固形腫瘍細胞株における側集団の解析
2021年2月23日
固体腫瘍細胞株における側集団細胞の割合を測定する便利で迅速かつ費用対効果の高い方法が提示される。
側の集団細胞の分析は、腫瘍組織および腫瘍細胞株から癌幹細胞を単離し、同定するために一般的に使用される方法の1つである。このアッセイは、便利で、高速で、費用対効果が高い。この方法は、腫瘍細胞の幹細胞性に対する遺伝子または他の細胞外および細胞内シグナルの影響をよりよく理解するのに役立つ。
この分析では、多くの要因がSP細胞の割合に影響を与える可能性があるため、正式な実験の前に適切な条件を調べるのが重要です。腫瘍細胞を6ウェルプレートに播種し、5%の二酸化炭素を供給する摂氏37度のインキュベーターでインキュベートする。細胞密度が培地を約90%吸引すると、3ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄した。
その後、0.25%トリプシン-EDTAの500マイクロリットルを各ウェルに加え、37°Cでプレートを1〜3分間インキュベートします。プレートを軽くタップして細胞を取り外し、各ウェルに2%FBSを加えたPBSを3ミリリットル加え、細胞を上下に3~5回ピペットして細胞塊を分散させます。細胞懸濁液を顕微鏡で調べます。
細胞の塊が存在する場合は、70マイクロメートルのストレーナーを通して懸濁液を通過する。細胞を15ミリリットルの遠心分離管に移し、200倍gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、2%FBSを補充したPBSの3ミリリットルで細胞を再懸濁し、細胞を上下に3〜5回ピペットして混合する。
ヘモサイトメーターを用いて顕微鏡下で細胞を数え、2%FPSを加えたPBSで希釈し、1ミリリットル当たり6個の細胞に10倍の最終濃度にする。5ミリリットルのポリスチレン、ラウンドボトム試験管を2本用意し、各チューブに1ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。一方のチューブを試験管として、もう一方のチューブにブロッカーコントロールチューブとしてラベルを付けます。
適切な濃度に希釈することにより、ブロッカーの溶液を調製.ブロッカーコントロールチューブに加えてよく混ぜ、37°Cで30分間チューブをインキュベートします。チューブを10分おきに振ります。
適切な濃度に希釈してHoechst 33342の溶液を調製する。試験管とブロッカーコントロールチューブに別々に加え、よく混ぜ、摂氏37度で60分間インキュベートします。10分ごとにチューブを振ります。
インキュベーション後、細胞を200倍gと摂氏4度で5分間遠心分離し、上清を慎重に吸引する。2%FBSを補った氷冷PBSの1ミリリットルで各チューブ内の細胞を再懸濁し、その後、細胞を上下にピペットして混合します。各チューブに1ミリグラム/ヨウ化プロピジウム(PI)を1マイクロリットル加え、混合します。
フローサイトメーターソフトウェアの[パラメータ]タブをクリックします。まず、FSC、SSC、ホークストブルー、ホーヒストレッド、PIのパラメータをそれぞれ選択します。次に、PI パラメータの対数スケールを選択します。
最後に、FSC、SSC、Hoechst ブルー、ホークスト レッド、PI パラメータの面積と幅のスケールをそれぞれ選択します。まず、試験管からセルを実行し、次に同じ電圧とゲートを使用してブロッカー制御チューブからセルを実行します。各サンプルから20~100,000個のイベントを収集し、SPセルの割合を分析します。
この方法は、MDA-MB-231ヒト乳癌細胞株におけるSP細胞の割合を検出するために使用した。FSC-A対PI-Aのドットプロットは、死んだ細胞、細胞デブリ、およびPI陰性細胞の主な集団の集団を示し、さらなる分析を行った。FSC-A対FSC-WのドットプロットとSSC-A対SSC-Wのドットプロットからゲートされた単一の細胞集団は、未治療細胞で約0.9%、レセルピンで処理された細胞で約0.09%であったSP細胞の割合を分析するために使用された。
MDA-MB-435細胞で異なる染色濃度のHoechst 33342を試験し、1ミリリットル当たり2マイクログラムがSP分析に最適であると判断した。低濃度ではSP細胞を他の集団と区別することが困難となり、高濃度ではSP細胞が消失しました。ベラパミルおよびレセルピンはMDA-MB-435細胞に対する適切なブロッカーを決定するために試験した。
約0.4%の細胞がベラパミル処理後に色素を排出したが、レセルピン処理後に約0.1%に低下し、レセルピンがこの細胞株にとってより適切なブロッカーであることを示した。このプロトコルは、STAT3アクチベーターコリブリンで治療されたA549ヒト肺腺癌細胞およびFRA1阻害剤SKLB816で治療されたT47Dヒト乳癌細胞におけるSP細胞の割合を決定するためにも使用された。このアッセイは、がん幹細胞の特徴に対するシグナル伝達経路の調節効果の手がかりを提供し、最終的に腫瘍の標的療法を導くことができる新しいメカニズムの発見を容易にする。
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概要
本記事では、固形癌腫瘍細胞株におけるサイドポピュレーション細胞の割合を測定するための、簡便、迅速かつ費用対効果の高い方法を紹介します。サイドポピュレーション細胞の解析は、癌幹細胞の単離および同定において極めて重要です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 細胞生物学
背景
- サイドポピュレーション細胞は、がん幹細胞の研究において重要です。
- この手法は、腫瘍細胞の幹細胞性（stemness）の特性を理解するのに役立ちます。
- 多くの要因がSP細胞の割合に影響を与えます。
- 正確な結果を得るためには、適切な実験条件が不可欠です。
研究目的
- サイドポピュレーション細胞を測定するための信頼性の高い手法を提供すること。
- がん幹細胞生物学への理解を深めること。
- さまざまなシグナルが腫瘍細胞に及ぼす影響に関する研究を促進すること。
使用された手法
- 6ウェルプレートに腫瘍細胞を播種する。
- 37 °C、5% 二酸化炭素条件下でインキュベートする。
- 細胞密度が約90%に達したときに、培地を吸引除去する。
- 分析前に細胞をPBSで洗浄する。
主な結果
- この手法は効率的であり、費用対効果が高い。
- 腫瘍組織からがん幹細胞を単離することが可能である。
- SP細胞を正確に測定するためには、適切な条件が不可欠である。
- このアプローチは、腫瘍細胞生物学の理解に寄与する。
結論
- 本手法は、がん研究において価値のあるツールとなります。
- 本手法は、がん幹細胞の同定に有用です。
- 今後の研究では、本手法を基盤として腫瘍生物学の探究が可能です。
よくある質問
産業界における重要性
サイドポピュレーション解析によるがん幹細胞の単離は、腫瘍の幹細胞性パスウェイのメカニズム的なリスク低減を可能にし、オンコロジー創薬におけるターゲットバリデーションを支援します。本アッセイは、幹細胞様細胞集団に関する定量的で再現性のあるデータを提供し、リード化合物の同定および前臨床モデルの選定に寄与します。その費用対効果の高さと、さまざまな固形がん系への適応性は、初期探索からパスウェイに焦点を当てたスクリーニングまでのトランスレーショナルな連続性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：ABCトランスポーター機能に関連する幹細胞様細胞の排出活性を定量化することで、治療仮説を検証します。
- 運用的価値：阻害剤による遮断（例：verapamil、reserpine）を通じて、SP表現型の特異性を確認し、機能的なターゲットバリデーションを可能にします。
- トランスレーショナル価値：遺伝子またはパスウェイの変調（例：STAT3活性化剤、FRA1阻害剤）をSP頻度の変化に関連付けることで、予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：SP濃縮分画を単離することで、後続の化合物スクリーニングに向けた検証済み生物学的システムを調製します。
- 実用的価値：最適化したHoechst 33342濃度（2 µg/mL）およびブロッカーのタイトレーションにより、再現性のある染料排出アッセイを標準化します。
- トランスレーショナル価値：複数の細胞株（MDA-MB-231、MDA-MB-435、A549、T47D）におけるがん幹細胞特性への化合物影響を評価するための、拡張可能でプラットフォーム再利用可能なワークフローを可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 科学的価値：腫瘍の発生、転移、および再発メカニズムをモデル化するための疾患関連システムとして、幹細胞性の特性を測定する。
- 運用の価値：SP変調とパスウェイ阻害剤の有効性を相関させることで、リスク調整に基づいた進展決定を促進する。
- トランスレーショナル価値：SPの変動を腫瘍細胞の幹細胞性に対する細胞外・細胞内シグナルの影響に関連付けることで、バイオマーカーの整合性をサポートする。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は初期の探索段階に位置づけられ、リード化合物の同定前における仮説検証および生物学的リスクの低減を支援し、その結果は前臨床段階への継続的な判断に寄与します。
- 探索生物学：遺伝学的または薬理学的な摂動がSP由来の幹細胞性にどのように影響するかを定量化することで、パスウェイの解明を可能にします。
- スクリーニング：標準化された細胞調製、染色、およびフローサイトメトリーのゲーティング（FSC-A vs. PI-A、FSC-W、SSC-W）を通じて、アッセイの準備を整えます。
- 分析：条件間（例：未処理群 vs. レセルピン処理群）を比較するための定量的な従属変数測定値（SPパーセンテージ）を算出します。
- トランスレーショナルリサーチ：肺腺癌および乳癌モデルにおける幹細胞性の変調を評価することで、基礎研究から前臨床検証への橋渡しを行います。
- 企業的な再利用：固形癌の種類を横断して利用可能なモジュール機能として機能し、冗長なアッセイ開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：色素排出の直接的な機能的読み取りにより、がん幹細胞研究におけるメカニズム的な曖昧さを低減します。
- 運用的価値：標準化された細胞濃度（1×10⁶ cells/mL）、インキュベーション条件（37°C, 5% CO₂）、およびブロッキングコントロールを通じて、再現性を確保します。
- 戦略的価値：幹細胞性の経路調節因子（例：STAT3、FRA1）を統計的な明確性をもって特定することで、Go/No-go決定を改善します。
- ポートフォリオへの影響：複数のモデルにおけるSP変調効率に基づいた、リスク調整済みのターゲット優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- Hoechst Blue/RedおよびPIパラメーターのフローサイトメトリーにおける補正（コンペンセーション）およびゲーティングの専門知識が必要です。
- 対数スケールでのPI測定および面積/幅（area/width）信号検出が可能なフローサイトメーターへのアクセスに依存します。
- ばらつきを最小限に抑えるため、細胞調製、洗浄、およびブロッキングプロトコルのチーム間での標準化が必要です。
- 最適なHoechst濃度やブロッカーの有効性は腫瘍型によって異なるため（例：MDA-MB-435とA549など）、適応に関する検討が含まれます。
- 実用上の制限：MDA-MB-231のドットプロットに示されているように、SP解析の感度はPIゲーティングによる死細胞およびデブリの適切な除外に依存します。
