Name: 尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶ尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングを用いた乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化方法。侵襲的な手術なしに転移の数とサイズを測定し、候補遺伝子の役割を迅速に評価できます。

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私たちは、ウイルス感染と原稿の批判的な読書を支援してくれたエミリー・ノートンに感謝します。また、ライアン・カネイは、肺の画像を取得し、ケイト・E・タブベシングが肺の緑色転移の画像解析を支援してくれたことに感謝します。動物研究施設のスタッフのサポートと、このビデオの準備に関する支援に感謝します。この作品は、J.M.L.(#CCR17477184)に授与されたスーザン・G・コーメンキャリア触媒助成金によって支援されました。

著者たちは何も開示する必要はない。

メソッドの重要な手順 これは、形成する転移の数と実験の長さに大きく影響を与えることができるので、特定の細胞株とマウス株のために注入される細胞の数を最適化することが重要です(ステップ3)。あまりにも多くの細胞が注入されたり、転移が長時間増殖したりすると、転移を数え難しくして遺伝子操作の効果を評価することが困難になる可能性があります。しかし、注入される細胞が少なすぎると、転移はほとんどあるいは全く形成されないことがある。したがって、異なる数の細胞を使用して予備実験を行い、最適な数と転移が成長する時間の長さを決定する必要があります。グループ内の一貫した数の転移を保証するには、各マウスに等しい数の生存細胞を注入することが重要です。細胞はチューブとシリンジの両方に沈殿するので、細胞は注射器をロードする前に穏やかに再懸濁し、細胞懸濁液はシリンジに長時間放置してはならない(ステップ4.3.2)。細胞生存率は、細胞が懸濁液中である時間が長いほど減少するので、細胞のトリプシン化と注射の間の時間は1時間以下でなければならない(ステップ4.2.5)。気泡や細胞の大きな塊は、マウスを殺す塞栓を引き起こす可能性があるため、...

癌は世界第2位の死因1であり、転移はこれらの死亡の大部分を担っている2,3.しかし、転移性コロニー形成とその後の増殖を支配する分子機構の理解が限られており、転移性疾患に対する有効な治療法の開発を妨げている。新規治療標的の同定には、候補遺伝子の発現または機能が転移の形成と増殖にどのような影響を与えるかを試験するためのアッセイが必要である。オートクトンマウスモデルには利点がありますが、生成には時間とコストがかかり、ターゲット検出ではなくターゲット検証に適しています。候補遺伝子がインビトロの癌細胞で摂動し、転移電位に及ぼす影響が生体内で評価される移植モデルシステムは、オートクトンモデルよりも安価でスループットが高い。さらに、RNAi、CRISPR/CAS9、およびトランスジーンを安定的に送達するためのウイルスベクターが広く利用可能であり、癌細胞株に存在する遺伝子や遺伝子を比較的容易に摂動させることが容易です。このアプローチは、細胞を免疫不全またはヒト化マウスに移植することによってヒト癌細胞株における転移性コロニー形成および増殖における候補遺伝子の役割をアッセイするためにも使用できる。
生体内の移植癌細胞による転移形成を検査するために用いられる2種類のアッセイは、自発的転移アッセイと実験的転移アッセイである。自発的転移アッセイ4,5では、癌細胞をマウスに注入し、原発腫瘍を形成させ、次いで自発的転移形成およびその後の増殖がアッセイされる。このモデルの強みは、転移性腫瘍を形成するために細胞が転移過程のすべてのステップを完了しなければならないことである。しかしながら、多くの癌細胞株は自発的転移モデルでは効率的に転移せず、原発性腫瘍増殖に影響を与える細胞の操作は転移アッセイの結果を混乱させることができる。がん細胞を循環に直接注射する実験的転移アッセイは、これらの落とし穴を避けるために用いられる。一般的な実験的転移アッセイは、尾静脈注射6、7、8(およびここで実証)、心内注射9、および門脈注射10を含む。
ここで提示されるプロトコルの目的は、研究者が転移の形成と成長をリアルタイムで監視し、同じマウスの肺における終点転移数と大きさを定量化することを可能にする生体内実験転移アッセイを提供することです。これを達成するために、従来の実験的な尾静脈転移アッセイ6、7、8は、生体内撮像装置9、11、12、13、14を用いて生体イメージングと組み合わされる。ルシフェラーゼと蛍光タンパク質の両方を安定して発現する腫瘍細胞を横尾静脈を介してマウスに注入し、その後、インビボイメージング装置を使用して、経時の肺の転移性負担の変化を測定する(図1)。しかしながら、生体内生きている動物イメージング装置は、個々の転移の大きさを区別または測定することができない。したがって、実験の終わりに、蛍光立体顕微鏡を使用して、断面化や組織学または免疫組織化学を必要とせずに、肺内の蛍光転移の数をカウントし、サイズを測定する(図1)。このプロトコルは、候補遺伝子の発現または機能を変更することが転移の形成および増殖にどのように影響するかをテストするために使用することができる。小分子または機能遮断抗体などの潜在的な治療化合物も試験することができる。
このアプローチを実証するために、まず、必須の複製因子である複製タンパク質A3(RPA3)が転移性マウス乳癌細胞でノックダウンされる概念実証実験を行いました。我々は、RPA3ノックダウン細胞を注射したマウスは、対照細胞を注射したマウスと比較して、毎回有意に転移性の負担が少ないことを示している。転移を含む肺の分析は、この転移性負担の減少は、転移性コロニー形成を著しく減少させ、形成する転移の増殖を損なった結果であることを示している。さらにこの技術を実証するために、PDZ結合モチーフ(TAZ)を用いたYes関連タンパク質(YAP)と転写共活性化剤の同時ノックダウンが転移性コロニー形成またはその後の増殖を損なうかどうかを試験した。YAPとTAZは、カバ経路の重要な下流エフェクターである2つの関連する転写共活性化剤である。我々15、16および他のは転移にYAPおよびTAZを関与させ(17、18、19で検討)、これらのタンパク質が良好な治療標的であることを示唆している。一貫して、YAP/TAZノックダウン細胞を注射したマウスは転移性負担を有意に軽減していることがわかりました。肺の分析は、YAP/TAZノックダウン細胞が多くのより少ない転移を形成し、形成した転移が小さいことを示した。これらの実験は、実験的な転移アッセイが、転移の形成と増殖における候補遺伝子の役割を迅速かつ安価にテストすることを可能にする方法を実証する。さらに、肺全体の転移の生きた動物イメージングと蛍光定量を組み合わせることで、転移性コロニー形成中の工程をよりよく理解する方法を示す。

<table><tbody><tr><td>10% SDS-PAGE ゲル</td><td></td><td></td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>2.5% トリプシン</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td>組織培養用トリプシン</td></tr><tr><td>96 ウェルフラットボトム ホワイトアッセイプレート</td><td>コーニング</td><td>3922</td><td>培養細胞のルシフェラーゼとレニラシグナルの測定用</td></tr><tr><td>アルコールワイプ</td><td></td><td></td><td>尾静脈注入前の注射部位をステロール化するため</td></tr><tr><td>BALB/Cマウス(女性、6週間)</td><td>タコニック</td><td>BALB-F</td><td>尾静脈転移性コロニー形成および負担アッセイ用</td></tr><tr><td>BSAレギュ</td><td>ラーVWR アメレスコ</td><td>97061-416</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>細胞溶解バッファー</td><td>細胞シグナル伝達</td><td></td><td>プロチエンサンプルの収集用</td></tr><tr><td>セルトリート シリンジフィルター、PES 30mm、0.45 &mu;m</td><td>Celltreat</td><td>40-229749-CS</td><td>ウイルス上清</td></tr><tr><td>CO2および安楽死チャンバー</td><td></td><td></td>をろ過するため <td>マウスの安楽死のため</td></tr><tr><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイキット</td><td>Promega</td><td>E1960</td><td>培養細胞のルシフェラーゼおよびレニラシグナルを測定するため</td></tr><tr><td>Dulbecco&39;リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>Himedia</td><td>TS1006</td><td>PBS</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>97061-406</td>用 <td>組織培養用トリプシンを希釈するために使用される</td></tr><tr><td>FBS 100% 米国起源</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>完全な成長培地の成分</td></tr><tr><td>富士フイルムLAS-3000ゲルイメージャ</td><td>富士フイルム</td><td></td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>用 GAPDH(14C10) ラビビットmAb</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>2118</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) 二次抗体、HRPコンジュゲート</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>ウェスタンブロット</td></tr><tr><td>用 ヒト胚性腎臓細胞、HEK-293FT</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td>ウイルスのパッキングに使用した細胞株</td></tr><tr><td>HyClone DMEM/High clucose</td><td>GE ヘルスケア ライフサイエンス</td><td>SH30243.01</td><td>完全増殖培地の成分</td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB、ウルトラピュアグレード</td><td>VWR Ameresco</td><td>97064-810</td><td>感染細胞の抗生物質選択用</td></tr><tr><td>I3-P/i3 マルチモードマイクロプレート/EA</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>培養細胞のルシフェラーゼおよびレニラシグナルを測定するため</td></tr><tr><td>Imagej</td><td></td><td></td><td>肺転移の画像解析に使用: 閾値を25 & 100に設定</td></tr><tr><td>免疫ブロット PVDF 膜</td><td>バイオラッド</td><td>1620177</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td></td><td></td><td>マウス麻酔用</td></tr><tr><td>IVIS Lumina XRMS In Vivo Imaging System (in vivo live animal imaging device)</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136340</td><td>転移性負荷のin vivoイメージング用</td></tr><tr><td>Leica M205 FA &Lecia DCF3000 G (GFP および明視野フィルター)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td> 顕微鏡<td>およびカメラ 肺の転移の可視化、カウント、および撮影用、10倍倍倍、3.5 秒露光、1.4 ゲイン</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>完全増殖培地の成分</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 3000</td><td>ライフテクノロジー</td><td>L3000008</td><td>YAP/TAZ-TEAD レポータートランスフェクション用</td></tr><tr><td>Living Image 3.2 (image software program)</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Software for IVIS</td></tr><tr><td>Mouse breast cancer cells, 4T1</td><td>Karmanos Cancer Institute</td><td>Aslakson, CJ et al.,1992</td><td>Mouse metastatic breast cance cell line</td></tr><tr><td>Multi-Gauge version 3.0</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Software for quantifying western blot band intensity</td></tr><tr><td>Opti-MEM (transfection buffer)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>包装用ウイルスおよびトランスフェクション</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>完全増殖培地の成分</td></tr><tr><td>Pierce BCAタンパク質アッセイキット</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td>タンパク質濃度の定量化用</td></tr><tr><td>Pierce Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32957</td><td>細胞溶解バッファーに添加</td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Mini Tablets</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32953</td><td>細胞溶解バッファーに添加</td></tr><tr><td>ポリブレン(臭化ヘキサジメトリン)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-H9268</td><td>感染用</td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45-P7255</td><td>感染細胞の抗生物質選択用</td></tr><tr><td>げっ歯類の抑制剤</td><td></td><td></td><td>尾静脈注入中のマウスの拘束用</td></tr><tr><td>SDS-PAGEランニングバッファー</td><td></td><td></td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>TAZ (V3886) 抗体</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4883</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>TBST バッファー</td><td></td><td></td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>TC20 自動セルカウンター</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>細胞のカウント用</td></tr><tr><td>ベクター</td><td></td><td></td><td>ベクターの完全なリストについては、表1を参照してください</td></tr><tr><td>VWR 倒立蛍光顕微鏡</td><td>VWR</td><td>89404-464</td><td>蛍光を視覚化するためZSGreen標識細胞</td></tr><tr><td>ウェスタン転写バッファー</td><td></td><td></td><td>ウェスタンブロット用</td></tr><tr><td>XenoLight D-Luciferin K+ Salt</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>Substrate injected into mice for in vivo bioluminescent IVIS images</td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9 DNA transfection reagent (lipid solution for transfection)</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>For packaging virus</td></tr><tr><td>YAP (D8H1X) XP Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling</td><td>14074</td><td>ウェスタンブロット用</td></tr></tbody></table>

尾静脈転移アッセイとリアルタイムインビボイメージングの併用による乳癌転移性コロニー形成と肺の負担の定量化

Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs

転移は癌関連死の主な原因であり、転移性疾患患者の治療選択肢は限られている。転移性疾患のより良い治療法の開発を促進する新規治療標的の同定および検査は、生体内モデルにおける前臨床を必要とする。ここで実証された乳癌転移性コロニー形成とその後の増殖をアッジャーするための同系マウスモデルである。転移性癌細胞は、ホタルルシフェラーゼおよびZsGreenタンパク質をコードするウイルスベクターを安定して形質転換される。候補遺伝子は、ルシフェラーゼ/ZsGreen発現癌細胞で安定して操作され、その後、細胞は転移性コロニー形成および増殖をアッセイするために横尾静脈を介してマウスに注入される。その後、生体内イメージング装置を使用して、生きている動物の腫瘍細胞の生物発光または蛍光を測定し、時間の経過に続く転移性の変化を定量化する。蛍光タンパク質の発現により、断面染色や組織染色を必要とせずに、実験終了時に肺の転移の数と大きさを定量することができます。このアプローチは、転移性コロニー形成および増殖における候補遺伝子の役割をテストする比較的迅速かつ容易な方法を提供し、従来の尾静脈転移アッセイよりもはるかに多くの情報を提供する。このアプローチを用いて、乳癌細胞におけるPDZ結合モチーフ(TAZ)を用いたYes関連タンパク質(YAP)と転写共活性化剤の同時ノックダウンは、肺における転移性負担の軽減につながり、転移性コロニー形成の著しい低下と転移の増殖の減少の結果であることを示す。

上記のアプローチを実証するために、重要な複製因子であるRPA3を転移マウス乳腺癌細胞株(4T122)でノックダウンした概念実証実験を行った。このプロトコルは、遺伝子操作の前にルシフェラーゼと蛍光タンパク質の両方で細胞を標識することを記述しているが、RNAiベクターもZsGreenを提供するので、我々は改変されたアプローチを用いた(図2A)。まず、4T1細胞をホタルルシフェラーゼおよびハイグロマイシン耐性(pHAGE-ルシフェラーゼ-IRES-Hygro)をコードするレンチウイルス構築物で安定に形質転換した。ハイグロマイシン選択後、ホタルルシフェラーゼの安定な発現を確認するためにルシフェラーゼアッセイを行った(図2A)。次に、4T1-ルシフェラーゼ細胞に、ZsGreenおよび対照miR30ベースのshRNAを発現するレトロウイルスベクター、またはmiR30系shRNAを用いて安定に誘導し、マウスRPA3<s...

記述されたアプローチは、実験的な尾静脈転移アッセイと生体内生動物イメージングを組み合わせることで、肺の転移数と大きさの定量に加えて、乳癌転移の形成と増殖をリアルタイムでモニタリングすることを可能にする。

Metastasis is the main cause of cancer-related deaths and there are limited therapeutic options for patients with metastatic disease. The identification ...

当社のプロトコルは、転移性コロニー形成および成長における任意の候補遺伝子の役割を迅速かつ容易にテストするために使用することができる。このプロトコルはまた、転移、形成、成長のリアルタイムモニタリング、ならびに切除または組織学的染色を必要とせずに同じ動物の転移数およびサイズの定量を可能にする。完全な成長培地の12ウェルプレートに150,000個のウェルで4つのT1細胞をプレートします。一晩摂氏37度5%の二酸化炭素でインキュベートする。翌日、細胞から増殖培地を吸引する。500マイクロリットルのルシファーゼウイルス上清と500マイクロリットルの蛍光タンパク質ウイルス上清を加え、同時にルシファーゼと蛍光タンパク質ウイルス上清の両方で細胞に感染させます。その後、1ミリリットルの8ミリグラムの臭化ヘキサジメトリンを1マイクロリットル加え、摂氏37度でインキュベートし、24〜48時間の二酸化炭素を5%でインキュベートします。トリプシンの500マイクロリットルで4つのT1細胞をトリプシン化します。2〜5分後、すべての細胞を4ミリリットルの選択媒体で6センチメートル皿に移し、トリプシンを消光する。選択が完了した後、感染した4つのT1細胞が50〜100倍の倍率で反転蛍光顕微鏡を使用してZsGreen蛍光タンパク質を発現していることを確認します。また、感染した4つのT1細胞が市販のルシファーゼ活性キットを用いてルシファーゼを発現していることを確認する。テキストプロトコルに記載されているように、in vivo実験計画の最適化を実行する。培地を吸引し、1X PBSで細胞板をすすいだ。15センチメートルプレート当たり5ミリリットルのトリプシンで細胞を2〜5分間トリプシンし、すべての細胞を円錐チューブに移します。トリプシンをクエンチするのに十分な完全な成長培地で組織培養皿から残りの細胞を洗浄する。同じ円錐形のチューブに洗浄を追加します。セルの合計数を決定するために、自動セル カウンターを使用してセルをカウントします。次に、細胞を122回Gで3分間遠心し、上清を吸引する。所望の濃度で1X PBS中の細胞を再懸濁する。ここで、25,000個の細胞が各マウスおよび100マイクロリットルのPBSに注入される。したがって、再懸濁細胞は1ミリリットル当たり250,000細胞である。細胞懸濁液を射出するまで氷の上に置いてください。動物施設のフードで作業し、チューブを反転するか、1ミリリットルの注射器を使用して細胞を穏やかに完全に混合し、均一に再懸濁されるようにします。さて、細胞懸濁液で1ミリリットルのルアーロックシリンジをロードし、余分な気泡を排出します。ベベルを上げてシリンジに半インチの30ゲージ針を置き、気泡を排出します。げっ歯類の拘束剤にマウスをそっと置きます。横尾静脈は目に見えて拡張する必要が

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