Name: ヒト多形核白血球に対する黄色ブドウ球菌の細胞毒性の定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: 学ぶヒト多形核白血球の精製法とStaphylococcus aureus細胞毒性測定アッセイ。遠心分離と密度勾配法でPMNを分離し、フローサイトメトリーで解析する。宿主病原体相互作用研究に応用可能。

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この研究は、米国国立衛生研究所NIH-1R56AI135039-01A1、1R21A128295-01、U54GM115371、モンタナ州立大学農業試験場からの資金、マードック慈善信託からの設備交付金によって支援されました。.

健康なドナーからのヘパリン化静脈血は、モンタナ州立大学のヒト被験者のための機関審査委員会によって承認されたプロトコルに従って収集されました.すべての寄付者は、この研究に参加することに書面による同意を提供した。
1. ヒト多形核白血球の精製とヒト血清の単離
注:すべての試薬は、市販のエンドトキシン検出キットを使用してエンドトキシンの存在を定期的にチェックする必要があり、PMNの不要なプライミングを防ぐために<25.0 pg/mLエンドトキシンを含める必要があります。
<ol><li>3% デキストラン-0.9% NaCl (w/v)の 50 mL、0.9% NaCl (w/v)の 35 mL、1.8% NaCl (w/v)の 20 mL、1.077 g/mL 密度勾配溶液の 12 mL、および 20 mL の注入または灌漑グレードの水を室温に持ち込みます。</li>
	<li>ヒト血清を単離するには、15mLガラス管内の37°Cで抗凝固剤を用いない新鮮に引き出されたヒト血液の4mLを30分間15mLのガラス管でインキュベートする。インキュベーション後、室温で10分間2,000~3,000×gで遠心分離試料を行う。上部血清層を新鮮な15 mL円錐円錐遠心管に移し、氷の上に置きます。</li>
	<li>25 mL の新鮮なヘパリン化 (1000 単位/mL) 全ヒト血液を 25 mL の室温 3% デキストラン -0.9% NaCl (1:1 比) で 2 つの反復 50 mL 円錐形遠心管 (チューブあたり 50 mL 総容積) を組み合わせます。各50mL円錐形チューブを穏やかに揺らして混ぜ、30分間室温で放置します。</li>
	<li>室温でインキュベーションすると、2つの別々の層が表示されます。各デキストラン血混合物の最上層を新しい50mL円錐管に移し、450 x gで低いまたはブレーキなしで室温で10分間遠心分離機を移す。</li>
	<li>慎重に両方の上清を吸引し、細胞ペレットを邪魔することなく廃棄します。室温0.9%NaClの2 mLで各細胞ペレットを穏やかに再懸濁し、再懸濁ペレットを単一の50 mL円錐管に組み合わせ、残りの0.9%NaCl(35mLの最終容積)を加えます。</li>
	<li>慎重にハンドピペットを使用して、セル懸濁液の下に1.077 g/mL密度勾配溶液の室温10 mLを下敷き。450 x gでスピンし、ブレーキが低いかブレーキなしで室温で30分間回転します。細胞ペレットを邪魔することなく、上清を穏やかに吸引する。上清は、先に説明した14のように回収できる末梢血単核細胞を含有する。</li>
	<li>室温の水の20 mLで細胞ペレットを再サスペンドすることによって赤血球をリスする。30sのためにチューブを揺らして穏やかに混ぜます。赤血球のリンパは濁度の明確な減少を伴うであろう。</li>
	<li>直ちに1.8%NaCl(室温[RT])の20 mLを加え、450×gで遠心分離試料を室温で10分間加えます。 注:PMNの収率を最大化し、PMNリシスおよび/または活性化を防ぐために、赤血球リシスの後にPMNが単独で水中に残される時間を最小限に抑することが重要です。</li>
	<li>細胞ペレットを邪魔することなく、慎重に上清を吸引します。細胞ペレットをRT RPMI 1640培地の2mLで軽く再サスペンドし、氷の上に置きます。</li>
	<li>ヘモサイトメーターを使用して細胞をカウントします。精製されたPMNを氷冷RPMIで1 x 107セル/mLの濃度で再サスペンドし、氷の上に置いておきます。</li>
	<li>精製PMN(1 x 106細胞)の100μLと、2つの反復フローサイトメトリーチューブに1μLのヨウ化プロピジウム染色を含む300°Lの氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を組み合わせます。血漿膜損傷に対する陽性制御を行うには、40μLの0.5%Triton X-100溶液をフローサイトメトリーチューブの1つに加え、十分に混合します。</li>
	<li>フローサイトメトリーを使用して、精製細胞の前方散乱、側散乱、およびヨウ化プロピジウム染色(535/617 nmでの励起/発光最大値)を測定します(図1)。 注:前方および側面散乱解析は、リンパ球および単球の望ましくない集団を同定する。ヨウ化プロピジウムは、妥協した形質膜を有する細胞を染色し、ヨウ化プロピジウム陽性細胞の集団を顕著にした精製PMNのみを使用すべきではない。これらの研究では、精製PMNは、精製された細胞の>98%とヨウ化プロピジウムに対して<5%染色陽性を含む場合にのみ使用された。</li>
	<li>DPBSで希釈した20%単離ヒト血清の100μLでこのアッセイに使用される個々のウェルをコーティングすることにより、PMN細胞傷害性アッセイ用の96ウェルプレートを準備します。 メモ:PMNをプラスチックまたはガラスに直接めっきすると、細胞が活性化します。メディアのみを受信する少なくとも 1 つの負のコントロールウェルと、0.05% Triton X-100 を受け取る少なくとも 1 つの正のコントロールウェルを含めてください。</li>
	<li>プレートを37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、コーティングした井戸を氷冷DPBSで2回洗浄し、余分な血清を除去します。プレートを上下逆さまに軽くタップして、残留DPBSを取り除き、氷の上に置きます。</li>
	<li>精製されたヒトPMNを1 x 107セル/mLで100μLをコーティングされた各ウェル(1 x 106 PMN/ウェル)にゆっくりと加えます。PMNが少なくとも5分間氷上のプレートをインキュベートして井戸に沈着することを許可します。</li>
</ol>2. ヒト多形核白血球に対するS.アウレウス細胞外タンパク質の細胞毒性アッセイ
<ol><li>培養S.アウレウスは、37°Cに設定された振とうインキュベーターを用いてトリプティック大豆スープ(TSB)で一晩培養する。これらの研究では、別々の150 mLエルレンマイヤーフラスコ中のTSBの20mLを、S.アウレウス株USA300またはUSA300ΔsaeR/Sの凍結培養物で接種し、250rpmで振とうして約14時間成長させた。</li>
	<li>サブカルチャー S.アウレウスは、新鮮な媒体を用いて一晩の細菌培養の1:100希釈を行った。細菌が早期の静止成長期に達するまで振とう37°Cでインキュベートする。 注:これらの実験では、150mLエルレンマイヤーフラスコ中の20mLのトリプティック大豆ブロスを、一晩培養したUSA300またはUSA300ΔsaeR/Sの200μLで接種し、5時間250rpmで振としながら37°Cでインキュベートした。</li>
	<li>細菌が早期の静止成長期に達したら、1mLのサブカルチャー S.aureusを1.5mLマイクロ遠心管に移し、室温で5分間5分間5,000×gで遠心分離機を移す。 </li>
	<li>遠心分離後、上清を3mLシリンジに転写する。0.22μmフィルターを通して上清を渡し、氷上の新しい1.5 mLマイクロ遠心管に入れます。</li>
	<li>S.アウレウスの培養に使用される氷冷媒体を用いて上清の連続希釈を行う。 注:示された実験のために、USA300およびUSA300ΔsaeR/Sからの上清は氷冷TSBとの4つの連続した1/2ログ希釈を受けた。</li>
	<li>ステップ1.15の氷上のPMNを含む96ウェルプレートの個々のウェルに、上清サンプルまたはメディアのみを(負および正のコントロールの場合)ゆっくりと追加します。これらの実験のために、USA300またはUSA300ΔsaeR/S上清サンプルの10μLを各ウェルに添加した。穏やかにロックプレートは、井戸に上清を配布し、37°でインキュベートします。</li>
	<li>希望の時間に、インキュベーターからプレートを取り出し、氷の上に置きます。正のコントロールによく0.5%トリトンX-100の40 μLを加えます。</li>
	<li>各ウェルでサンプルをゆっくりと上下にピペットし、プレートに付着したすべてのPMNを完全に取り除き、300μLの氷冷DPBSを含む氷上のサイトメトリーチューブをフローするようにサンプルを移します。</li>
	<li>フローサイトメトリーを用いてヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合を測定する(図2A)。DNAに結合すると、ヨウ化プロピジウムは535/617 nmで励起/放出を有する。</li>
</ol>3. 食細胞症後のヒト多形核白血球に対するS.アウレウス細胞毒性アッセイ
注:600 nm(OD600)の光学密度で定義された成長曲線と細菌の濃度は、このアッセイを開始する前に試験されるS.アウレウス株のために経験的に決定されなければならない。これらの実験の成功は、サブ培養細菌のOD600を使用して中等指数成長期に試験された各S.aureus株の等濃度の一貫した収穫を必要とする。
<ol><li>ステップ2.1.1および2.1.2に記載されているように、S.アウレウス株およびサブカルチャー細菌の一晩培養を開始する。</li>
	<li>1mLのマイクロ遠心管に1mLの培養細菌を移し、室温で5分間5,000×gで遠心分離することにより、培養中指数成長に達した場合にサブカルチャー S.アウレウスを収穫した。 注:当社の成長条件下では、USA300およびUSA300ΔsaeR/Sは、インキュベーション6の約135分後に中等指数成長期に達しました。</li>
	<li>上清を吸引し、ペレット化された細菌をDPBSの1mLに再び沈下し、試料を30sでボルテックスし、室温で5分間5,000×gで遠心分離する。 </li>
	<li>オプソニゼーションS.アウレウスは、DPBSで希釈した20%ヒト血清の1mLで細菌ペレットを再懸濁し、15分間攪拌で37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>遠心分離機は室温で5分間5,000 x gで細菌をオプソン化した。上清を吸引して遠心分離した後にS.aureusを洗浄し、ペレット化された細菌を1mL DPBSに再懸濁し、次いで細菌ペレットが完全に分解され、さらに30秒になるまでサンプルをボルテックスする。室温で5分間5,000×gで遠心分離細菌。</li>
	<li>1 mL RPMIでオプソニドS.アウレウス株を再懸濁し、細菌ペレットが完全に分解されるまでサンプルをボルテックスし、さらに30sのために氷の上に細菌を置きます。</li>
	<li>氷冷RPMIで所望の濃度にオプソニ化S.アウレウス株を希釈する。30sのための渦と氷の上に置きます。</li>
	<li>トリプティック大豆寒天に細菌の1:10連続希釈をめっきすることにより、オプソニングS.アウレウスの濃度を確認します。 注:このアッセイに使用される細菌の濃度の違いは、その後のPMN形質膜透過性(図3A)に大きな影響を与える可能性があるため、試験された各株の濃度が実験ごとに決定され、株間で同等であることは非常に重要です。</li>
	<li>ステップ1.14から氷上の96ウェルプレートのPMNに、各S.aureus株またはRPMI(正と負のコントロールの場合)の100 μL/ウェルをゆっくりと追加します。穏やかに岩板は、井戸にS.アウレウスを配布します。</li>
	<li>食細胞症を同期させるのは、プレートを500×gで遠心分離し、4°C15で8分間分間同期させる。遠心分離直後の37°でプレートをインキュベートする(T =0)。</li>
	<li>希望の時に、インキュベーターからプレートを取り出し、氷の上に置きます。正のコントロールによく0.5%トリトンX-100の40 μLを加えます。</li>
	<li>各ウェルでサンプルをゆっくりと上下にピペットし、プレートに付着したすべてのPMNを完全に取り除き、200μLの氷冷DPBSを含む氷上に細胞測定チューブを流し、ヨウ化プロピジウムを1μLで流します。</li>
	<li>ステップ2.9に記載のフローサイトメトリーを用いてヨウ化プロピジウム染色のサンプルを分析する。</li>
</ol>

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<li>Spaan, A. N., Van Strijp, J. A. G., Torres, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocidins%3A+Staphylococcal+bi-component+pore-forming+toxins+find+their+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Leukocidins: Staphylococcal bi-component pore-forming toxins find their receptors.</a> Nature Reviews Microbiology. , (2017).</li>
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<li>Nauseef, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+neutrophils+from+venous+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of human neutrophils from venous blood.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+mechanisms+used+by+Staphylococcus+aureus+to+avoid+destruction+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Insights into mechanisms used by Staphylococcus aureus to avoid destruction by human neutrophils.</a> J Immunol. 175 (6), 3907-3919 (2005).</li>
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</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

このプロトコルは、ヒト血液からのPMNの精製と、これらの重要な自然免疫細胞に対するS.アウレウスの細胞毒性を定量するためにヨウ化プロピジウムを使用する2つの異なるアッセイを記述する。これらの手順の成功は、精製されたPMNの品質と、この病原体によって産生されるS.aureusおよび細胞外タンパク質の適切な調製に依存する。PMNの単離のためには、内毒素汚染のない試薬を使用し、細胞製剤を穏やかに処理し、細胞を適切な温度に保つことによって、精製中および精製後のPMN活性化を最小限に抑することが重要です。PMNの活性化を示す徴候は、精製中および単離された細胞の5%以上がヨウ化プロピジウムに対して陽性を染色する場合に細胞の塊を含む。PMNの寿命は比較的短いため、これらの細胞はヒトの血液から単離し、同じ日に検査されなければならない。PMNは、精製後に3時間以上氷の上に放置すると、自発的なアポトーシスの徴候を示し始めます。前述したように、すべてのPMN調製物は、単離細胞の純度と完全性を確保するために、前方および側散乱のフローサイトメトリー分析とヨウ化プロピジウム染色を使用して慎重に評価することが非常に重要です。
S.アウレウスによる二成分ロイコシジンの発現は、このプロトコルに記載されたアッセイを用いて観察される侵害されたPMN形質膜完全性の大部分を担っている。これらの毒素およびフェノール可溶性モジュリンのような他の細孔形成ペプチドの発現の変化は、S.aureusの株間でヒトPMNに対する細胞傷害性の違いを生じ得る。 さらに、食細胞症アッセイにおけるPINに対するS.aureusの比率は、その後のPMN血漿膜透過性(図3A)に大きな影響を及ぼし、これらの実験では、サブカルチャー属細菌のOD600を用いて中等指数成長期に試験された各S.アウレウス株の等濃度の一貫した収穫が必要である。これらの考慮事項を考えると、細胞傷害性アッセイを開始する前に調べるすべての株の成長曲線を定義することが非常に重要です。インビトロで有意な増殖差を示す株を用いたS.オーレウス細胞傷害性を分析するためのこれらの方法は推奨しない。
USA300は、ヒトPMN15に対して高い細胞傷害性であることが知られており、この株におけるSaeR/Sの喪失は、ヒトPMN6、12を標的とする多数の二成分ロイコシジンの転写を劇的に減少させ、記載されたアッセイを用いて細胞傷害性を比較するための理想的なモデルを作る。しかしながら、異なるS.aureus単離物とこれらのプロトコルに詳細に記載されているパラメータとの間に広範な遺伝的変異があり、他のS.aureus株を試験する際にヒトPMNに対する細胞毒性に実質的な変化をもたらさない可能性がある。増殖条件、添加された上清の体積、またはPMNに対する細菌の比率を調整することは、S.aureusの他の株を使用してこれらの方法で成功するために必要とされ得る。

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Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus&#160;aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
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Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

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Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

黄色ブドウ球菌は、ヒトの疾患の広いスペクトルを引き起こすグラム陽性細菌です。この顕著な病原体は、感染の異なる側面に寄与する多数の毒性因子を産生する。これらには、S.aureusが異なるタイプの宿主組織1に付着することを可能にする表面分子、宿主免疫応答2を妨害する細胞外タンパク質、および異なるタイプの宿主細胞3を標的とする分泌毒素の配列が含まれる。本報告では、S.aureusによって産生される細胞外タンパク質の細胞傷害性をヒト多形核白血球(PMNまたは好中球)に対して定量する方法、宿主の主エフェクター細胞を先天性免疫応答とする。
PMNは哺乳類の中で最も豊富な白血球である。これらの循環免疫細胞は、常駐細胞または侵入微生物に特有の化合物によって産生される危険シグナルに応答して宿主組織侮辱の部位に迅速に募集される。これらの分子からの細胞外入力および外挿中に活性化された常駐宿主細胞との直接接触から、プライミング4、5として知られるプロセスにおけるPMNの活性化状態を増加させる。苦しんでいる組織に達したプライミングPMNは、感染の確立を防ぐために設計された重要な自然免疫応答を実行します。これらには、結合および内在化、または食細胞症、強力な抗菌化合物5の電池によって微生物破壊において立発する細胞内イベントのカスケードを引き起こす侵入微生物が含まれる。
PMNは、病原体の侵入からヒトを保護する重要な役割を果たし、S.aureus感染を防ぐために特に重要である4.しかし、この細菌は、異なるPMN機能を妨げる広範囲の毒性遺伝子を産生する。これらには、シグナル伝達分子の認識を遮断する細胞外タンパク質、宿主組織への付着防止、抗菌性化合物の産生抑制、および血漿膜完全性の侵害4が含まれる。S. aureusは、特定の環境手掛かりを認識する複数の2成分感覚システムからの集合的な入力を通じて、これらの毒性遺伝子の時間発現を調整する。SaeR/S 2成分システムは、感染時のS.アウレウス毒性遺伝子転写の主要なアップレギュレータである6,7,8,9,10,11.特に、この2成分系は、ヒトPMN12を特異的に標的とする二成分ロイコシジンの製造に重要であることが示されている。
このプロトコルは、3 つの異なるセクションに分かれています。第1セクションでは、Bøyum13およびNauseef14によって確立された方法から適応されたプロトコルを用いて密度勾配遠心分離を使用したヒト血液からのPMNの精製について説明する。第2および第3のセクションでは、S.アウレウス細胞毒性を調べる2つの異なる技術を詳述する。一方はS.aureusによって産生される細胞外タンパク質を有するPMNを中毒し、もう1つは食細胞症後にPMNに損傷を与える生菌の能力を調べる。これらの手順は、ヨウ化プロピジウムを使用して、S.アウレウス孔形成毒素によって引き起こされるPMN形質膜完全性の損失を測定する。ヨウ化プロピジウムは、通常は細胞膜不透過性であるが、S.アウレウス毒素によって破壊された形質膜を横断することができるDNA結合フルオロフォアである。フローサイトメトリー分析は、ヨウ化プロピジウム陽性PMNの迅速な定量を可能にし、S.アウレウス株の相対細胞毒性を測定する。メチシリン耐性S.アウレウス(MRSA)は、パルス場ゲル電気泳動型USA300およびこの株におけるsaeR/Sの等生欠失変異体(USA300ΔsaeR/S)として同定され、これらの手順がヒトPMNに対するS.オーレンスの細胞毒性を定量する方法を実証するモデルとして使用されている。

<table><tbody><tr><td>0.9% 塩化ナトリウム注射液、USP、500 mL VIAFLEX プラスチック容器</td><td>バクスター</td><td>2B1323Q</td><td>PMN 精製</td></tr><tr><td>スナップキャップ付き 1.5 mL マイクロ遠心チューブ スナップキャップ付き</td><td>VWR</td><td>89000-044</td><td>細胞の洗浄に使用</td></tr><tr><td>1.8% 塩化ナトリウム溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td>PMN 精製</td></tr><tr><td>12x75mm 培養チューブ</td><td>VWR</td><td>60818-430</td><td>フローサイトメトリーとして使用チューブ</td></tr><tr><td>20% (w/w) デキストラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8802</td><td>PMN 精製</td></tr><tr><td>3125 ハンドタリーカウンター</td><td>トレーサブル 製品</td><td>3125CC</td><td>細胞数計数用</td></tr><tr><td>50 mL 円錐形遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td>分注培地</td></tr><tr><td>用 バクト トリプシン 大豆ブロス、大豆-カゼイン 消化培地</td><td>フィッシャー科学</td><td>211823</td><td>細胞培養の増殖用</td></tr><tr><td>BD 使い捨てシリンジ、ルアーロックチップ付き、3 mL</td><td>FischerScientific</td><td>BD 309657</td><td>上清のろ過用</td></tr><tr><td>Bright-Line 血球計算盤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629</td><td>細胞計数装置</td></tr><tr><td>DPBS、1x (ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水)、カルシウムとマグネシウム</td><td>コーニング</td><td>21-030-CV</td><td>細胞の洗浄に使用</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>PMNの浄化</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 滅菌ポリスチレン 使い捨て血清ピペット</td><td>FischerScientific</td><td>13-678-11E</td><td>吸引液体用</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR 96ウェルプレート</td><td>ミリポアシグマ</td><td>M0687</td><td>実験サンプルを保持するためのプレート</td></tr><tr><td>オミクロン シリンジフィルター</td><td>オミクロン サイエンティフィック</td><td>SFPV13R</td><td>上清のろ過用</td></tr><tr><td>プロピジウムヨウ化</td>物<td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P3566</td><td>膜不透過性DNA染色</td></tr><tr><td>PYREXブランド4980三角フラスココール</td><td>パーマーEW-34503-24</td><td></td>成長<td>細胞培養</td></tr><tr><td>RPMI 1640、L-グルタミンなしの1X、フェノールレッド</td><td>コーニング</td><td>17-105-CV</td>細胞<td>の再懸濁に使用</td></tr><tr><td>灌漑用滅菌水、USP</td><td>バクスター2F7113PMN</td><td></td><td>精製</td></tr><tr><td>ピペットポンプ</td><td>Bel-Art製品</td><td>F37898</td>吸引<td>液体</td></tr><tr><td>用Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>膜完全性ポジティブコントロール</td></tr></tbody></table>

ヒト多形核白血球に対する黄色ブドウ球菌の細胞毒性の定量

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

黄色ブドウ球菌は、多形核白血球(PMNまたは好中球)の膜完全性を標的とし、破壊する広範囲の白血球分を分泌することができる。このプロトコルは、ヒトPMNの精製と、3つの異なるセクションにおけるPMNに対するS.オーレウス細胞毒性の定量の両方を記述する。セクション1では、密度遠心分離を用いたヒト血液からのPMNおよび血清の分離について詳述する。セクション2は、これらの精製されたヒトPMNに対してS.aureusによって産生される細胞外タンパク質の細胞傷害性を試験する。これらの手順は、細胞膜不透過性であるDNA結合フルオロフォアであるヨウ化プロピジウムで処理されたPMNのフローサイトメトリー分析を用いて、S.アウレウスロイコシジンによるPMN血漿膜完全性の破壊を測定する。総称して、これらの方法は、原発ヒトPMNに対するS.aureus細胞傷害性を迅速に試験する利点を有し、宿主病原体相互作用の他の側面を研究するために容易に適応することができる。

我々は、MRSA PFGE型USA300およびこの株におけるsaeR/Sの等生欠欠変異体(USA300ΔsaeR/S)を用いてヒトPMNに対するS.aureusの細胞毒性を比較的定量するために上記の手順を使用する方法を実証した6.このプロトコルのセクション1に記載の手順を用いて単離されたPMNをヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーを用いて調べた。前方および側方散乱プロットは、単球またはリンパ球による精製PMNの汚染を例示するために使用され(図1A、B)およびPMN完全性は、ヨウ化プロピジウム染色を用いて決定した(図1C)。ヒトPMN精製の記載された方法は、一貫して0.5 x 107〜1x 108 PMNを生み出すことができ、それは&gt;98%純粋で、&gt;95%ヨウ化プロピジウム陰性である。
USA300およびUSA300ΔsaeR/Sによって産生される細胞外タンパク質の細胞毒性を、このプロトコルのセクション2に記載された手順に従って精製PMN(図2)に対して試験した。これらの実験は、USA300によって産生される細胞外タンパク質による中毒の30分後に精製されたPMNのヨウ化プロピジウム染色における濃度依存的な増加を示す(図2B)。これまでの研究では、SaeR/S 2成分系がヒトPMN6、10、11、16を標的とする多数の二成分ロイコシジンの発現にとって重要であることを実証している。これらの以前の知見と一致して、USA300ΔsaeR/Sによって産生される細胞外タンパク質への曝露後に、ヨウ化プロピジウム陽性PMNが検出されたごくわずかである(図2B)。さらなる実験は、約30分後にめっきされたUSA300細胞外タンパク質による中毒後のリンパの割合の着実な増加を実証した(図2C)。ヒトPMNの最小リンパは、USA300ΔsaeR/Sによって産生される細胞外タンパク質への曝露後、すべての時点で指摘された。これらの結果は、ヒトPMNに対する細胞外タンパク質による細胞傷害性の相対的定量に対するこのアッセイの有用性を示す。
このプロトコルのセクション3に記載されている食細胞症に続くヒトPMNに対するS.aureus細胞傷害性アッセイを用いて、USA300およびUSA300ΔsaeR/Sを試験した(図3)。USA300の食細胞症後90分でヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合の濃度依存的な増加が観察された(図3A)。USA300ΔsaeR/Sの食素細胞症に続いてヨウ化プロピジウム陽性であったPMNの割合で有意な減少が認められた(図3A)、SaeR/Sの2成分系を示す他の結果を支持することは、ヒトPMNに対するS.aureusの細胞傷害性にとって重要である(図2)7、11。図3Aで既に述べたように、S.aureus濃度の違いは、食細胞症後のPMNリシスに顕著な影響を及ぼす。これらの各実験で使用されたUSA300およびUSA300ΔsaeR/S接種の列挙は、これらの株間の細胞傷害性のコントラストが使用される細菌の濃度の違いによるものではないことを実証した(図3B)。これらの知見は、食細胞症後のヒトPMNに対するS.オーレウス細胞傷害性アッセイを、ヒトPMN血漿膜完全性を損なう異なるS.aureus株の能力を評価するためにどのように使用できるかを示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig1.jpg"> 図1:精製PMNのフローサイトメトリー分析(A)精製ヒトPMNおよび(B)PMNの代表的なフローサイトメトリードットプロットは、末梢血単核細胞で意図的に汚染された。(C) 代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、最小限のヨウ化プロピジウム染色を実証する(&lt;1%)0.05% Triton X-100 (赤色のシェーディング) で処理された PMN と比較して、精製 PMN (シェーディング グレー)の。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig2a.jpg"> 図2:S.アウレウスによって産生される細胞外タンパク質に酔い込んだPMNのフローサイトメトリー分析(A)代表的なフローサイトメトリーヒストグラムは、メディアコントロール(シェーディングブルー)によるインキュベーションの30分後にヨウ化プロピジウムで染色されたPMNのサイトメトリーヒストグラム、1:110(シェーディンググレー)の最終濃度でUSA300上清を濾過し、または0.05%トリトンX-100(陰の赤い陰の)を濾過した。(B)異なる濃度のUSA300またはUSA300°s上清を有するインキュベーションの30分後のヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合。(C) ヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合は、USA300またはUSA300°sを用いたインキュベーション後の経時の割合で、最終濃度1:110でデータは、両側t検定によって決定される*p ≤ 0.05および**p ≤ 0.005を用いた少なくとも3つの別々の実験の平均±SEMとして提示される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig2alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60681/60681fig3.jpg"> 図3:S.アウレウスの食細胞症に続くPMNのフローサイトメトリー分析(A) ウサ300またはUSA300の異なる濃度の貪食後90分後にヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合は、saeR/S. (B)パネルAに示す実験に用いられるOpson化S.アウレラス株の濃度は、p≤ 0.01で4回の別々の実験の平均±SEMとして提示される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60681/60681fig3alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、全ヒト血液からの多形核白血球の精製方法と、これらの重要な自然免疫細胞に対する黄色ブドウ球菌の細胞傷害性を定量化する2つの異なるアッセイについて説明する。

Staphylococcus aureus is capable of secreting a wide range of leukocidins that target and disrupt the membrane integrity of polymorphonuclear leukocytes ...

黄色ブドウ球菌は、病因を促進する広範囲の毒性因子を産生するグラム陽性細菌である。これらには、PMNまたは好中球とも呼ばれる多形核白血球の膜完全性を破壊する二成分ロイコトキシンが含まれる。このビデオは、ヒト全血からのPMNの分離と、これらの重要な自然免疫細胞に対するS.aureus細胞毒性を定量化するための2つの異なるアッセイを示しています。これらのアッセイはすべて標準的な実験室装置によって達成され、宿主病原体の相互作用の他の側面を調べるために容易に適応可能である。これらの実験は、ヒトドナーから引き出された全血を使用し、適切な機関委員会または審査委員会からの承認と、すべての参加者からインフォームド・コンセントが得られたという声明を必要とする。この手順の最初のステップは、遠心分離と密度勾配の使用による好中球の分離です。まず、50ミリリットルの3%デキストラン0.9%塩化ナトリウム、0.9%塩化ナトリウム35ミリリットル、塩化ナトリウム1.8%の20ミリリットル、ミリリットルのフィコール溶液あたり1.077グラムの12ミリリットル、水20ミリリットルを室温に持ち込みます。25ミリリットルのヘパリン化されたヘパリン化されたヘパリン化された血液を2本の円錐形遠心管に移す。25ミリリットルのヘパリン化したばかりの全血と25ミリリットルの室温、3%デキストラン、0.9%の塩化ナトリウムを1対1の比率で組み合わせます。50ミリリットルの円錐管を軽く揺らし、室温で30分間静かに動かします。室温でインキュベーションした後、2つの別々の層が現れます。各デキストラン血液混合物の最上層を新しい50ミリリットル円錐形チューブに移す。450 gで450 gの遠心分離機を室温で10分間、低いか、または無断で休憩します。慎重に上清の両方を吸引し、細胞ペレットを乱すことなく廃棄します。各細胞ペレットを0.9%塩化ナトリウムの2ミリリットルに静かに再懸濁します。再懸濁されたペレットを1つの50ミリリットルの円錐に組み合わせ、残りの0.9%塩化ナトリウムを35ミリリットルの最終体積に加えます。ハンドピペットを使用して、細胞懸濁液の下に1ミリリットル当たり1.077グラムの慎重に下敷き。室温で30分間450gで紡糸した後、低いか無く断裂して、先に示したように細胞ペレットを邪魔することなく上清を穏やかに吸引する。細胞ペレットを室温水20ミリリットルに再懸濁して赤血球をライセする。30秒間揺らすことでやさしく混ぜます。室温で10分間450gで1.8%塩化ナトリウムと遠心分離機サンプルの20ミリリットルをすぐに加えます。前に示すように慎重に吸引上清。細胞ペレットを2ミリリットルの室温RPMIで静かに再懸濁し、氷の上に置きます。マカチメーターを使用して細胞を数えます。精製したPMNを氷冷RPMIで10~7番目の細胞/ミリリットルの1倍の濃度で再懸濁し、氷の上に置きます。精製PMNの100マイクロリットルを300マイクロリットルのDPBSと組み合わせ、2つの複製フローサイトメトリーチューブに1マイクロリットルのヨウ化プロピジウム染色を含みます。ポジティブコントロールのために、フローサイトメトリーチューブの1つに0.5%トリトンX-100溶液の40マイクロリットルを加え、十分に混合します。フローサイトメトリーを使用して、前方散乱、側面散乱、ヨウ化プロピジウム染色を測定し、単離されたPMNの純度と完全性を決定します。98%を超え、95%以上のヨウ化プロピジウム陰性のPMN製剤のみを使用すべきである。通常のヒト血清の単離を概説するプロトコルについては、完全な原稿を参照してください。このアッセイで使用される個々のウェルにDPBSで希釈した20%単離されたヒト血清の100マイクロリットルを加えることによってPMN細胞傷害アッセイのための96ウェルプレートを準備する。メディアのみを受け取る少なくとも1つの否定的なコントロールと、0.05%Triton X.Incubate 37°Cでプレートを30分間摂氏37度で受け取る少なくとも1つの肯定的なコントロールウェルを含むようにしてください。インキュベーションに続いて、コード化された井戸を100マイクロリットルの氷冷DPBSで2回洗浄し、氷の上にプレートを置きます。プレートウェルから残留DPBSを取り除き、10倍の10マイクロリットルの精製ヒトPMNを、コード化された各1ミリリットル当たり7番目の細胞に穏やかに加えます。メッキされた好中球を氷の上に少なくとも5分間放置してから、以下の細胞傷害性アッセイで使用してください。このセクションでは、ヒトPMNに対してホウレウスによって産生される細胞外タンパク質の細胞毒性を定量化するアッセイについて説明します。培養S.アウレウスは、実験の前日に摂氏37度に設定された振れインキュベーターを用いて適切な培地で一晩培養する。亜培養S.aureusは、新鮮な培地で一晩細菌培養物の1〜100希釈を行うことにより。細菌が早期の静止成長段階に達するまで揺れで摂氏37度でインキュベートする。5時間の成長の後、サブカルチャーS.aureusの1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、遠心分離機を室温で5分間5,000gで送ります。遠心分離後、吸気上清。0.22ミクロンのシリンジフィルターを通して吸気した上澄み物を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに渡し、氷の上に置きます。シュタウレアスの培養に使用される氷冷培地で上清の連続希釈を行う。前述のように、氷上のPMNを含む96ウェルプレートの個々の井戸に、負と陽性のコントロールのために貸し出された上澄みサンプルまたはメディアをそっと追加します。優しく岩板を井戸に上澄み物を分配し、摂氏37度でインキュベートする。所望の時に、インキュベーターからプレートを取り出し、氷の上に置きます。各フローサイトメトリーチューブにヨウ化プロピジウム1マイクロリットルを含む氷冷DPBSの300マイクロリットルを加えます。サンプルを氷上のサイトメトリーチューブを流すために移します。陽性対照のために、フローサイトメトリーチューブに移す前に、サンプルに10%トリトンXの20マイクロリットルを加えます。フローサイトメトリーを用いて、酔っ払ったPMNのヨウ化プロピジウム染色を解析する。このセクションでは、ヒトPMNによる貪食後のS.aureusの細胞毒性を定量化するアッセイについて説明する。600ナノメートルの光学密度と細菌の濃度によって定義される成長曲線は、このアッセイで使用する前に関連するステープルアウレウス株について決定されなければならない。前述のように、S.アウレウス株および亜培養細菌の一晩培養を開始する。亜培養されたステープルアウレウスが中指数成長に達したら、培養細菌の1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、遠心分離機を室温で5分間5,000gで送り込みます。ペレットを乱さずに上清を吸引してS.aureusを洗浄し、ペレット化された細菌を1ミリリットルDPBSで再懸濁する。30秒間サンプルを渦出します。試料を室温で5分間5,000gで遠心分離する。黄色ブドウ球菌を酸化するために、まず20%ヒト血清中の1ミリリットルで細菌ペレットを再懸濁する。その後、15分間攪拌して摂氏37度でサンプルをインキュベートします。前に示したように遠心分離後に酸化された黄色ブドウ球体を洗浄する。希薄化された黄色ブドウ球菌株は、10〜8番目のコロニー形成単位、1ミリリットル当たりのCFUs、氷冷RPMIを有する。30秒間サンプルを渦し、氷の上に置きます。これらのアッセイに使用される黄色ブドウ球菌の濃度を確認するには、寒天上の細菌の1~10の連続希釈液をめっきして確認します。ステップ1.14から氷上の96ウェルプレートのPMNに、各ステープルアウレウス株のウェルあたり100マイクロリットル、または正と負のコントロールのためのRPMIを穏やかに加えます。静かに岩板は、ウェルにステープルアウレウスを分配します。摂氏4度で8分間500gの遠心板で食肉食症を同期させ、遠心分離直後に摂氏37度でインキュベートプレートを時間ゼロにします。所望の時点で、氷の上にプレートを置き、各フローサイトメトリーチューブに1マイクロリットルヨウ化プロピジウムを含む氷冷DPBSの200マイクロリットルを追加し、対応するチューブにサンプルを転送します。2.8および2.9に記載されているようにフローサイトメトリーを用いてヨウ化プロピジウム染色のサンプルを分析する。ステープルアウレウスによってヒトPMNを標的とする2成分ロイコトキシンの転写には、SAまたはS2成分システムがヒトPMNに対するステープル・アウレウス細胞毒性を定量化するための記述されたアッセイの有用性を実証する必要がある。これらの実験は、この株においてSAまたはSのソロ原性欠失変異体においてUSA300として同定された臨床的に関連するステープル・アウレウス分離株で行った。左側のパネルは精製されたPMNを示し、右側のパネルは意図的に汚染されたサンプルを例として描写しています。このプロトコルのセクション1で説明した手順を用いて分離されたPMNをヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーを用いて調べた。フォワードおよびサイド散乱プロットは、1Aおよび1B年の単球またはリンパ球による精製PMNの汚染を検出するために使用された。ヒトPMN精製の記載の方法を用いることによって、98%純粋で95%以上のヨウ化プロピジウム陰性である8番目のPMNに10〜10倍の5倍の10から1回を一貫して分離することができる。USA300およびAsaeR/S変異体によって産生された細胞外タンパク質の細胞毒性を、精製PMNに対して試験した。これらの実験は、USA300によって産生された細胞外タンパク質による30分間の中毒後の精製PMNのプロピジウムヨウ化物染色の濃度依存性の増加を示すが、AsaeR/S変異体では得られていない。さらなる実験は、約30分後に高原したUSA300細胞外タンパク質による中毒に続くヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合の着実な増加を示した。ヒトPMNのヨウ化プロピジウム染色は、AsaeR/S変異体によって産生される細胞外タンパク質への暴露後のすべての時点で注目された。最後に、同期食作用後のPMNに対するUSA300およびAsaeR/S変異体の細胞毒性が試験された、USA300の貪食後90分のプロピジウムヨウ化プロピジウム陽性PMNの割合の濃度依存性の増加が観察された。AsaeR/S変異体の貪食症に続く陽酸プロピジウム陽性のPMNは有意に少なかった。これらの実験のそれぞれでUSA300およびAsaeR/S変異型接種の列挙体は、これらの株間の細胞毒性のコントラストは、使用される細菌の濃度の違いによるものではないことを示した。このプロトコルは、これらの自然免疫細胞に対するS.aureusの細胞毒性を定量化するための2つの異なる技術におけるヒト血液からのPMNの精製を記述する。これらの手順の成功は、精製されたPMNの品質とステープルアウレウス細菌または上清の適切な調製に依存します。これらの手順を実行する際に考慮すべき重要な点については、原稿全文をご参照ください。USA300は毒性のMRSA単離であり、AsaeR/Sの損失は、ヒトPMNを標的とする毒性因子の転写を劇的に減少させ、これらの株は記述されたアッセイを用いて細胞毒性を比較するための理想的なモデルを作る。成長条件、添加される上清の量、またはPmNに対する細菌の比率を調整することは、黄色いアウレウスの他の株を使用する場合に必要とされる場合があります。

quantifying-cytotoxicity-staphylococcus-aureus-against-human

Research

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