マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析
January 7th, 2020
ここでは、マウス胚組織における遺伝子発現をプロファイルする多重化単一細胞mRNAシーケンシング法を提示した。多重化戦略と組み合わせた液滴ベースの単一細胞mRNAシーケンシング(scRNA-Seq)法は、複数のサンプルから単一細胞を同時にプロファイルできるため、試薬コストを大幅に削減し、実験的なバッチ効果を最小限に抑えることができます。
単一細胞mRNAシーケンシングは、単一細胞レベルでの生物学的プロセスを理解するために広く使用されている。多重化戦略の出現は、単一の実験で複数のサンプルのプロファイリングを可能にし、コストを大幅に削減し、バッチ効果を回避することによって、増幅をさらに拡大しました。この手順のデモンストレーションは、ポスドクのウェイ・フェンと、私の研究室の技術者アンドリュー・プジシンダです。
カウント後、胚18.5日目の心臓室から分離した細胞を5倍の10から5番目のアリコートに分割し、洗浄ごとに新鮮なPBSで細胞を2回洗浄する。サンプルあたりPBSの180マイクロリットルでペレットを再懸濁し、穏やかな混合と各チューブにアンカーバーコードストック溶液の20マイクロリットルを追加します。氷の上に5分間のインキュベーションの後、20マイクロリットルの共同アンカーバーコードストック溶液を各チューブに加え、氷上でさらに5分間のインキュベーションを行い、1回の洗浄で1ミリリットルの冷たいPBSで細胞を3ミリリットル洗浄し、チューブあたり1つの40マイクロメートルセルストレーナーを通してサンプルを新しいチューブにフィルターします。
カウント後、チップBをチップホルダーに組み立て、50%グリセロール溶液の75マイクロリットルを1行目の未使用の井戸に、40マイクロリットルを2行目の未使用の井戸に、280マイクロリットルを3行目の未使用の井戸に加えます。ここでは、手順を示すためにトレーニング チップを使用します。優しいピペットでマスターミックスに細胞懸濁液とヌクレアーゼフリー水の適切な量を追加します。
結果として得られたセル溶液の75マイクロリットルを、気泡のない行の1の行ウェルの下の中央に加えます。ゲルビーズを30秒間ボルテックスしてから、泡のない2列目のゲルビーズの底中央に40マイクロリットルのビーズをゆっくりと加えます。3列目の仕切油井戸のサイドウォールに280マイクロリットルの仕切油を加えます。
ガスケットを押さずにガスケットをチップに取り付け、ガスケットを水平に保ち、ガスケットを濡らさないようにします。組み立てたチップをクロムコントローラにガスケットでセットし、クロム単一セルBプログラムを実行します。画面にはトレーニングチップのクロムトレーニングが表示されますが、実際の実験ではクロム単一セルBが表示されます。
蓋を折り返して45度の角度で井戸を露出させ、液体レベルをチェックして下駄がないことを確認します。回復の最も低い点からエマルジョン中のゲルビーズの100マイクロリットルをゆっくりと吸引し、ビーズの均一性を確認する。乳化ビーズを氷上の新しいPCRチューブの壁に分配し、逆転写のためにサーマルサイクラーにチューブを入れます。
cDNAを増幅用に準備するには、室温で125マイクロリットルの回収剤をサンプルに加えます。不透明な液体は観察されず、ピペットや渦を避けてください。60秒待ってから、ゆっくりとチューブの底から回収剤を取り出し、200マイクロリットルの渦ビーズのクリーンアップ混合物をサンプルに加えます。
混合物を10回ピペットしてから室温で10分間インキュベートする。次に、サンプルを磁石の上に高い位置に置きます。溶液がクリアされたら、上清を取り除き、80%エタノールの200マイクロリットルをペレットに加えます。
30秒後、エタノールを取り除き、さらに2回洗浄を繰り返します。最後の洗浄後、サンプルを短く遠心分離し、低い位置でマグネットの上にチューブを置き、サンプルが2分未満乾燥するようにします。サンプルが乾燥したら、マグネットからチューブを取り出し、作りたての溶出液を35.5マイクロリットル加えます。
室温で2分間のインキュベーションの後、溶液がクリアされるまで磁石の上にサンプルを置き、サンプルの35マイクロリットルを新しいチューブストリップに移します。脂質ベースのバーコード戦略を用いたcDNA増幅の場合、35マイクロリットルcDNAサンプルに増幅反応混合物を加え、遠心分離を簡単に行う前に完全混合を行います。スピンの終了時に、適切なcDNA増幅手順に従って、サーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。
120マイクロリットルの選択試薬と100マイクロリットルの超純水を100マイクロリットルのサンプルに加え、得られた0.6倍の選択試薬を15回ピペットします。室温で5分間のインキュベーションの後、溶液が明らかになるまでサンプルを磁石の上に置きます。バーコード化されたcDNAライブラリ構造を多重化するために、上清を1.5ミリリットルの低結合チューブに移します。
上清の内容がバーコード化されたcDNAと内因性cDNAのベース内容を組み立てるので、上清とベースの両方を保存することを忘れないでください。80%エタノールで内因性cDNAを洗浄し、40マイクロリットルの溶出バッファーでDNAを溶出し、内因性転写ライブラリを準備する前に内因性cDNAの品質管理チェックを実行します。cDNA濃度は、ライブラリの構築前に定量化し、修飾する必要があります。
内因性の cDNA ライブラリやバーコード ライブラリを含む構築されたライブラリも、シーケンス処理の前に定量化および修飾する必要があります。シーケンス処理後、バーコード式は各セルで分析できます。例えば、この分析では、8種類の異なるサンプルから1種類のバーコードを表すバーコードを一意に発現した8つのグループの単一細胞が観察された。
さらに、一部のセルはバーコードを表さなかったため、負のセルとして定義され、他のセルは2つの異なるバーコードを表す2つの異なるバーコードを表しました。単一細胞を用いて、細胞の異種性および分子規制は、細胞型注釈、新規および稀な細胞型同定、解剖学的領域比較分析、および細胞周期相分離などの遺伝子オントロジー経路解析によって評価することができる。可能であれば、エマルジョンでゲルビーズを画像化すると、この時点まで手順が成功したかどうかが画像でわかります。
サンプル多重化により、実験の設計に大きな柔軟性が加わることができます。このデモンストレーションを見て、あなた自身の実験を始めることに自信を持っていければと思います。
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概要
この研究は、マウスの胚組織における遺伝子発現をプロファイリングするための多重化された単一細胞mRNAシーケンシング方法を提示します。ドロップレットベースのscRNA-Seq方法と多重化戦略を組み合わせることで、複数のサンプルからの単一細胞の同時プロファイリングが可能になり、コストを削減し、バッチ効果を最小限に抑えます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- ゲノミクス
- 細胞生物学
背景
- 単一細胞mRNAシーケンシングは、細胞レベルでの生物学的プロセスを理解する上で重要です。
- 多重化戦略により、複数のサンプルのプロファイリング効率が向上します。
- この方法は、単一細胞分析におけるコストとバッチ効果の課題に対処します。
- マウスの胚組織は、発生研究のモデルとして役立ちます。
研究の目的
- 単一細胞における遺伝子発現をプロファイリングする費用対効果の高い方法を開発すること。
- 胚組織における多重化されたscRNA-Seqの応用を示すこと。
- 同時サンプル処理を通じて実験バッチ効果を最小限に抑えること。
使用された方法
- マウスの胚組織からの細胞の分離。
- ドロップレットベースの単一細胞mRNAシーケンシング。
- 同時サンプル分析のための多重化戦略。
- 効率的なサンプル処理による試薬コストの削減。
主な結果
- 複数の胚サンプルにおける遺伝子発現のプロファイリングの成功。
- 多重化に関連するコストの削減の証明。
- 遺伝子発現分析におけるバッチ効果の最小化。
- 実験手順を通じた方法の検証。
結論
- 多重化されたscRNA-Seq方法は、胚組織における遺伝子発現の研究に効果的です。
- このアプローチにより、コストを大幅に削減し、データ品質を向上させることができます。
- 将来の応用は、他の生物学的システムや条件にまで拡張される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Multiplexed single cell mRNA sequencing enables high-resolution profiling of cellular heterogeneity across multiple samples, supporting early discovery and target validation in complex tissues. By minimizing batch effects and reducing per-sample costs, this approach enhances predictive confidence and accelerates portfolio triage in developmental and disease-relevant models. The method's scalability and quantitative outputs position it as a reusable capability for enterprise R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular diversity and rare cell populations in developmental or disease models.
- Supports functional target validation by linking gene expression to specific cell types and states.
- Facilitates mechanistic de-risking through high-content, single-cell resolution data.
- Improves predictive confidence for target selection and prioritization.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single cell suspensions for downstream high-throughput screening workflows.
- Standardizes sample processing and minimizes batch effects for reproducible quantitative outputs.
- Enables scalable multiplexing, allowing simultaneous evaluation of multiple genetic backgrounds or conditions.
- Provides robust data for reliable compound or perturbation assessment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular phenotypes with developmental or disease-relevant biomarkers when profiling multiple anatomical zones or stages.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling comparative analyses across models.
- De-risks translational advancement by revealing molecular regulations and cell type-specific responses.
Pipeline & Workflow Integration
This multiplexed scRNA-Seq method integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and comparative analytics across samples.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of cellular heterogeneity and pathway activity.
- Screening: Provides standardized, reproducible single cell data for assay development and screening readiness.
- Analytics: Delivers quantitative gene expression and barcode readouts for robust condition comparison.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease model validation when profiling multiple developmental stages or anatomical regions.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, cost-effective platform adaptable to diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes workflows, enhances reproducibility, and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling multiplexed analyses.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and preclinical assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single cell isolation, barcoding, and sequencing workflows.
- Needs access to droplet-based microfluidic instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization to minimize batch effects and ensure data comparability.
- Adaptable to various genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations with appropriate optimization.
- Practical limitations include cell viability, barcode assignment accuracy, and doublet discrimination.
