設計されました。PCRを行った。ヒトDNAの制御を使用した場合、増幅産物は吸収されなかった。OC101腫瘍DNAについて特異的なバンドが同定された。別の変異型腫瘍、T14では、多数のDNA利益が観察された。これらには、RICTOR遺伝子にAKT2が含まれていました。タンパク質レベルで行われた検証は、イムノブロット法を用いて、RICTORにおいて高レベルのAKTを示した。腫瘍の負担の有意な減少は、第6週末までに化学療法処置群において観察された。併用治療を受けたグループだけでも化学療法に対する余分な利点があった。腫瘍組織は、治療試験終了時に治療応答の分子分析のために収集した。S6、AKT、およびmTORの合計およびリン酸化レベルは、免疫ブロット法を用いて決定した。未治療、化学療法、およびAKTまたはmTOR阻害剤で治療したこれらのタンパク質のレベルの比較は、後者の2つについて顕著な減少を示した。提示されたアプローチはPDXモデルの臨床試験を行うために非常に有用である。ゲノムプロファイリングによって得られる腫瘍の分子特性を利用して、検査のための最良の選択薬を決定する。

testing-targeted-therapies-cancer-using-structural-dna-alteration

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

この原稿は、循環腫瘍細胞(CTC)から前立腺癌患者由来異種移植片(PDX)を生成するために使用される方法を詳述しています。CTCからのPDXモデルの生成は、前立腺がんを研究するための代替実験モデルを提供します。最も一般的に診断される腫瘍であり、男性の癌による死亡原因として多い。...

前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

ヒト腫瘍異種移植片は、血管新生およびインビボでの増殖期の間に、マウス起源の細胞によって浸潤されています。下流の分析の間に、これらの混入細胞によって引き起こされるバイアスを回避するために、我々は、磁気細胞選別により、すべてのマウス細胞の包括的枯渇を可能にする方法を開発しました。...

ヒト腫瘍異種移植片からマウス細胞の枯渇は大幅に標的細胞の下流分析を向上させます

皮下前臨床モデルで患者由来の腫瘍を利用する新しい治療法、予測バイオマーカーの発見、および薬剤耐性経路の有効性を研究するための優れた方法です。このモデルは、薬物開発プロセスにおいて、臨床試験の前に、多くの新規抗癌療法の運命を決定する上で不可欠です。...

前臨床患者由来の腫瘍新規抗がん療法の調査のための異種移植モデルの開発とメンテナンス

患者由来異種移植片(PDX)は、黒色腫の分子および生物学的特徴をより強固に要約し、従来のプラスチック組織培養ベースのアッセイと比較して治療応答のより予測的である。ここでは、新しいPDXモデルの確立と既存のPDXモデルの特性/実験のための標準的な動作プロトコルについて説明します。...

黒色腫患者由来異種移植片モデル

インビトロスクリーニングのために患者由来の異種移植片(PDX)を使用してオルガノイドを作成する方法が記載され、インビボ/インビトロモデルのペアが一致する結果となる。PDX腫瘍は、機械的または酵素的に小片に収穫/処理され、その後、元のPDXに対して通過し、凍結保存され、特徴付けられる腫瘍オルガノイドを成長させるCleversの方法が続いた。...

がん薬理学研究のためのPDXとPDX由来オルガノイドのインビボ/インビトロ患者由来モデルペアの作成

本論文では、患者に関連する生きた前臨床モデルシステムにおける腫瘍薬物反応を評価するための患者由来外植物の生成、薬物治療、分析の方法について説明する。...

患者の薬剤耐性を予測するための「生きた」前臨床プラットフォームとしての患者由来腫瘍エクスプラント

ここでは、遺伝子操作されたマウスモデル由来腫瘍において、インビボで胚致死性である遺伝子ノックアウトを行い、そのノックアウトが腫瘍の成長、増殖、生存、遊走、浸潤、およびトランスクリプトームに及ぼす影響をインビトロおよびインビボで評価するためのプロトコルを提示する。...

悪性末梢神経鞘腫瘍細胞におけるフロックス対立遺伝子の Ex vivo アブレーションによる腫瘍形成における遺伝子機能の定義

このプロトコールは、NSCLC患者由来オルガノイドモデルにおける標的シグナル伝達阻害剤に対する薬物感受性の標準化された評価を記載している。...

EGFR変異型NSCLC患者由来オルガノイドにおける標的療法に対する感受性のプロファイリング

私たちは、遺伝子改変マウスモデルで発生した腫瘍の治療標的と対応するヒト腫瘍の種類を同定および比較するために、ゲノム解析と機能的ゲノムスクリーニングを利用した種間比較腫瘍ゲノミクスアプローチを開発しました。...

悪性末梢神経鞘腫瘍のマウスモデルにおける治療標的を特定するための遺伝子プロファイリングおよびゲノムスケールドロップアウトスクリーニング

このプロトコルは、マウスにおける乳がん患者由来異種移植片の同所性移植のための効率的な非外科的方法を説明しています。この技術には、酵素による腫瘍解離とそれに続く乳腺脂肪パッドへの直接注射が含まれ、ハイスループットの移植が可能になります。包括的な検証により、モデルの忠実度が確保され、さまざまな乳がんサブタイプにわたる厳密な研究が容易になります。...

乳がん患者由来異種移植片のハイスループット解離と同所性移植

学ぶ 構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験アルゴリズム。全ゲノムバイオシーケンスと免疫不全マウスを用いた薬剤有効性検証法。

構造DNA改変解析と患者由来異種移植片を用いたがんの標的治療の試験

さらに動画を探す