条件Cas9安定化を用いた遺伝子機能評価のための新しいツールキット

この方法は、高速な温度制御CRISPR-Cas9遺伝子編集を低分子Shield-1の下で提供します。また、Cas9の構成的活性化と比較すると、オフターゲット効果が少なく、細胞毒性が低く、また内部で制御された遺伝子編集も高くなります。この粒子の主な利点は、腫瘍生存遺伝子と同様に、必須遺伝子の特性評価に使用できることである。

DD-Cas9の不安定化は、その発現とは無関係であり、これにより、同じプロモーターの下で関心のある遺伝子を共発現させることができます。この方法は、インビボおよびインビトロ研究に容易に適用することができる。Shield-1はまた、血液脳関門を貫通することができ、脳の発達に関与する遺伝子を研究することも容易になります。

10%濾過されたFBSで10ミリリットルのグルコースDMEMを使用することにより、10センチメートル組織培養プレートあたり1〜200万個の密度で健康なHEK293T細胞を均等に播種します。20時間の間、5%の二酸化炭素と37°Cで組織培養インキュベーター内の細胞をインキュベートします。翌日、明視野顕微鏡で細胞が70%の合流率に達し、プレート全体に均等に分散していることを確認します。

トランスフェクションの1時間前に、最終体積10ミリリットルでメディアを交換してください。500マイクロリットルの温かい媒体との2つの管を準備する。25マイクロリットルのトランスフェクション試薬をチューブ1に加え、室温で5分間インキュベートします。

他のチューブに、プラスミドの混合物を加える。チューブ1をチューブ2と混合してトランスフェクション混合物を形成し、室温で20分間インキュベートする。トランスフェクション混合物をHEK293T細胞に滴下して加え、組織培養インキュベーターにプレートをインキュベートします。

18時間後、培地を10%FBSで10ミリリットルの新鮮なDMEMに慎重に交換し、トランスフェクション試薬を除去します。次の48時間細胞をインキュベートします。48時間後、上清を10ミリリットルのシリンジで回収し、0.45マイクロメートルフィルターを通過します。

アリコートウイルス上清とマイナス80°Cでそれを保存します。ウイルスのチターを決定するために、2つの6ウェルプレートに井戸あたり500万HEK293T細胞を播種する。両方のプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%を一晩でインキュベートし、50~60%のコンフルエンシーに達します。

翌日、6ウェルプレートのうちの1つを使用して、6つの井戸の細胞を数えます。シリアル希釈を行い、ポリブレン試薬のミリリットル当たり8マイクログラムを追加するために使用されるウイルスアリコートを解凍し、ウイルスの連続希釈のために10%FBSでDMEMを調製し、ポリブレン試薬を追加します。培地を含むポリブレンで0.1から0.0001までのレンチウイルスの10倍の連続希釈液の2ミリリットルを調製する。

6ウェルプレートから培地を取り除き、1ミリリットルのウイルス希釈液を井戸に加え、メディアだけでネガティブコントロール、100%ウイルスを持つ井戸を1つ残します。細胞を24時間インキュベートする。翌日、6ウェルプレートからウイルスに感染した培地を取り除き、10%FBSの新鮮なDMEMを2ミリリットルに変更します。

細胞を48~72時間インキュベートし、毎日蛍光顕微鏡でGFPを観察します。48~72時間後、セルを取り外し、最大バッファに再中断します。フローサイトメーターを使用してGFP発現の割合を決定し、テキスト原稿に記載された式を使用してウイルス力計を計算します。

目的の細胞株を10センチメートルプレートにプレートし、50〜60%の合流に達するために一晩インキュベートし、10ミリリットルの培養培地中のウイルス粒子の500〜2,000マイクロリットルで細胞に感染する。ウイルス培地を24時間インキュベートする。翌日、ウイルス培地を培地に変更し、フローサイトメトリーを用いてGFP陽性細胞の割合を決定する。

BD FACSAria II を使用してセルの並べ替えに GFP 陽性セルを選択します。正のセルを展開し、ストックを固定します。陽性に選択された細胞と未透過細胞を、感染後24時間、12ウェルプレートに別々にプレートします。

細胞が200ナノモルシールド-1を含む細胞培養培地にメディアを取り付けて変更するまで待ちます。プレート内のメディアをトランスデューセおよび未透過細胞に置き換え、プレートごとに2つのウェルを通常のメディアを陰性対照として残します。Shield-1をウェルに加えた後、ゼロ、2、6、12、24、48、72時間後に各ウェルからタンパク質をインキュベートして抽出します。

その後、シールド-1でメディアを残りのウェルから取り外し、通常のセルメディアに変更します。培地交換後2時間、6時間、12時間でそれらの井戸からタンパク質を収集します。Cas9タンパク質の誘導は、Shield-1の有無にかかわらず、トランスデューシングされた細胞と車両の間で発現レベルが類似することによって確認された。

Shield-1による処置の2時間後に、トランスデューシングされたA549細胞株にCas9発現の十分な誘導があり、これはShield−1の離脱後6〜12時間以内に無視できる。Shield-1処理されたA549細胞は、枯渇したRPA3タンパク質に対する抗体を用いて免疫ブロット法によって検証されたリネラサンプルに影響を与えることなく、48時間後に数減少した。遺伝子編集反転またはインデル変異は、測量ナククレアーゼアッセイを用いて確認した。

設計されたレンチウイルスベクター構築物は、同一EF-1aプロモーターの下で関心のある別の遺伝子を有する二味体系であった。修飾された蛍光タンパク質P2Aを、微量の感染細胞に添加した。mVenusタンパク質の発現は、DD-Cas9発現およびShield-1治療とは無関係に、車両およびA549導入細胞で観察された。

DD-Cas9ベクターを用いた細胞株の効率的な伝達は、レート制限ステップの1つであり、健康なHEK293T細胞を有し、その低い通過数を使用することが重要である。DD-Cas9プラスミド、包装プラスミド、およびエンベローププラスミドの比率の最適化は、最適なトランスフェクションにとって非常に重要です。しかし、それ以外にも、DD-Cas9標的細胞を安定化させるために必要なShield-1の量は、注意する必要があるものです。

Creプラスミドを備えたDD-Cas9も利用可能であり、Cre-loxシステムに基づくインビボ研究における遺伝的相互作用の研究に使用できます。