Name: マウス島の口内皮下白色脂肪組織(ISWAT)移植モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶマウス島移植モデルで1型糖尿病治療を探索する。鼠径部皮下白色脂肪組織への移植法を用いて血糖値モニタリングと組織学的解析を行い、臨床応用の可能性を評価する方法です。

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この研究は、中国の国家主要R&Dプログラム(2017YFC1103704)広東省の高レベル病院建設のための特別資金(2019年)、深センの三明医学プロジェクト(SZSM201412020)、高レベル基金からの助成金によって支えられました。深センの医療規律建設(2016031638)、深セン科学技術財団(JCJY20160229204849975、GJHZ20170314171714171314171333年、深セン保健家族計画委員会(SZXJ2010102010100年10月20日)中国広東省科学研究財団(A2019218)、中国ポドカルサイエンス財団(2018M633218)。

この議定書のすべての手続きは、深セン第二人民病院の倫理審査委員会の動物福祉の原則に従った。この座レット移植片のレシピエントとドナーは、広東省医療動物センターから購入した8~10週齢のC57BL/6雄マウスであった。収穫、単離、培養、または収穫した細胞の投与の手順を無菌条件で行った。
1. アイレットの準備
<ol><li>コラゲナーゼV型働き液を調製する。コラゲナーゼタイプVの重さを測り、D-Hankのバッファーで1mg/mLの最終濃度に溶解し、0.22μmの注射器駆動フィルターユニットと60mLシリンジを使用してフィルターを適用し、氷でプレクールにします。ドナー受信者ごとに5 mLのボリュームが必要です。</li>
	<li>10週齢のC57BL/6雄マウス(23±2g)を頸部脱臼によって安楽死させ、マウスの外部部分に75%エタノールを数秒間スプレーする。一方、5 mLシリンジをコラゲラーゼ溶液で満たし、曲げ鈍い尖った灌流針(32G)で注射針を交換する。</li>
	<li>ドナーマウスを氷袋の上の氷袋の上の球面の位置に置き、陰部の皮膚にまっすぐに尖った眼科はさみを使って横方向の開口部を切り、皮膚を頭に向かって完全に切開する。その後、陰部からxiphoidプロセスへのV切開を介して腹部を完全に開きます。</li>
	<li>胆嚢と肝臓を再配置することによって、一般的な胆管の全長を露出させる。次に、一般的な胆管の十二指腸開口部を血管クランプでクランプし、胆嚢の小さな開口部を切断します。 注:肝臓や胆嚢への逆流を防ぐために最適な針の配置が重要です。</li>
	<li>ステップ1.2で灌流針を用いて胆嚢開口部から共通の胆管をカニューレートし、次いで膵臓にコラーゲン溶液を〜2mL注入する。その後、浸透した膵臓を腸、胃、脾臓から2組の非侵襲的マイクロテーゼを使用して分離し、氷上の50mL円錐形チューブに入れる。 注: すべてのドナー マウスに対してこのプロセスを繰り返します。3つの連続的に浸透した膵臓(40分以内の間隔)は各膵臓のためのコラゲナーゼの水溶液の3 mLが事前に満たされた50 mL円錐形の管に結合することができる。</li>
	<li>膵臓あたり100 μL DNase I(10 mg/mL)を50 mL円錐形のチューブに加え、3~5分間円錐管を振って37°Cの水浴中で膵臓を消化します。 注:チューブを10回間隔で激しく振って、水浴中の消化前に組織の関連付けを解除し、消化中にチューブを適度に振ります。</li>
	<li>停止溶液(2.5 mg/mL BSA-HBSS溶液)を50mLの最終体積まで添加して消化を遮断し、4°Cで750 x gの速度まで遠心分離して素早く停止します。</li>
	<li>上清を注ぎ、BSA-HBSSの15〜25mLで静かに再懸濁してペレット2xを洗います。パルスは、ステップ1.7で概説した速度条件と同じ速度条件でチューブを1分間遠心します。</li>
	<li>上清を注ぎ、3本の円錐形チューブのペレットを50mLの円錐形チューブにプールします。ペレットを総体積10mLのヒストリフィマ-1119で再懸濁する。均質に混合し、チューブの側面に沿ってゆっくりとピペットを入れて、ヒストリフィム-1077とHBSSの5 mLを順次加えます。</li>
	<li>4 °Cで750 x gで遠心分離機内のサンプルを10分間回転させます。</li>
	<li>HBSS/ヒストリペティフィケーション-1077インターフェースから使い捨て5 mLパスツールピペットを使用して50mL円錐形チューブに小島を吸引し、BSA-HBSSを最終体積50mLに、4°Cで750 x gで遠心分離機を加えます。</li>
	<li>上清を注ぎ、BSA-HBSSの30 mLを使用して小島を洗います。4 °Cで750 x gで1分間遠心分離。</li>
	<li>チューブあたり30 mLの培養培地(10%FBS-1%P/S-CMRL-1066)を使用して小島を再懸濁し、直径10cmの軽密な培養皿に注ぎます。ステレオ顕微鏡では、200 μLゲルローディングピペットチップを使用して、その形態に基づいて溶液から小島をピックします(すなわち、回転楕円体、白)。10mLの培養液を用いて未処理の細胞培養皿に入れる。 注:第一のピッキング後に最初に精製された小島の純度が最適でない場合は、第二のハンドピッキングを行うことができます。</li>
	<li>光顕微鏡でジチゾン染色で選ばれた小島の純度を確認し、蛍光顕微鏡で染色するフルオレセインジアセテート(FDA)-ヨウ化プロピジウム(PI)による小島の生存率を検出します。</li>
	<li>分離された小島を培養した後、培養液中の培養液(工程1.13のように)を37°Cでインキュベーターで、移植前に95%の空気−5%CO2で培養した。</li>
</ol>2. ISWATの入り口移植
<ol><li>8週齢の雄C57BL/6マウス(22±2g)の1回のストレプトゾトシン注射(STZ)で糖尿病を誘発する。日目-4、マウスを〜4〜6時間速く、次いで0.1 Mクエン酸緩衝液(pH 4.4)を用いて2%STZ溶液を調製した。体重を量り、緩衝液中に再懸濁し、180mg/kgの用量でマウスを腹腔内に注入する。 注:STZソリューションは、使用前に新たに準備し、その光感度のためにアルミニウム箔で覆う必要があります。15~20分以内に活動を失うので、すぐに使用してください。</li>
	<li>STZ注射マウスの尾静脈を穿刺し、1日-1日と0日目の午前10時頃に血液を採取し、テストストリップと基本的な血糖値モニタリング器具を使用して非空腹血糖レベルを測定する。2回連続検査日の血糖値が両方とも少なくとも20ミリモル/Lである場合、マウスは、島移植レシピエントとして使用されます。</li>
	<li>0日目に、すべてのレシピエントマウスの重みとマークを付けます。腹腔内60mg/kgペントバルビタールナトリウムを注射して各レシピエントを麻酔する。 注:麻酔の深さを確認するためにつま先のピンチを管理します。レシピエントマウスに離脱反射がない場合、麻酔のレベルは手術に十分です。ない場合, 追加の投与 10 mg/kg ペントバルビタールナトリウム.使用したペントバルビタールナトリウムを、2%の濃度で滅菌生理食塩水で希釈した(m/v)。</li>
	<li>-20°Cの冷凍庫からヒドロゲルを取り出し、解凍できるように氷の上に保管します。ハイドロゲルは4~10°Cの液体で、より高い温度で固化します。</li>
	<li>200 μLの培養培地を用いて、各レシピエントに対して、各レシピエントに対して、1.5 mL遠心管(ステップ1.13のように)を200μLの培養培地で選び、移植の準備ができるまで氷の上に置いてください。</li>
	<li>75%エタノールを用いてレシピエントの左のイングイナル領域をスワブする。それを上方に置き、外科テープを使用して4つの肢を固定する。電気バリカンで外科現場の周りの髪を剃り、ヨードファーで領域を綿棒。</li>
	<li>この領域に眼科用ハサミと非侵襲的な微小間を用いて垂直皮膚切開を行い、ISWATの下腕幹動脈および静脈を特定し、血管の上に小さなポケットを作る。</li>
	<li>200 x gで30sの小島チューブを回転させ、できるだけ上清を取り除く。完全に解凍されたヒドロゲルの20μLを吸引し、それを小島と共に管に積み込む。気泡を避け、穏やかに小島を再中断します。</li>
	<li>200 μLピペットチップを持つ受け手のポケット(ステップ2.7)にチューブ内の全体のアイレットヒドロゲル混合物を送ります。 注:このプロセスには、非侵襲的なマイクロティセザーを使用してポケットの端を拾うための技術者と、ポケットに小便座の混合物を送り込む2人の技術者が必要です。</li>
	<li>20 μLのセファロスポリン(~5~10mg)を、小島ヒドロゲル混合物が完全に固化した後に移植部位に加え、5-0の外科用縫合糸を使用して連続縫合法で筋肉と皮膚を閉じます。 注:ヒドロゲルは、体温のために固めるために約3分を必要とします。</li>
	<li>受信者を清潔なケージに入れ、サーマルパッドを使用して暖かく保ちます。受信者が完全に回復し、自律的に移動を開始するまで監視を続けます。その後、0.1 mg/Kg用量に従って、0.03 mg/ml ブプレノルフィンを滅菌生理食塩水で腹腔内投与する。</li>
	<li>各受信者マウスに対して、ステップ 2.3 ~ 2.11 を繰り返します。</li>
	<li>最初の月の週に3~4倍、その後1週間で1~1xのレシピマウスの非空腹血糖レベルを測定します(ステップ2.2のように)。</li>
	<li>フォローアップの終わり(移植後100日目)に、麻酔下(ステップ2.3のように行う)の下で、ステップ2.6に記載の無菌工程に続いてレシピエントから移植片を持つISWATを切除する。ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)の染色およびインスリンおよびグルカゴンの免疫蛍光の組織学的プロトコルに従ってホルマリンおよびパラホルムアルデヒドで組織を固定する。</li>
	<li>セファロスポリンを追加し、ステップ2.10のようにレシピエントの切開を閉じ、ステップ2.11のように回復の準備をします。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは利益相反を報告していない。

膵臓膵島移植は、T1DMを治療するための有望な治療法です。この療法の効果は多くの要因によって影響を受け、小便座移植のための最適な部位を選択することは非常に重要である。この小便座移植の理想的な解剖学的部位には、単純な移植、生検、移植片の検索手順に対するアクセス性があります。合併症を減らしました。血糖コントロールの高い成功率;そして、小口移植片15、16の長期生存。
私たちのチームは以前、マウスモデル17の大分体における小分けの小分けの小口移植のためのプロトコルを説明しました。大分では、正常な血糖値は、腎臓カプセル下の小便移植と比較して後に達成された。その結果、小島を移植するための他の部位が探索された。
ISWATは、肝臓14での移植と比較してレシピエントの高血糖を逆転させるのに必要な小さい小便島として、肝臓の代替部位と...

国際糖尿病連盟(IDF)1の統計データによると、1型糖尿病(T1DM)の世界的な発生率と罹患率は急速に上昇しています。Islet移植は、T1DM4を治療するための最も有望なアプローチの1つである。エドモントンプロトコル2を用いた臨床島移植で行われた大きなブレークスルーが報告されていたので、5年後のT1DMレシピエントにおける機能性のスチーム移植片生存率は現在約50%3に達する。
これまで、肝臓、腎臓カプセル、脾臓、筋肉内領域、皮下空間、骨髄、およびオーメンタルポーチなどのいくつかの移植部位が実験的なポレット移植5、6、7について検討された。上記のサイトのいくつかは臨床設定8でテストされています。肝臓への小便の移植は現在9の臨床応用において最も広く用いられている方法であるが、この部位を使用する場合に対処すべきいくつかの重要な問題がある。例えば、即時血液媒介性炎症反応(IBMIR)および酸素供給不良10、11によって引き起こされる移植された小島の早期喪失を低減する方法、および必要に応じてこの島移植片を取り出す方法は、肝臓にびらんに局在化するためである。腎カプセルはげっ歯類のレシピエントにとって理想的な部位である可能性があります。しかし、タイトな腎臓カプセルは、ヒトにおける十分な同種間血島の移植を制限し、臨床的に使用される高度に精製されたブタ島の製剤に起因する異種移植に適している可能性があるが5、12。従って、より適した部位を探して、このサイトを、小便の移植が進んでいる。
皮下腔は、そのアクセス性のために、小便座移植のための臨床的に適用可能な部位として使用され得る。しかしながら、皮下空間への小島移植の効率は極めて低く、したがって高血糖13を逆にするために比較的多数の島を必要とする。最近、日本の研究チームは、ISWAT、肝臓14と比較してマウスモデルでの小便移植に優れた新しい皮下サイトを発見しました。ISWATは上胃動脈および静脈を含むので、豊富な血液供給は、小便移植片の再血管再生を保証することができる。本稿では、ISWATにおける同系マウス島の固定に基質膜マトリックスヒドロゲルを用いた容易な移植方法を提案する。このプロトコルは、小便の移植に有効であることが証明されています。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上 μ;m シリンジ駆動フィルターユニット</td><td>メルクミリポア</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 遠心分離管</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>5 mL パスツールピペット</td><td>JingAn Biological, China</td><td>J00085</td><td></td></tr><tr><td>5 mL syringe</td><td>Szboon, China</td><td>20170829</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>5-0 surgical suture</td><td>sh-Jinhuan,中国</td><td>CR537</td><td></td></tr><tr><td>60 mL シリンジ</td><td>Szboon, 中国</td><td>20170623</td><td></td></tr><tr><td>75% エタノール</td><td>LIRCON, 中国</td><td>9180527</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗マウス IgG(H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>希釈 (1:200)</td></tr><tr><td>抗マウスグルカゴン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab10988</td><td>希釈 (1:100)</td></tr><tr><td>抗マウスインスリン抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3014s</td><td>希釈 (1:100)</td></tr> <tr><td>鈍角灌流針</td><td>オロイ、中国</td><td>005</td><td>32G、黄色</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Meilune、中国</td><td>MB4219</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 マウス</td><td>広東省</td><td></td>医療動物センター <td>8~10 週間</td></tr><tr><td>細胞培養皿</td><td>BIOFIL、中国</td><td></td><td>TCD000100 一般、未処理、直径 87.8 mm</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>cephalosporin</td><td>Lukang medical,</td><td>China 150303</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0422</td><td></td></tr><tr><td>Codos Pet Clipper</td><td>Szcodos, China</td><td>CP-8000</td><td></td></tr><tr><td>collagenase Type V</td><td>Sigma</td><td>C9262</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-hank's buffer</td><td>Coolaber, China</td><td>PM5140-10</td><td></td></tr><tr><td>dithizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4263</td><td></td></tr><tr><td>Eosin staining media</td><td>Beyotime Biotech, China</td><td>C0109</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30084</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセインジアセテート (FDA)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F1303</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMIL</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングピペットチップ</td><td>コーニング</td><td>CLS4884</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>クーラバー、中国</td><td>PM5150-10</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン染色培地</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>14166S</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1077</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>RNBG0522</td><td></td></tr><tr><td>HISTOPAQUE-1119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RNBG0536</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Basement Membrane</td></tr><tr><td>Matrix Iodophor</td><td>LIRCON、中国</td><td>5190313</td><td></td></tr><tr><td>光密培養皿</td><td>DVS、中国</td><td>AN-5058548</td><td>自作、ガラス皿 黒色塗料をスプレー</td></tr><tr><td>医療粘着テープ</td><td>Cofoe、中国</td><td>K12001</td><td></td></tr><tr><td>非侵襲的マイクロピンセット</td><td>RWD ライフサイエンス</td><td>F11033-11 および F12016-15</td><td></td></tr><tr><td>ワンタッチ超簡単 基本血糖モニタリングシステム</td><td>ジョンソン &ジョンソン</td><td>33391713</td><td></td></tr>眼<tr><td>科用ハサミ</td><td>RWD ライフサイエンス</td><td>S12012-12 および S11001-08</td><td></td></tr><tr><td>P/S (ペニシリン/ストレプトマイシン)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-010</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>STZ (ストレプトゾトシン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>テストストリップ</td><td>GenUltimate</td><td>100-50</td><td></td></tr><tr><td>TRITC標識ヤギ抗ウサギIgG(H+L)</td><td>プロテインテック</td><td>SA00007-2</td><td>希釈(1:200)</td></tr><tr><td>血管クランプ</td><td>RWD ライフサイエンス</td><td>R31006-04</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス島の口内皮下白色脂肪組織(iswat)移植モデル

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

膵島移植は、1型糖尿病に対する十分に確立された治療療法である。腎臓カプセルは、げっ歯類モデルにおける小便の移植に最も一般的に使用される部位である。しかし、タイトな腎臓カプセルは、大型動物およびヒトにおける十分な小島の移植を制限する。新しい皮下空間である創尿下白脂肪組織(ISWAT)は、小便座移植にとって潜在的に貴重な部位であることが判明した。このサイトは、他の皮下空間よりも優れた血液供給を有する。また、ISWATは、腎臓カプセルよりも大きな小便の質量を収容し、それに移植することは簡単である。本稿では、同系糖尿病マウスレシピエントのISWAT部位におけるマウスの膵野の分離および移植の手順について説明する。このプロトコルを用いて、マウス膵島を、ISWAT部位の精製された小島を固定するために標準的なコラゲナーゼ消化および基質膜マトリックスヒドロゲルによって単離した。レシピエントマウスの血糖値を100日以上モニタリングした。この座子移植片は、組織学的分析のために移植後100日目に回収した。本稿に記載されているISWATサイトにおける、このサイトにおける小便の移植に関するプロトコルは、簡素で効果的である。

このプロトコルでは、マウスのマウスの準備と ISWAT サイトへの小便の移植の 2 つの手順が導入されています。第1の手順では、ヒストモメ-1119およびヒストモメ不全-1077および追加の手摘みステップで精製するV型コラゲターゼ溶液を浸透させ、消化した後、単離されたマウス島は移植のために十分に純粋である(図1に示すように)、そして生存率が高い孤立した島を移植に使用する(図2参照)。第2の手順では、STZ化学物質による糖尿病誘導が重要である。STZの最適用量は、マウスの株と年齢に依存し、糖尿病の成功した誘導は、2つの連続した日に同時に16.7 mmol /L以上の非高速血糖レベルによって定義される。糖尿病マウスは、数週間の膵の移植なしで生き残ることができます.ISWAT部位に移植される前に、この小片移植片をヒドロゲルと完全に混合し、移植片をIWSATに固定するために数分を通過する必要があります(図3)。ISWATに移植すると、この血小移植片は約1ヶ月間高血糖を...

このプロトコルでは、マウスの小口分離および、皮下白色脂肪組織への移植の方法が記載されている。単離された同系マウス島は、基質膜ヒドロゲルを用いてマウスレシピエントに移植される。レシピエントの血糖値をモニターし、そして、血小移植片のヒストロジー分析を行う。

マウス島の口内皮下白色脂肪組織(ISWAT)移植モデル

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

小子移植は、I型糖尿病を治療するための最も有望なアプローチの1つです。そして、小地移植に適した場所の探索が進行中です。皮下白脂肪組織への小子移植は、臨床的な意味を持つ可能性のある単純でありながら効果的な方法である。この手順をクリニックに外挿すると、I型糖尿病患者の治療法が開発される可能性があります。この方法は、言語が小地の生着のための理想的な部位ではないと判断されたように、臨床小地移植への洞察を提供することができる。手順のすべてのステップ、特に膵臓消化などの重要なステップに注意深く従うことが重要です。視覚的なデモンストレーションは、この技術に新しい研究者が、小口分離と突然変異を実行する方法をより良く決定するのに役立ちます。小地の収穫のために、最初に75%エタノールで10週齢のC57ブラックシックスマウスの毛皮をスプレーし、5ミリリットルのシリンジに作りたてのコラゲラーゼ溶液を充填します。32ゲージの曲げ鈍い尖った灌流針を注射器に装備し、マウスをアイスバッグの上のスペピンの位置に置きます。まっすぐ尖った眼科のはさみを使用して陰部の皮膚に横の開口部を作り、切開を動物の頭部に向かって伸ばします。恥部からxiphoidプロセスへのV-切開を介して腹部を完全に開き、胆嚢および共通胆管の全長を露出させるために肝臓を動かす。次に、血管クランプを使用して、共通の胆管の十二指腸開口部を閉じ、胆嚢の小さな開口部を切断します。以前に準備した灌流針で開口を通して共通の胆管をカンニュレートし、約2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液を膵臓に注入する。すべてのコラゲナーゼが送達されたら、2組の非侵襲的なマイクロピンセットを使用して、浸透した膵臓を腸、胃、脾臓から分離し、膵臓を氷の上の50ミリリットルの円錐形チューブに入れます。すべてのサンプルが採取されたら、膵臓1個につき100マイクロリットルのDnaSEを50ミリリットルチューブに加え、10秒間にわたって各チューブを約40回激しく振ってから、適度な揺れで3〜5分間37度の水浴に入れます。インキュベーションの最後に、消化を阻止するためにストップソリューションの50ミリリットルの最終体積に追加します。そして、速く遠心分離機を停止する前に、摂氏4度で750倍Gの速度にチューブをパルス遠心分離します。上清を捨て、ちょうど実証したように同じ遠心状態で洗浄1回15〜25ミリリットルのストップ溶液でペレットを2回洗浄します。2回目の洗浄後、チューブあたり3つのペレットを新しい50ミリリットル円錐形チューブにプールします。そして、ヒスト不透明1119の10ミリリットルの総体積で膵臓細胞を再懸濁する。次に、各チューブの側面にヒスト不透明な1077の5ミリリットルを慎重に追加し、その後に5ミリリットルのHBSSを追加します。遠心分離によって細胞を分離し、HBSSヒスト不透明1077インターフェイスから小島を収集するために5ミリリットルパスツールピペットを使用しています。新しい50ミリリットルの円錐形チューブに小島を50ミリリットルの最終体積のストップソリューションでプールしてパルス遠心分離を行い、上清を捨てます。ペレットを30ミリリットルの新鮮な停止溶液で1分間の遠心分離のために再懸濁し、30ミリリットルの培養培地で島を再懸濁する。小島をチューブあたり10センチメートルの軽密培養皿にデカントします。そして、ステレオ顕微鏡の下に皿を置きます。200マイクロリットルのゲルローディングピペットチップを使用して、溶液から白い回転楕円体小島を手で選びます。10ミリリットルの培養培地を収穫する際に、未処理の細胞培養皿に小島を入れる。軽顕微鏡でジチゾン染色することにより、手摘み小島の純度を確認します。フロレス化顕微鏡下でヨウ化プロピジウム染色をしたフルオレセイン・ジアセテート・ジアセテートで、小島の生存率を検出した。その後、分離した島を95%の空気で摂氏37度、移植まで5%の二酸化炭素で新鮮な培養培地で培養する。糖尿病誘導後3日目と4日目から、各レンサプトゾトシン注射8週齢8週間齢の雄C57黒6マウスの尾静脈を10:00a.m頃に穿刺し、各レシピエント動物から血液サンプルを採取する。基本的な血糖値モニタリング器具を使用して、各マウスの非空腹時血糖値を決定し、個々のテストストリップに血液を追加します。動物が2日連続で1リットル当たり少なくとも20ミリモルの血糖値を実証した場合、レシピエントマウスの体重を量ってマークし、麻酔動物のペダル反射に対する応答の欠如を確認する。解凍のために氷の上にマイナス20度の摂氏貯蔵からヒドロゲルのアリコートを置きます。そして、1回の受取人あたり450〜500の島分を、氷上のチューブあたり200マイクロリットルの培地を含む無菌1.5ミリリットル遠心管に移します。レシピエントの左のインジナル領域を75%エタノールでスワブし、マウスをスピーヌ位置に置きます。手術用テープで手足を固定し、バリカンを使用して外科現場の周りの毛髪を取り除きます。ヨードファーで手術領域をスワブし、感染した皮膚に垂直切開を行います。ISWAT内の下側の上頭動脈と静脈を特定し、血管の上に小さなポケットを作成します。遠心分離によって島を沈降し、できるだけ多くの上清を除去する。各チューブに解凍したヒドロゲルを20マイクロリットル加え、気泡を避けるように注意して小島を静かに再中断します。均質な懸濁液が得られたら、200マイクロリットルのピペットチップを使用して、1本のチューブから小水ゲル混合物全体を慎重にポケットに送り込みます。ヒドロゲルが完全に固まったら、移植部位に20マイクロリットルのセファロスポリンを加え、筋肉と皮膚を5-0連続外科的縫合で閉じる。その後、完全な債務まで監視と熱パッド上のきれいなケージに受信者を配置します。マウスの小便処理が実証された後、分離されたマウス小子は移植のために十分に純粋になります。移植には生存率の高い孤立した島のみを使用する必要があります。ヒドロゲルとの小葉移植片の完全な混合の後、移植片はISWAT部位に移植することができる。ISWATへの移植の約1ヶ月後、杯は、レシピエントマウスの体重が徐々に増加しながら、逆高血糖を移植する。移植後100日で、移植片の除去は10:00 a.mの即時増加をもたらす。非空腹時血糖値.この時点での組織学的分析は、小地移植片がそのまま残っていることを明らかにする。インスリンおよびグルカゴン免疫蛍光染色とは、移植後100日で移植された小島も機能していることを示している。あまりにも堅牢に、または取得した膵島の能力が損なわれるように、多用膵臓細胞を振り回さないように注意してください。孤立した小島は、部位での皮下白脂肪組織への単離された移植の効果を比較するコントロールとして腎カプセルの下に移植することができる。この手順は、肝臓以外の他の部位に小口移植の臨床試験の開始を追加します。.

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マウス島の口内皮下白色脂肪組織(ISWAT)移植モデル

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