Name: 微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 26 s
Description: 学ぶ血液脳関門透過性解析法。ヒト微小血管内皮細胞を用いてE. coliのトラバーサルを測定し、グリオキサル処理や高グルコース条件の影響を評価します。細菌性髄膜炎や術後せん妄の病態解明に貢献します。

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著者らは、この方法に関する以前の研究、PD博士カースティン・ダンカー(ベルリンのシャリテ・ユニバーシテ・メディジン)のグループが、原稿を批判的に読むTHBMECとジュリアン・ウェーバーを提供してくれたことを認めている。この研究はRTK 2155(プロモエイジ)によって支持された。

1. バッファーおよび試薬の調製
<ol><li>塩化ナトリウム(NaCl)、塩化カリウム(KCl)2g、水素二ナトリウム二水和物14.4g(Na2HPO4・2H2O)、カリウムジ水素リン酸カリウム2g(KH2PO4)を2重蒸留した1回の1ラズフラスコに2g添加して、10倍のリン酸緩衝液(10x PBS)を調製する。 10x PBS溶液をオートクレーブし、この溶液の100 mLを900mLの二重蒸留水で希釈して1x PBSを得た。<ol>
<li>オートクレーブを使用して溶液を殺菌します。ガラスフラスコをバスケットに入れ、蓋を閉め、121°Cと98.9 kPaで15分間殺菌します。 注: このプロトコルは、常に、さらに手順でソリューションを自動クレーブするために使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5 mg/mLフィブロネクチン溶液と0.3 mg/mLコラーゲンIV溶液を1x PBSで1.5 mLマイクロチューブで100mg/μLアリコートで希釈して、10μg/mLコラーゲンIVおよび10μg/mLコラーゲンIV溶液を調製します。その後、2 mLマイクロチューブに1,800 μLのPBSを1,800 μLと混合し、-20°Cに保存します。</li>
	<li>DMEM/F-12培地を4%ウシ胎児血清と2mM L-グルタミン、100mg/Lペニシリン/ストレプトマイシンを培地に添加して調製し、4°Cで保存する。</li>
	<li>10倍濃縮トリプシンEDTA溶液の5mLを50mLのPBSで45 mLの1x PBSで希釈して、10mLのトリプシン-EDTA溶液を50mLのチューブに調製し、4°Cで保存する。</li>
	<li>500 mL ガラスフラスコにLBブロスベース10gの重さを計量して、LB培地500mLを調製する。殺菌水500mLを加え、オートクレーブします。</li>
	<li>500 mLガラスフラスコにLBブロスベース10g、寒天7.5gの重量を量ってLB寒天を調製します。オートクレーブする前に500mLの殺菌水を加え、フラスコの蓋を閉めないでください。オートクレーブとそれがタッチに暖かくなるまで冷却するソリューションを残します。</li>
	<li>4%のウシ胎児血清と2mM L-グルタミンを添加して抗生物質を含まない培地を調製し、DMEM/F-12培地にペニシリン/ストレプトマイシンを添加し、ステップ1.3のように4°Cで保存します。</li>
</ol>2. 細胞を模倣する血液脳関門の成長
<ol><li>12ウェルプレートを組み立てるには、細胞培養インサートをウェルに入れます(図2A)。<ol>
<li>プレートと各インサートを生物学的安全キャビネットに開梱し、そこでさらに手順を実行します。滅菌鉗子を使用して、幅広いベースでインサートをつかんで動かします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>各インサートの多孔質膜を90 μg/mLコラーゲンIVと10 μg/mLフィブロネクチン混合物でコーティングします。細胞培養インキュベーターで37°Cで24時間の12ウェルプレートをインキュベートする(図2B)。</li>
	<li>1x PBSの1mLを各インサートにピペッティングしてインサートを2回洗浄し、細胞培養用の真空ポンプで溶液を吸引します。</li>
	<li>上部に0.5 mLのプレウォーミングDMEM/F-12培地、下側チャンバーに1.5mLをピペッティングして膜を平衡化します。5%のCO2雰囲気を有する細胞培養インキュベーターで37°Cでプレートを30分間インキュベートする(図2C)。</li>
	<li>種子2 x105ヒト微小血管内皮細胞を各上部チャンバーに入れ、細胞培養インキュベーターで37°Cで12ウェルプレートをインキュベートする(図2D)。<ol>
<li>細胞培養用の真空ポンプを用いて菌体培養フラスコから培地を吸引し、1x PBSの10mLをピペッティングし、その後真空ポンプで溶液を吸着させることで単層を洗浄する。</li>
		<li>細胞を1x濃縮トリプシンEDTAで完全に覆い、5 mLの溶液を細胞培養フラスコにピペッティングして、37°Cで3〜5分間フラスコを細胞培養インキュベーターでインキュベートする。 注:細胞が解き消されない場合は、手のひらにフラスコをしっかりとタップして細胞を外します。</li>
		<li>15 mLチューブの細胞懸濁液からアリコートとしてピペットを用いて5 mLを取り、5 mLのFCS含有培地を加えて酵素反応を停止させます。</li>
		<li>210 x gで懸濁液を3分間遠心分離し、真空ポンプで上清を取り除き、ペレットをピペットで5 mLの培地に再懸濁します。</li>
		<li>セルカウンターを使用して、1.5 mLマイクロチューブに10μLのトリパンブルー染色を10μLで混合します。10 μLの混合物をカウントチャンバースライドに加え、セルカウンターに入れ、カウントを開始します。<ol>
<li>セルの端が濃い青色、中央が白になるように、セルにカウンターを合わせます。その後、セルカウントのための適切なプログラムを開始します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>各挿入物の体積を計算するために、得られた2 x105細胞を挿入ごとに、細胞懸濁液の算出濃度で除算する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>血液脳関門モデルの培養
<ol><li>12ウェルプレートを37°Cで14日間インキュベートする。</li>
	<li>上チャンバーの培地の0.5 mLと2〜3日ごとに下側の培地用の1.5 mLを変更します。培地を細胞フラスコに入れる前に温めます。真空ポンプで吸引する (図 2E)。 メモ:メンブレンに触れないように注意してください。</li>
	<li>顕微鏡で細胞をイメージングして細胞の状態を確認し、その合流状況を確認します。14日後に合流率が100%であることを確認してください。</li>
</ol>4. 細菌の製造
<ol><li>測定の前日、大腸菌株GM2163のコロニーをLB培地に入れる。培養用の培養管を37°Cで24時間インキュベートし、180rpmでインキュベーションシェーカー(図2F)を使用します。<ol>
<li>4°CでLB寒天板上の大腸菌株を培養する。滅菌ピックで1つのコロニーを取り、LB培地の3 mLで準備された培養管にピックを入れます。</li>
		<li>暖かいLB寒天溶液で各インサートのためのLB寒天プレートを準備し、その総量の半分にペトリ料理を埋めます。固体にし、4°Cに保管しましょう。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 細胞の治療
<ol><li>播種後14日目に、化合物を用いて細胞を治療するか、または、計画されている場合は経内皮電気抵抗(TEER)を測定する(図2G)。 注: コントロールとして未処理のセルを常に持つ。<ol>
<li>目的の化合物を用いて細胞を治療するには、化合物をDMEM/F-12培地の最終濃度に希釈します。この混合物の0.5 mLを上部チャンバーに加え、下側チャンバーに1.5mLを加えます。所望の時間に対して、細胞培養インキュベーターでプレートをインキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>その後、真空ポンプとピペッティングを通して、完全な培地を抗生物質を含まない培地と交換します(図2H)。</li>
</ol>6. 透透度測定
<ol><li>細菌の濃度を一定にするには、光度計を600nmの波長で測定します。50 mLのハヤブサチューブに含まれるLB培地で細菌の一晩溶液を0.5±0.05のOD600に希釈します。氷の上で作業します。<ol>
<li>1 mL の LB 培地をキュベットに入します。光計を起動し、前面にマークされた、キュベットを入れます。その後、空白値を測定するために下部のブランクを押します。</li>
		<li>細菌溶液をキュベットに充填し、入れ、下部サンプルを押すことで、細菌溶液の密度を測定します。希釈中に測定を繰り返し、最終濃度になるまで測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>OD600 = 0.5で調製した12ウェルプレートおよび細菌溶液で細菌を処理することができる生物学的安全キャビネットで作業します。450 μLの細菌溶液を、培地0.5mLを含む各上部チャンバーに添加する(図2I)。</li>
	<li>12ウェルプレートを37°Cで6時間インキュベートします。 注: プロトコルはここで一時停止するように指示します。</li>
	<li>鉗子で挿入物を取り出すことによって各下のチャンバーからピペットを用いた培地のサンプル50μL(図2J)。上の部屋から下の部屋に媒体をこぼしないように注意してください。</li>
	<li>各サンプルを別々の寒天プレート(図2K)にプレートします。プレートにサンプルをドロップし、セルスプレッダーで溶液をストリークします。</li>
	<li>37 °Cで寒天プレートを24時間インキュベートします。</li>
	<li>各プレートにコロニーを数えます(図2L)。</li>
</ol>7. データの分析
<ol><li>表にデータを書き込み、処理された細胞と未処理の細胞の観測されたコロニーの平均および標準偏差を計算する。</li>
	<li>平均をコロニーの絶対数として表示する。<ol>
<li>結果を正規化するには、全ての結果を制御値で割ることによりコロニーの相対数を算出する。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="微生物培養実験図;接種、インキュベーション、およびサンプル分析プロセス。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig2a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="微生物培養実験図;接種、インキュベーション、およびサンプル分析プロセス。"> 図2:プロトコルの個々のステップの詳細なプレゼンテーション。(A) 殺菌した鉗子を入れたインサートを12ウェルプレートに入れます。(B) 90 μLのフィブロネクチンとコラーゲンIV混合物を塗布し、24時間インキュベートし(C)30分間のプレウォーム培地で膜を平衡化する(D)種子2 x105ヒト脳微小血管内皮細胞(E) 適切な時間だけプレートを培養します。(F) 測定の前日に、LB培地培養管に大腸菌コロニーを入れ、24時間(G)細胞を治療するか、TEERを測定する。(H) 抗生物質を含まない培地との交換の完全な培地。(I)細菌溶液450μL(OD600 = 0.5)を各上部チャンバに加え、6時間(J)サンプル50μLの培地を各下側チャンバーから50μLのインキュベートして鉗子で挿入する。(K) 試料を寒天プレートにプレートし、24時間インキュベートします(L)コロニーを数え、データを分析します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

著者たちは開示するものは何もない。

微生物トラバーサルの病因に関する限られた洞察は、PODまたは髄膜炎の治療法のさらなる発展を制限する。これらの疾患の死亡率と罹患率は、より良い患者治療を必要とし、根本的なメカニズムの研究を必要とし、化合物スクリーニングのための堅牢なプラットフォームを必要とする。多因子イベントは、ヒトBMECsで研究することができます。いくつかの正常な多くの種からのBMECsの分離手順が報告されたいくつかの、分子シグネチャ52、53の細胞の特性の損失を示している。この手順で説明したTHBMECは非常に初期の通路でトランスフェクトされ、そこで特定の脳内皮細胞特性を示し、それらを43に保存した。影響を受ける経路のすべてのステップがこれまでに発見されたわけではないため、これは重要であり、このモデルは従来のBMECsを模倣しているようです。我々の提示されたモデルは、BMECおよびBBBを介した微生物トラバーサルに直接影響を及ぼす。
THBMEC細胞の取り扱いは簡単であり、必要な技術装置はほとんどの生命科学研究所に存在する。当社のモデルは、THBMECがタイトな単層を構築した後、調査手順の即時開始を可能にします。トレーサー54によるTEER測定またはラベル付けのような新しい試験と従来のアッセイとの間の可能な組み合わせのために、用途の分野は広範囲に及ぶ可能性がある。また、共培養モデルまたは三重培養モデルを作るためにアストロサイトまたはペリサイトを添加することもできる。微生物トラバーサルに対する薬物の影響は、細菌を持つ上部チャンバーに接種する前に、THBMECsを化合物で処理することによって、我々のモデルでも試験することができる。実際には、手順の自動化を可能にする96ウェルプレート用のフィルタを使用してインサートを購入することが可能です。これにより、高スループットの薬物スクリーニングシステムの実施を促進し、上記疾患に対する薬物の発見を促進し、医薬品開発中のBBBに対する副作用を軽減することができる。
提示された方法における重要なステップは、細菌を上部チャンバに添加した後のインキュベーション時間である。大腸菌の生成時間はわずか20分55であるため、プロトコルのタイムラインとして時間を使用することが重要です。そうしないと、異なる時間ポイントを使用すると、誤解を招く結果を招く可能性があります。プレートが注意して処理されない場合、細菌暴露中に上部および下部のチャンバー間の汚染の可能性もあります。この時点で12ウェルプレートへの変更は、下側チャンバー内の媒体を汚染する可能性があります。
大腸菌は、細菌性髄膜炎の1つのよく知られた、非常に一般的な原因である。更なる調査は、髄膜炎髄膜炎56または肺炎球菌57のような髄膜炎に関連する異なる細菌をテストする必要があります。これらは、BBBを横断するために異なるメカニズムを使用しているようで、患者の治療のためによりよく理解する必要があります。高齢患者では、PODの発生率は26増加し、発生する併存疾患の数も増加する。異なる疾患、特に糖尿病のような全身的なものの間には相互作用があることがわかっています。我々のモデルでは、これらの条件をシミュレートしたり、細菌を追加する前に細胞を治療することが可能です。
このモデルは、THBMECと細菌の直接接触によって制限されており、関与する経路およびタンパク質を検出するための接触の潜在的なメカニズムを調査するためにさらなる研究が必要である。しかし、挿入物を除去し、さらなる分析のために細胞を収穫することは可能である。モデルのTEERは幹細胞モデル38、39、40と比較して低い。これを確認するには、6時間後に未処理細胞でBBBを横断しない菌濃度を用いた。
要約すると、この方法は、BBBを介した細菌の通過を分析する堅牢なプラットフォームを表し、ハイスループット薬物スクリーニングのためにそれを拡大する可能性を有する。

ヒトBBBは、脳組織のユニークな境界であり、脳を血液から分離する。それは、より大きく親水性の分子の通過を厳密に調節し、細胞内拡散を遮断し、脳の恒常性を維持する。また、中枢神経系(CNS)免疫の一部として、プラズマの変動、毒素、微生物から脳を保護し、炎症性細胞を導きます。1世紀前の発見以来、BBBの構造と機能を理解するために多くの研究が行われてきた。細胞、タンパク質、脳と血液からのシグナルの複雑な相互作用は、さらにさらなる調査とモデルを必要とします。
ヒトBBBは、脳微小血管内皮細胞(BMEC)、ペリサイト、および星状細胞2、3の3種類の細胞で構成される。BMECは、体内の内皮細胞の大部分とは異なり、多くのタイトな接合部を有し、接合部4、低ピノサイト活性2、5、および連続基膜6、7を付着して、副細胞拡散を遮断する。小さな親油性分子は拡散し、その濃度勾配に従ってBBBを通過することができます。より大きく親水性の分子は、分極表現された選択的輸送システムを介してのみ脳に入るか、または去る8。この規則により、透過性9,10に逆相関する1,500-2,000 Ω·cm2の高い経内皮電気抵抗(TEER)が生じる。BMECは強固なバリアを構築しますが、ローカルおよび周辺信号11,12に反応することができます。BMEIcとアストロサイト13の間には密接な相互作用がある。アストロサイトの端足は容器のまわりに層を造り、堅い接合部13、14の形成を誘発する。それらは、成長因子-β(TGF-β)15,16の変形を含む異なる因子を有するBBB成熟に関与している。加えて、血管新生17の調節に重要な役割を果たす、細胞分化における内皮のアポトーシスを防止する18(図1)。それらは、基盤膜に埋め込まれ、容器壁19の構造安定性を提供する。
<img alt="血液脳関門図;内皮細胞、星状細胞、輸送調節、細胞傍拡散。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="血液脳関門図;内皮細胞、星状細胞、輸送調節、細胞傍拡散。"> 図1:血液脳関門の概略構造ヒトBBBのユニークな構造は、3つの異なる細胞タイプで構成されています。マイクロ血管の内腔は、狭い接合部で濃縮された内皮細胞に囲まれており、フェンストレートされていません。それらは、ペリサイトのように、下地膜に埋め込まれています。これらの細胞は、血管壁の構造安定性のために重要であり、アストロサイトの隣のBBBの開発に役割を果たしている。彼らの端足は容器のまわりの近い層を造り、堅い接合の建物を支える。BBBのすべての成分は生理機能のために重要です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
多くの異なる病理は、BBBの崩壊(例えば、敗血症性脳症)に関連している。罹患した患者は脳脊髄液20においてタンパク質レベルが上昇しており、罹患したげっ歯類における脳のパレンチマは、顕著なコロイド鉄酸化物およびアミノ酸21、22の取り込みの増加を示す。これらの結果は、BMECs21および内皮活性化23におけるピノサイトシスの増加と並んで起こるBBBの透過性の増加を指している。BBBの変化に関連するもう一つの関連病理は、髄膜炎、医学的緊急事態および神経細胞死につながる脳浮腫を伴う複雑な炎症である。循環細菌の一次入口部位は、ミクロ血管24であると考えられている。しかし、BBBは細菌の侵入を防ぎます。BBBの透過性は、実験性のヘマト性髄膜炎25の増加に必ずしも関連するとは限らず、そのメカニズムは多因子性であり得る。術後せん妄(POD)26と術前感染との関連を伴う敗血症の一致(27),28は、細菌への直接暴露が細菌病因へのより良い理解を得ることを可能にするBBBモデルの必要性を示す。
BBBを通して微生物横断を理解し、定量化する際には多くのギャップがあります。そこで、細菌トラバーサルとBBBの透過性に及ぼす影響との直接的な相関を持つ異なる因子と条件の簡便な試験を可能にするモデルを開発した。これまでの研究では、傍細胞透過性に焦点を当て、TEER測定とトレーサーフラックスが含まれていました。さらに、高分子輸送は、結合された分子または抗体によって分析され、それによって、内皮細胞のみを使用する異なるモデルまたはアストロサイトおよびペリサイトとの組み合わせが開発された。ヒト組織の取得が困難なため、多くの動物ベースのモデルが使用されています。牛およびブタ起源の脳内皮細胞は、高いTEERを有するタイトな単層を形成し、良好な形の尖門基底極性を形成し、BBBを介した低分子輸送の研究に適している。タンパク質はヒトの同族体29,30と配列が異なり、抗体の治療の調査が困難である。このため、マウスまたはヒト培養モデルが好ましい場合がある。サンプル源としてのマウスまたはラットは、よく特徴付けられる種から得られるという利点を有するが、研究目的ではほとんど細胞を生み出さない。これは、不死化マウス脳内皮腫(END)細胞株bEND.3、bEND.5またはcEND31、32、33の使用によって回避することができます。
ヒト組織から初等培養細胞を取得し、定期的に取り扱うのは困難である。したがって、ヒトBBBを調査する研究に使用されるほとんどのヒト細胞モデルは、不死化内皮細胞株である。公表された細胞株はヒト脳微小血管内皮細胞株hCMEC/D3で、薬物摂取の研究に適しており、取り扱いが容易である。細胞は単層を構築し、BBB34の特徴的な密結合タンパク質を発現するが、クローディン-5の発現レベルは無傷のマイクロ血管35よりも低いと報告されており、多くの特異的トランスポーターは、転写レベル36およびプロテオミクス研究34において検出されている。30~50 Ω·cm2の範囲で比較的低いTEERは、依然として課題37です。脳内皮細胞のもう一つの供給源は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)38および循環内皮系および造血系統のヒト臍帯血由来幹細胞39、40である。分化の両方のプロトコルは、密細胞単層および高いTEER値(例えば、共培養における1,450 Ω·cm2)38をもたらす。これらの幹細胞モデルは、培養のために極度のケアを必要としますが、BBBの発達に対するホルモン41または遺伝的背景を有する疾患の影響を研究する機会を提供します。
本研究では、不死化したトランスフェクトヒト脳微小血管内皮細胞株THBMEC43を確立し、BBBを模倣し、細菌トラバーサルを研究した。細胞はフィルターに播種され、この細胞培養モデルでは100%の合流性に成長した。細菌は、細胞培養室の上部に接種される。大腸菌髄膜炎の発生率が高いため、サンプル研究では大腸菌(大腸菌)を使用しています。細胞単層の最も低い透過性は、播種45の13日目と15日目の間に生じることが示されている。従って、この時間以降にTHBMEC単層の処理が行われ、その後菌が単層の尖面上の培地に接種される。インキュベーション時間の後、バリアを越えることができた細菌は、寒天プレート上の細菌とメッキ媒体を介して定量され、コロニーを数えます。コロニーの数が増加すると、BBBを通過する細菌トラバーサルの増加と相関する。TEERは約70 Ω·cm246です。ただし、記載された方法でTEERを測定する必要はありません。BBBの透過性については定評のある値ですが、BBBを通る細菌の通過に影響を及ぼすことはないようです。未処理の細胞は、我々のモデルの圧迫感の制御として機能します。前の研究では、細胞が炎症性サイトカインに反応し、典型的なタイトな接合タンパク質47を発現することが示されている。これにより、より大きなトランスポーター基質および受容体の組み合いの化合物スクリーニングおよび検証が可能になります。

<table><tbody><tr><td>寒天 - 寒天</td><td>カール・ロス</td><td>6494.3</td><td>バイオサイエンスグレードの</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>Systec</td><td>VX-150</td><td></td></tr><tr><td>バクテリア E.coli GM2163</td><td>Fermentas Life Sciences, Lithuania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photometer</td><td>Eppendorf</td><td>6131</td><td></td></tr><tr><td>細胞 THBMEC</td><td>M. F. Stins</td><td></td><td></td>のグループ</tr><tr><td>細胞培養フラスコ</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge Universal 320</td><td>Hettrichlab</td><td>1401</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンIV</td><td>SIGMA Aldrich</td><td>C6745</td><td>ヒト細胞培養由来</td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>C10311</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes</td><td>Greiner Bio-One</td><td>191180</td><td></td></tr><tr><td>キュベット</td><td>ブランド</td><td>759015</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素ナトリウム 二水和物</td><td>MERCK</td><td>1065800500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO/Thermo Sc.</td><td>11330032</td><td>HEPES</td></tr><tr><td>ファルコン チューブ 15 ml</td><td>グライナー バイオワン</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン チューブ 50 ml</td><td>グライナー バイオワン</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GIBCO/ Thermo Sc.</td><td>10270</td><td>値FBS-ブラジル</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>SIGMAアルドリッチ</td><td>F0556</td><td>溶液ヒト線維芽細胞</td></tr><tr><td>ヘラセル150 CO2インキュベーターヘ</td><td>レウス</td><td>50116047</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーターシェーカーI 26ニューブランズウィック</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1324-0000</td><td></td></tr>接<tr><td>種ループ</td><td>博士イローナシューベルト-Laborfachhandel</td><td>641000</td><td></td></tr><tr><td>LBブロスベース</td><td>GIBCO /サーモSC。</td><td></td><td></td>12780029</tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>GIBCO/サーモ</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>微生物インキュベーター B 6200</td><td>ヘレウス</td><td>51015192</td><td></td></tr><tr><td>微生物安全キャビネット AURA 2000 M.A.C. クラス II</td><td>BIOAIR</td><td>12469</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡逆</td><td>ツァ</td><td>イス テラバル 31</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 2 ml</td><td>ザルスタット</td><td>72,695,400</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1,5 ml</td><td>サルスタット</td><td>72,706,400</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>GIBCO /サーモSc。</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>シャーレ</td><td>博士イローナシューベルト - Laborfachhandel</td><td>464-800</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム</td><td>ロス</td><td>HN02.3</td><td></td></tr>カリウム<tr><td>二水素リン酸塩</td><td></td><td>P018.2</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>ロス</td><td>9265.2</td><td></td></tr><tr><td>ThinCerts +マルチウェルプレート</td><td>グライナーバイオワン</td><td>665631</td><td>12ウェル、細孔径3.0&マイクロ;m</td></tr><tr><td>トリプシン - EDTA</td><td>GIBCO /サーモSc。</td><td></td><td></td>15400054</tr><tr><td>真空ポンプ ラボポート</td><td>KNF</td><td>N 86 KT.18</td><td></td></tr></tbody></table>

微小血管内皮細胞を介した微生物トラバーサルによる血液脳関門の透過性の解析

Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells

ヒトの血液脳関門(BBB)は、脳の代謝を保護し、調節するために生体分子の透過性が非常に低いことを特徴とする。BBBは、主にコラーゲンIVおよびフィブロネクチンが豊富な元下膜に埋め込まれた内皮細胞から形成される。BBBの機能不全に起因するいくつかの病理は、微生物の横断に続いて、髄膜炎などの疾患を引き起こす。異なる薬物や麻酔薬を含む複数のパラメータの効果をテストするために、BBBの透過性に関して、ヒト脳微小血管内皮細胞を用いてBBBを模倣した新規ヒト細胞培養モデルを確立した。内皮細胞は、合流するまでコラーゲンIVおよびフィブロネクチンコーティングされたフィルター単位で成長し、その後、関心のある異なる化合物で処理することができます。微生物トラバーサルを実証するために、内皮細胞の尖面を有する上部チャンバーに細菌を接種する。インキュベーション期間の後、下側チャンバのサンプルは寒天プレート上にメッキされ、得られたコロニーは数えられ、それによってコロニーの数はBBBの透過性と相関する。内因性細胞因子は、BBBに寄与する内皮細胞の基本的な細胞機構を解明するために、この実験的なセットアップで分析することができる。さらに、このプラットフォームは、内皮細胞の透過性に影響を与える可能性のある化合物の画面を実行することができます。最後に、細菌の横断を研究し、髄膜炎などの異なる病理にリンクすることができます。モデルを拡張し、BBBを通して細菌の経路を分析することが可能かもしれません。本稿では、BBBの透過性を調べる方法について詳しく説明したプロトコルを提供する。

プロトコルに従って、細胞を播種し、BBBモデルを構築した。播種後14日目に、細胞を反応性アルデヒドとしてglyoxalで処理した。実験の目的は、POD27における年齢と糖尿病と高齢患者における髄膜炎の発生率が高い48との相関を調べることを目的とした。年齢と糖尿病の両方で進行糖化末端製品(AGEs)の増加レベル49は BBB を介して微生物の通過の病因における糖化の効果のさらなる検討を必要とします。糖化は、炭水化物または他のカルボニル化合物のカルボニル基をタンパク質中の遊離アミノ基の非酵素反応である。グルコースはカルボニル基のドナーとしてよく知られています。ただし、より多くの反応性のものが知られています。不安定なシフの塩基を構築した後、彼らはglyoxalのようなより安定した反応性ジカルボニル化合物に再配置します。最終製品であるAGEsは、タンパク質50間の架橋を引き起こす可能性があります。それらは、細胞構造を損傷し、AGEsの受容体との相互作用によって細胞機能を変化させる可能性があります (RAGE)51.
細胞を0.05および0.15 mM glyoxal(GO)溶液で1時間処理し、未処理の細胞をコントロールとして働いた。抗AGE抗体による免疫ブロッティングおよび検出を介して糖化を検出した(図3)。得られた細菌コロニーを、絶対コロニー数(図4A)または対照に正規化したコロニーの相対数(図4B)として表した。未処理の細胞とウェルから採取した培地は、非常に少数のコロニーを形成した。この結果は、未処理の細胞がバリアを構築することができ、コントロールとして機能できることを実証した。glyoxalで処理されたサンプルは、コロニーの数を増加し、THBMECsおよび細胞バリア密度に対するglyoxalの効果があるという結論に至った。glyoxalによる治療後の障壁の細菌の交差の増加は、糖尿病がBBB分解を伴う疾患と相関する理由を説明することができる。
<img alt="ウェスタンブロットとポンソーS染色を用いたタンパク質分析で、抗体反応性の比較を示します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig3a.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="ウェスタンブロットとポンソーS染色を用いたタンパク質分析で、抗体反応性の比較を示します。"> 図3:免疫ブロット法によるタンパク質の糖化の検出THBMECsは、1時間の異なる濃度でGOで処理しました。タンパク質の糖化は、抗AGE抗体(CML-26)を用いた免疫ブロッティングを介して検出された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig3alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
異なる設定では、THBMECsのタンパク質糖化はグルコースによって誘導された。滅菌されたグルコースをDMEM/F-12培地に添加し、正常グルコース培地(NG)から17.5mMでグルコース濃度を増加させ、42.5mMで高グルコース培地(HG)に添加した。THBMECsは、正常グルコース(NG)培地と高グルコース(HG)培地の2つの異なる細胞培養フラスコで栽培した。これら2つの異なる媒体はまた、12のウェルプレートのフィルター上のBBBの成長のために使用された。NG培地で培養した細胞はコントロールとして役立った。得られたコロニーは、絶対コロニー数(図4C)または対照に正規化されたコロニーの相対数(図4D)として表される。この結果は、ヒトBBBを通る細菌の横断に有意な影響を及ぼさなかったことを示しており、NG対HGの効果はBBBの完全性に影響を及ぼすほど重篤ではなかったという結論に至った。さまざまなシナリオは、BBB を模倣するモデルとセルの完全性を証明するように設計されました。
<img alt="細胞コロニーに対するグリオキサールの影響、棒グラフ分析、絶対および相対コロニー数、統計結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60692/60692fig4d.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="細胞コロニーに対するグリオキサールの影響、棒グラフ分析、絶対および相対コロニー数、統計結果。"> 図4: THBMECsを用いたBBBモデルにおける細菌コロニーの絶対数および相対数。THBMECsを1時間0.15mM GOで処理し、未処理の細胞をコントロールとして役立った。各上部チャンバーに合計450μLの大腸菌懸濁液(OD600=0.5)を加えた。下側チャンバーからの培地は、6時間後に寒天プレート上にメッキされた(A)グラフは、カウントされたコロニーの平均平均+/-SEMを示す。(B) グラフは、コントロール+/- SEMとして未処理の細胞に正規化されたコロニーの数えが示されている(n = 4)。(C)および(D)で、THBMECをNGおよびHG培地で培養した。各上部チャンバーに合計450μLの大腸菌懸濁液(OD600=0.5)を加えた。下側チャンバからの培地は、6時間後に寒天プレート上にメッキされた(C)グラフは、カウントされたコロニーの平均平均+/-SEMを示す。(D) グラフは、コントロール+/- SEMとして未処理の細胞に正規化されたコロニーの数えが示されている(n = 3)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60692/60692fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

人間の血液脳関門は、親水性の分子や病原体の脳への侵入を選択的に防ぎます。髄膜炎や術後せん妄を含むいくつかの病理は、血液脳関門の透過性の増加に関連している。ここでは、微生物トラバーサルによるバリア透過性を試験する内皮細胞培養モデルについて説明する。

The human blood-brain barrier (BBB) is characterized by a very low permeability for biomolecules in order to protect and regulate the metabolism of the ...

この方法により、異なる治療で細菌の通過を測定することにより、ヒトの血液脳関門を解析することが可能になる。細菌性髄膜炎と術後せん妄の病因を発見するのに役立つかもしれません。それは簡単な方法であり、治療の効果は細菌の数によって直接表されます。これは、内皮細胞上の化合物の高スループット分析を可能にするように改変することができる。生物安全キャビネットに12ウェルプレートを組み立てることから始めます。プレートと各インサートを開梱し、滅菌鉗子を使用してベースのインサートをつかみ、井戸に入れます。各インサートの多孔質膜に、1マイクロリットルコラーゲンIVとフィブロネクチン混合物あたり10マイクログラムの90マイクロリットルをコーティングし、24時間摂氏37度の細胞培養インキュベーターでプレートをインキュベートします。インキュベーション後、各インサートに1ミリリットルのPBSをピペットし、真空ポンプで吸い込んで、インサートを2回洗浄します。次に、上部および下部のチャンバーにプリウォームDMEM F12培地をピペット処理して膜を平衡化し、37°Cと5%の二酸化炭素でプレートをインキュベートします。ヒト微小血管内皮細胞を播種し、細胞培養フラスコから培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞を洗浄する。5ミリリットルのトリプシンEDTAで細胞を完全に覆い、フラスコを摂氏37度で3〜5分間インキュベートします。5ミリリットルの細胞を15ミリリットルのチューブに移し、培地を含むFCSを5ミリリットル加え、酵素反応を止めます。210回gで3分間懸濁液を遠心分離し、上清を取り除き、培地5ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。セル懸濁液10マイクロリットルを0.4%トリパンブルー染色の10マイクロリットルに加え、10マイクロリットルの混合物を計数チャンバーに加えます。セルカウンターに計数チャンバーを入れて、カウンターが集中していることを確認する適切なプログラムを開始します。カウント後、12ウェルプレートの各上層チャンバーに200,000個の細胞を投入し、2~3日ごとに上下チャンバーの培地を14日間摂氏37度でインキュベートします。14日後、細胞の合流率が顕微鏡で画像化して100%であることを確認してください。透水性測定の1日前に、大腸菌株GM2163のコロニーをLB培地の3ミリリットルに入れる。インキュベーションシェーカーで24時間摂氏37度で細胞を培養します。目的の化合物を含む細胞を処理するには、DMEM F12培地中の最終濃度まで希釈し、この混合物を12ウェルプレートの上下のチャンバーに加え、細胞培養インキュベーターにプレートをインキュベートします。インキュベーション後、抗生物質を含まない培地と完全培地を交換する。600ナノメートルで光学密度を測定し、50ミリリットルファルコンチューブで0.5のOD600にそれを希釈することによって、一晩細菌培養の濃度を決定します。生物学的安全キャビネットでは、12ウェルプレートの各上部チャンバーに450マイクロリットルの細菌溶液を加え、37°Cで6時間プレートをインキュベートします。インキュベーション後、下側のチャンバから下側の部屋に媒体をこぼさないので、各下の部屋から鉗子とサンプル50マイクロリットルの培地を入れて挿入物を取り外します。上層室の細菌からの波及が偽陽性の結果をもたらすので、上側と下の部屋の媒体を厳密に分離することが重要である。各サンプルを別々の寒天プレートに落とし、セルスプレッダーで溶液をストリークします。24時間摂氏37度でプレートをインキュベートし、コロニーを数えます。血液脳関門を通過する微生物に対する糖化の影響を調べるため、細胞を0.5ミリモルグリオキサール溶液で1時間治療し、未治療細胞を対照として作用した。その後、抗AGE抗体による免疫ブロット法を介して糖化を検出した。得られた細菌コロニーをカウントし、絶対的なコロニー数または対照に正規化されたコロニーの相対数として表した。glyoxalで処理されたサンプルは、治療が細胞バリア密度に影響を及ぼすことを示すコロニーの増加を示した。グルコース誘発タンパク質糖化を調べるため、通常のグルコースおよび高グルコース培地でTHBMECsを栽培しました。対照に正規化されたコロニーの絶対数と相対数は、グルコースが血液脳関門の完全性に有意な影響を及ぼさないことを示した。処理された内皮細胞は、プロテオミクスアプローチ、例えば質量分析法によってさらに分析され、プロテオームの変化を分析することができる。この技術は、ヒトの血液脳関門および細菌の通過を理解するのに役立つ。老化やアルツハイマー病などの神経変性疾患の側面を発見するために使用することができます。

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