Name: 流体デバイスと顕微鏡とフローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを越えた多孔質培地における微生物輸送を研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 学ぶ 微生物輸送の研究方法として、マイクロ流体デバイスと顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせた技術を用いて、多孔質培地における細菌の動態を空間スケールを越えて解析する手法です。

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私たちは、ロボットディスペンサーとdispenser.pyスクリプトのセットアップでアントワーヌ・ウィードマーの助けを認めます。

1. 細菌培養条件
<ol><li>ラミナーフローフードの下で作業し、100 μLのグリセロールストックを使用して、GFP タグ付き シュードモナスプティダ KT2440 (1 × 107 mL-1、-80°Cで保存) ルリア ベルタニ (LB) 培地の 5 mL を接種します。一晩250rpmで振りながら30°Cでインキュベートする。</li>
	<li>翌日、100μLの一晩培養を5 mL LB培地で再中断し、同じ条件で5h(指数相)でインキュベートします。2 mLチューブに1mLアリコートをサンプルし、室温(〜15分)および遠心分離機(2300 x g5 分間)まで冷却させます。</li>
	<li>上清を取り除き、ペレットに1mLの運動バッファーを加えます。試料を均質化するために短時間渦を起用する。希釈して所望の細胞濃度に達する、例えば、5 x 105 mL-1.</li>
	<li>河川から派生した自然界を含む実験では、非選択的栽培培地を用意する。例えば、滅菌濾過およびオートクレーブ流水または複素炭素源(LB培地)で修正された人工河川水媒体を使用する。</li>
</ol>2. ポリジメチルシロキサン(PDMS)におけるマイクロ流体デバイスの調製
<ol><li>半径サイズと中心座標で記述された円の行列(つまり流れる不透過性の障害物)で構成されるコンピュータ支援製図(CAD)ソフトウェア18を用いて、所望の多孔質形状を設計する。 注: ランダム化された粒子と孔サイズを持つ多孔性ジオメトリの例を図 1Aに示します。出口に近い障害物のない観測チャネルは、BTCの獲得を促進します。</li>
	<li>選択した幾何学に基づいて、標準的なSU-8フォトリソグラフィ18を使用して金型を準備します。 注:また、金型は専用の微細加工施設からも注文できます。水平面で異種流体流量を得るためには、平均気孔の喉の大きさと同じ大きさのマイクロ流体室の厚さを設計することが重要である。しかし、マイクロ流体装置の寸法が顕微鏡下での観察に適していることを確認してください(例えば、顕微鏡スライドで作業)。</li>
	<li>50gのクロスリンカー(ジメチル、メチル水素シロキサンコポリマー)を90%のエラストマーに重量で添加し、注射器を針なしで使用して、50gのPDMSを調製した。クリーンな条件下で作業し、できるだけほこりを避けます。2つの試薬をきれいな使い捨て容器に混ぜ、真空(100mbar)を30分間塗布して、溶存した空気と気泡を粘性PDMSから取り除きます。</li>
	<li>ペトリ皿(直径100mm、高さ15mm)に金型を入れます。PDMSを金型上に目的の高さ(例えば、2~5mm)に注ぎます。シャーレを覆い、60°Cで4時間(厚い層のために一晩)で治して治します。 注:可視化のために、光はPDMSを通過することができるべきである、したがって、2 mmから5ミリメートルの間の薄い層が望ましい。より厚いレイヤー(&gt;5 mm)はデバイスの透明度を低下させ、より薄いものは、アプリケーション中に変形にさらされます。</li>
	<li>オーブンから金型を取り出し、マイクロ流体装置を室温まで冷却させます。冷却したら、PDMSの所望の部分をメスで慎重に取り除いてください。 注: 金型に強い圧力が発生すると、金型の破壊が発生します。指紋は光透過性に影響を与えるため、素手でPDMSに触れないでください。</li>
	<li>PDMS チャネルの下部 (目的のジオメトリが刻まれた場所) をテープで一時的に密封します。直径0.5mmの生検パンチャーを使用して、マイクロ流体チャネルを貫通して、0.5mm(内径)チューブにフィットする入口と出口を作成します。 注:PDMSの柔らかい性質は、チューブが挿入されると締め付けが保証されます。PDMSがガラスに密封された後、入口および出口チャネルを作ることができません。</li>
	<li>高周波発生器(プラズマボンダー、 材料表)を用いて酸素プラズマ接合を介してマイクロ流体チャネルを密封する。このためには、ケイ酸塩ガラスのスライド(25mm x 75mm)をエタノールで洗浄し、乾燥させます。PDMSチャンネルからテープを取り外し、多孔質側を上に向けてチャンネルを配置します。ケイ酸塩ガラススライドとPDMS表面を室温で約45秒プラズマで処理します。</li>
	<li>PDMSチャネルをケイ酸塩ガラススライドに置き、ホットプレートで30分間100°Cで加熱します。</li>
	<li>マイクロ流体装置をホットプレートから取り出し、室温まで冷却します。PDMS チャネルインレットをチューブに接続します。真空を30分間適用してPDMSから空気を除去します。</li>
	<li>運動性バッファー(10 mM リン酸カリウム、0.1 mM EDTA、1%w/vグルコース、pH 7.0を補う)の 100 mL を準備し、10 μL 分-1で作動するシリンジポンプを使用してマイクロ流体装置に 1 mL を注入します。 注:PDMSはガスが不足しているため(前の真空ステップのため)、気泡は約30分以内に消えます。</li>
</ol>3. ポリ(メチルメタクリル酸)中の流体デバイスの調製
<ol><li>CAD ソフトウェアを使用して、必要なジオメトリを設計します。該当する場合は、顕微鏡下での観察に適した寸法(例えば、適切なホルダーと組み合わせた標準96ウェルプレートの寸法)を確認してください。流体装置は、PMMAのベース(127×127×12mm)と蓋(127×127×12mm)で構成されています。 注意: CADソフトウェアに関する専門知識をお勧めします。テクニカルドローイングの例は 図1Aに示されています。</li>
	<li>細孔コンパートメントを製造するには、高精度マイクロミリング(WF31SA、ミクロン)を使用して、底部PMMA層から0.5mmを取り出し、ゴム製Oリング用の溝(1.1×1.1mm)をミルします。ドリル 12 ねじ穴 (M5)これは、流体デバイスのベースとして機能します。 メモ:流体デバイスの寸法は、顕微鏡の段階と焦点距離に合わせて調整する必要があります。 図 S1には、テクニカル図面が提供されています。</li>
	<li>インとアウトレット用の2つのネジ穴(タイプ1/4-28UNF)を流体装置の上部に、ネジ用に12穴(5.5 mm)を掘削します。これは、流体装置の蓋として機能します。 注:マイクロミリングの専門知識をお勧めします。著者は専門のワークショップからのサポートを使用しています。</li>
	<li>各使用の前および後に流体装置を洗浄し、滅菌するために、HCl 7%で流体装置のベースと蓋を浸し、脱イオン水で3回リンスします。</li>
	<li>12通りの穴を使用して、ベースと蓋を一緒にねじ込みます。</li>
</ol>4. 自動ディスペンサーのセットアップ
注:市販の液体ディスペンサーは高価であり、多くの場合、流体装置の流出から直接分配する柔軟性を提供していません。そのため、XYプロッタロボット(材料表)から安価で柔軟なロボットディスペンサーシステムを組み立てることをお勧めします。
<ol><li>流体装置からの流出を96のウェルプレートに分配するために、ロボットディスペンサーをPMMAプレートと85.8 x 128 mmのミルキャビティに取り付け、深さ1mmで、いくつかの96ウェルプレートを保持します。</li>
	<li>流体装置の流出管をディスペンサーのロボットアームに取り付けます。</li>
	<li>ロボットディスペンサーをgithubからbCNCをダウンロードするには:https://github.com/vlachoudis/bCNCし、プログラムをインストールするための指示に従ってください。</li>
	<li>この資料のサポート資料からdispenser.pyをダウンロードしてください。 注:このpythonコードは、単純なロボットディスペンサーレイアウトのためのbCNCへのプラグインを提供します。</li>
	<li>ロボットディスペンサーをbCNCを実行しているコンピュータに接続し、正しいCOMポートを特定します。</li>
	<li>bCNCで、ホームボタンをクリックして、ロボットディスペンサーをホームポジションに戻します。 注: ホーミングはロボットディスペンサーを既知の位置(x=0,y=0)に戻すため、ディスペンサーの精度が向上します。</li>
	<li>実験に先立ち、適切な量の固定剤(例えば、最終濃度3.7%ホルムアルデヒド)を含むウェルを用いて、十分な数の96ウェルプレートを調製する。 注:例えば、0.2 mL min-1の流量で、100 μLは30秒ごとに各井戸に分配されます。したがって、37%ホルムアルデヒドの10 μLを各ウェルに加えて、ホルムアルデヒドの最終濃度に達し、2~4%の間に到達します。8つの96の井戸の版を使用して、合計768のデータポイントで6時間以上の実験を操作することができます。また、GFPタグ付き細胞はホルムアルデヒドを用いた固定後に蛍光シグナルを失う可能性があることに注意してください。</li>
</ol>5. PDMSマイクロ流体装置を用いた細菌輸送の解析
<ol><li>以前に光学緩衝液で飽和したPDMSマイクロ流体装置を顕微鏡ステージに置く。テープを使用してチューブを固定し、ステージ移動時の流れの乱れを最小限に抑えます。</li>
	<li>顕微鏡ステージを、出口に近い観察チャネルに移動します。明視野顕微鏡または位相コントラストを使用して、観察チャネルの中心に焦点を合わせ、個々の細菌細胞を可視化するために拡大率を調整します。</li>
	<li>光路設定を蛍光顕微鏡に切り替え、カメラの露出時間を調整して個々の細菌細胞(例えば100ms)を解決するか、または細胞の蛍光信号がバックグラウンドノイズよりも少なくとも3倍強くなるようなものにします。</li>
	<li>次に、入口チューブを細菌懸濁液を含む2mLチューブに挿入する。逆ポンプ方向に、1 μL 分-1の流量でサスペンションの引き出しを開始します。</li>
	<li>実験の全期間にわたって、2分ごとに合成画像を記録する観測チャンネル全体の断面をスキャンします。</li>
</ol>6. 基本的な画像処理
注: これらの基本的な画像処理ルーチンの目的は、記録された画像内の細菌の数を数えます。最適な処理手順は、顕微鏡とカメラの技術仕様、ならびに実験で使用される細菌株の蛍光特性に依存するため、調整する必要があります。
<ol><li>最初の形式でイメージ.tiffエクスポートします。</li>
	<li>目的のソフトウェアプラットフォーム(MATLAB、イメージJ、R、またはPython)に画像をインポートします。</li>
	<li>カメラノイズを除去し、これは、画像のピクセル強度のランダムな変化であり、光学収差に対する補正です。これは、各画像にガウスフィルタを適用することができます:フィルタのサイズは、カメラセンサー(例えば、CCDまたはCMOS)の品質に依存します。この光学収差は、同じ光学構成で検体が存在しない状態で収集した参照画像により各画像を正規化することにより除去することができる。</li>
	<li>対象の領域に画像をトリミングします。</li>
	<li>閾値(ピクセル強度)を特定し、閾値を超える値が細菌細胞を含む等を示す。 注: (光収差やノイズのために)画像が不均一に照らされている場合は、局所的な平均強度に基づいてしきい値を選択するアダプティブしきい値を適用すると便利です。</li>
	<li>上で定義したしきい値を各画像から減算します。</li>
	<li>結果の画像を二元化し、細菌細胞は1の値を取り、一方、背景は0の値を取る。</li>
	<li>最小の細菌細胞サイズよりも小さい領域を持つクラスターを除去します。</li>
	<li>二項化された画像を合計して、残りのクラスターの合計ピクセル数を取得します。この場合、細菌細胞の平均サイズ (ピクセル単位) でピクセル数を割ります。</li>
	<li>深度と調査領域を知り、数を濃度(粒子mL-1)に変換する。</li>
	<li>注入された細菌懸濁液の濃度を同定することは基本である。これを行うには、きれいなマイクロ流体装置の観察チャネルに1mLの細菌培養懸濁液を注射器を注入する。画像を記録し、上述の流暢な細菌濃度(C0)を計算します(6.1〜6.10)。</li>
	<li>流暢な細菌濃度(C0)を用いて流出菌濃度(C)を正規化し、C/C0 対時間をプロットすることにより、BTCを分析します。</li>
</ol>7. 細孔スケールで細菌輸送を分析する

<ol><li>多孔質マトリックスを介して輸送される細菌の局所的な速度と軌道を解析するために、顕微鏡ステージを対象領域に移動し、マイクロ流体装置の中心に焦点を合わせます。</li>
	<li>明るいフィールドまたは位相コントラストに顕微鏡を設定します。 注:これは、細菌細胞の蛍光シグナルが、平均細菌時間よりも短い露光時に画像を記録することを許可しない場合にのみ、それ以外の場合は蛍光顕微鏡を使用します。</li>
	<li>時間経過画像を記録し、暴露時に細菌の変位(オブジェクトサイズよりも小さいピクセル数の平均変位よりも短い)をキャプチャし、細菌細胞検出(例えば20msの暴露および50msごとに記録された画像)を最適化する。最も遅い軌道(例えば3分)を十分に記録するために十分な時間をかけて写真を記録する( 統計的に代表される) 注 : コンピュータに十分なディスク領域があることを確認してください。</li>
	<li>バックグラウンドノイズを除去するには、各画像からすべての記録された画像の平均値を減算します。そのためには、結果がピクセルごとにすべての画像の強度の合計となる行列を作成し、それを画像の数で割ります。</li>
	<li>処理された画像(Im)から、数値勾配の係数を決定 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60701/60701eq1v2.jpg" style="opacity: 0.9;"> し、以下に定義されているように最大値(max)で正規化します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60701/60701eq2v2.jpg">  <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/60701/60701eq3v2.jpg">
</li>
	<li>強度しきい値を介して行列Bを二単位化し、ステップ6.7-6.8を参照してください。</li>
	<li>各時点で、バクテリア座標(ピクセル単位またはmm単位でx,y)と画像取得の時間を3列のファイルに記録します。</li>
	<li>最後に、粒子追跡スクリプトを適用して、記録されたデータを処理し、細菌の軌跡を計算します。たとえば、確立されたプロトコル19と自由に利用可能なMatlabパーティクルトラッキングコード(http://site.physics.georgetown.edu/matlab/)を使用します。</li>
</ol>8. 堆積プロファイルによる細菌濾過の研究
<ol><li>蛍光顕微鏡によるGFPタグ付 きP.プチダ KT2440細胞の堆積プロファイルを取得するには、前に多孔質チャネル全体の合成画像を記録し、それは背景であり、マイクロ流体装置を介して細菌懸濁液を注入した後。シグナルを漂白することなく、細菌蛍光シグナル(例えば100ms)を獲得できる露光時間を使用してください。</li>
	<li>目的のソフトウェアプラットフォームでイメージをエクスポートし、インポートします(6.1-6.2を参照)。</li>
	<li>細菌の注入後に記録された画像から背景を削除します。</li>
	<li>多孔質チャネルの横切り部に沿って保持された細菌の総蛍光シグナルを統合する。</li>
	<li>堆積プロファイルを計算するために、積分された蛍光信号と多孔性チャネル長をプロットします。</li>
</ol>9. PMMA流体デバイスとフローサイトメトリーを用いた細菌輸送の解析
<ol><li>蠕動ポンプを50 cm(1mm内径)チューブを使用して入口に接続し、同じチューブを使用して自動ディスペンサーで流出します(50 cm、セクション4を参照)。 注:ポンプを使用して栽培培地を分配し、細菌細胞を注入します。Luer-lock コネクタと三方弁を使用して、一定の速度の放出中に媒体と細菌の懸濁液の間をシフトします。</li>
	<li>流体装置中のポンプ栽培媒体。ロボットディスペンサーに固定された出口管に媒体が到着することに注意してください。</li>
	<li>0.2 mL min-1の流速でPMMA流体デバイスを介して細菌懸濁液を注入し始める、</li>
	<li>細菌が流体デバイスに到達すると、自動ディスペンサーをオンにします。</li>
	<li>パルス注入を行うために、いくつかの細孔容積(例えば30)のための細菌懸濁液を注入し、次に実験終了まで培養培地に注入を切り替える。 注:流体デバイスの細孔容積は約0.2mLであり、したがって、1分間に1つの孔容積全体が交換されるプロセド流量で。</li>
	<li>96ウェルプレートが完成したら、プレートを覆って蒸発を減らし、4°Cで保管します。</li>
	<li>フローサイトメトリーを介して細菌の存在量を分析し、確立されたプロトコル20に従う。 注:例えば、緑色蛍光核酸染色(材料表)を0.025 mM(超純水)に25μLずつ添加します。細菌DNAを染色し、細菌の豊富さをフローサイトメトリーで定量化することができます。暗い 15 分間サンプルをインキュベートし、488 nm レーザーと 515 nm の検出器を搭載したフロー サイトメーターを使用して分析します。</li>
	<li>BTC分析の前に、固定性および汚れの添加によるサンプルの希釈を考慮してください。固定性と汚れを考慮して、1.35倍の正しい細菌の存在量。</li>
</ol>

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著者らは、利益相反はないと宣言している。

ここでは、単一細胞レベルと人口レベルで多孔質系を介した微生物の輸送を研究する2つの手段を提案する。BTCモデリングを用いた輸送現象の研究は、生態系規模での病原体や汚染物質の拡散に関する貴重な洞察を提供してきましたが、実験室での実験から現場条件へのスケールの困難は依然として存在しています。ここで説明するツールは、多孔質環境での輸送に関連する微生物の生態学的戦略をよりよく理解するために、研究者が実験的に空間的および時間的尺度を解決することを可能にする。実験者は、これらのシステムを使用または変更して、運動性以外の他の微生物形質(気化やクォーラムセンシングなど)を研究したり、多孔質マトリックスの幾何学的または他の生息地特性を変更したりすることができる。さらに、これらのシステムを使用すると、細菌輸送行動を堆積プロファイルに容易に結合することができ、コロニー形成パターンに関する重要な洞察を提供し、バイオフィルムが局所的な流れ場をどのように変更するかを理解することが重要である。多孔質培地を分散・植民地化する微生物戦略の理解を深めることで、モデル予測が改善され、病原体の広がりや汚染物の封じ込めの管理に寄与することが期待されます。システムのさらなる改変は...

多孔質媒体を介した微生物の輸送を理解することを目的とした研究は、主に汚染1、疾患2 の伝染およびバイオレメディエーション3の懸念によって駆動されてきた。この点に関して、細菌は主に輸送モデル4 において粒子として処理されており、バイオフィルムからの濾過、緊張、重力沈降または再動員などのプロセスが微生物5の保持または輸送の促進要因として同定されている。しかし、多孔質の風景を通して細菌の輸送を研究することは、これらの複雑な環境での成功を支える生態学的戦略についても私たちに知らせることができます。しかし、これは単一細胞、集団または微生物群集レベルで動作する新しい実験および数学的モデルを必要とする。
河川や河川の低密度帯に見られるような自然多孔質環境は、バイオフィルム形成微生物6の多様なコミュニティによって密集して植民地化されている。バイオフィルムは、流れを変え、したがって液相77,88における細菌の輸送および分散を変える構造を形成する。孔径での細菌の輸送は、多孔質マトリックスの制約された空間の可用性に依存 し、運動関連の分散は、人口密度の低い地域の資源の競争を減らすことによって個々の適性を高める効果的な方法である可能性がある。一方、モチル細菌はまた、多孔質マトリックスのより孤立した領域に到達することができ、そのような領域の拡張探査は、運動性集団10に生態学的機会を提供し得る。より大きな空間スケールでは、バイオフィルムの成長は、毛穴の(部分的な)詰まりにもつながって流路を流れ、したがって、さらにチャネライズ化および異種の流れ条件11の確立に導く。これは、栄養供給と分散容量、周波数と距離の結果を持っています。たとえば、優先的な流れは、いわゆる「高速トラック」を生成することができ、モタイル細菌は、これらのトラック12に沿った局所的な流れよりもさらに高速を達成することができる。これは、新しい生息地の探査を増やす効果的な方法です。
多孔質媒体中の可動性および非運動性細菌(および粒子)の輸送の研究のために、様々なツールが役に立つ。数値モデルは、アプリケーションにとって重要な大きな予測能力を持っていますが、多くの場合、固有の仮定4によって制限されます。実験室規模実験13,14,14を画期的曲線(BTC)モデリングと組み合わせることで、貼付効率15に対する細菌細胞表面特性の重要性に関する重要な知見を提供している。典型的には、BTCs(すなわち、一定の位置での一連の粒子濃度)は、実験装置の流出時の細胞数の定率放出および測定を介して得られる。この文脈では、BCCは多孔質マトリックス中の細菌の対流分散ダイナミクスを反映し、添付を考慮したシンク用語によって拡張することができる。しかし、BTCsのモデリングだけでは、輸送プロセスのための多孔質基質またはバイオフィルムの空間的構成の役割は解決しない。分散性や堆積プロファイルのような他の巨視的な観測可能な観測は、空間分布または保持された粒子または成長するコミュニティに関する重要な情報を提供することが証明されている。マイクロ流体は、顕微鏡,調査9、12、16、12および最近の研究910を除いて多孔質媒体の輸送を研究することを可能にする技術であり、実験系は典型的には、単一の長さの解像度スケール、すなわち孔スケールまたは全体の流体装置スケールに制約される。16
ここでは、異なるスケールで多孔質の風景の中でのモチル菌と非運動性細菌の輸送を研究するための組み合わせ方法のスイートを紹介します。我々は、BTC分析を用いて、孔径での細菌輸送の観測と、より大きなスケールでの情報を組み合わせたものである。ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いたソフトリソグラフィーから構築された微小流体デバイスは、生体適合性、化学薬品の範囲に耐性、低コストで複製可能、優れた光学透過性と微視的観察に不可欠な低い自己蛍光を提供します。PDMSに基づくマイクロ流体は、これまで、単純なチャネル17 またはより複雑な幾何学12における微生物の輸送を研究するために使用されてきた。しかし、一般的にマイクロ流体実験は、短期的な地平線に焦点を当て、生きている細胞のエピ蛍光顕微鏡観察は、一般的に遺伝子組み換え株(例えば、GFPタグ付き株)に限定される。ここでは、PDMSベースのマイクロ流体デバイスを、フローサイトメトリーと組み合わせてポリ(メチルメタクリル酸メチルメタクリル酸塩)(PMMA、プレキシガラスとも呼ばれる)から製造された大型デバイスと組み合わせて、細菌輸送を研究するツールを紹介します。PDMSとPMMAはガス透過性と表面特性が異なるため、細菌輸送を研究する補完的な機会を提供します。マイクロ流体デバイスはより制御された環境を提供する一方で、より大きなデバイスは長期間にわたる実験を可能にするか、自然細菌群集を使用することができます。専用領域での高い時間分解能での顕微鏡計数は、PDMSベースのマイクロ流体デバイスでBTCを得るために使用される。PMMAベースのデバイスからBTCモデリング用のセルカウントを得るために、フローサイトメトリーと組み合わせた自己構築自動液体ディスペンサーを導入します。この設定では、細胞は流体装置を通過し、連続して96ウェルプレートに分配されます。時間分解能は、正確に分配できる最小体積と、流体デバイスを通る中流量によって制限されます。ウェル内の固定は成長を防ぎ、下流のフローサイトメトリック列挙のためのDNA染色を促進する。輸送実験中の細菌の増殖を防ぐために、我々は最小限の培地(運動バッファーと呼ばれています)を使用します。
異なるスケールでの流体デバイスの調製のためのプロトコルが容易に利用可能であるため、我々は簡単にそのようなデバイスを生成するための技術を導入し、むしろ、BTCsを記録するための実験的な手順に焦点を当てています。同様に、微生物のフローサイトメトリック列挙に対して様々なルーチンが存在し、ユーザーはフローサイトメトリーによって得られた結果を解釈するための専門的な知識を必要とします。微小流体デバイスの新しい使用と顕微鏡イメージングを組み合わせて、蛍光タグ付き細胞のBTCを記録することを報告します。細孔スケールでは、局所的な速度と軌道は画像処理によって得られます。また、PMMAベースの流体デバイスをフローサイトメトリックカウントと組み合わせて使用し、天然の流れバイオフィルムによって植民地化された多孔質環境におけるモチル細胞および非モタイル細胞の細菌輸送を観察することを実証する。

<table><tbody><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エラストマー Sylgard 184</td><td>Dowsil</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター NovoCyte</td><td>Acea</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td></td><td>https://www.makeblock.com/project/xy-plotter-robot-kit</td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リキッドディスペンサー、XY プロッター ロボットキット</td><td>makeblock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 Axio Imager</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 AxioZoom v16</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド、75 mm &times; 25 mm</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 蠕動ポンプ</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマボンダー コロナ SB</td><td>ブラックホールラボ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジポンプ New Era NE 4000</td><td>New Era Syto</td><td></td><td></td></tr><tr><td>13 Green Fluorescent Nucleic Acid</td><td>Stain Molecular Probes, Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WF31SA Universal milling machine</td><td>Mikron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

流体デバイスと顕微鏡とフローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを越えた多孔質培地における微生物輸送を研究

Combining Fluidic Devices with Microscopy and Flow Cytometry to Study Microbial Transport in Porous Media Across Spatial Scales

多孔質媒体における微生物の輸送、分散、堆積を理解することは、流体力学、生態学、環境工学など多様なトピックからなる複雑な科学的課題です。異なる空間スケールでの多孔質環境での細菌輸送のモデリングは、細菌輸送の結果をより良く予測するために重要ですが、現在のモデルはしばしば実験室から現場の状態にスケールアップに失敗します。ここでは、2つの空間スケールで多孔質媒体での細菌輸送を研究するための実験的なツールを紹介する。これらのツールの目的は、透明多孔質マトリックスに注入された細菌の巨視的な観測(画期的な曲線や堆積プロファイルなど)を得ることにあります。小スケール(10-1000 μm)では、マイクロ流体デバイスを光学ビデオ顕微鏡と画像処理と組み合わせて画期的な曲線を得るとともに、個々の細菌細胞を細孔スケールで追跡します。より大きいスケールでは、フローサイトメトリーは、画期的な曲線を得るために、自作のロボットディスペンサーと組み合わされます。我々は、細菌が小川の低熱ゾーンのような複雑な多孔質媒体で輸送される方法をよりよく理解するためのこれらのツールの有用性を示す。これらのツールはスケールをまたいで同時に測定するので、アップスケーリングにとって非常に重要なメカニズムベースのモデルへの道を開きます。これらのツールの応用は、新しいバイオレメディエーションアプリケーションの開発に貢献するだけでなく、多孔質基質を植民地化する微生物の生態学的戦略に新たな光を当てる。

提示されたワークフローの機能性を説明するために、バイオレメディエーションおよびバイオテクノロジーに重要なグラム陰性モチル菌である遺伝子組み換えシュードモナスプチダKT2440を用いた実験を行った。GFP生産を発現するこの株の遺伝子組み換えバージョンは市販されている。運動性に関する構造遺伝子や調節遺伝子を欠くP.プチダKT2440の非運動性株も利用可能です。両方を用いて、モチルGFPタグ付きP.プチダKT2440を用いて、ピラーのランダム配列を持つPDMSマイクロ流体デバイスで逐次実験を行い、記録されたBTCs(図2A)。BCCは、注入された細胞の濃度(C0)に正規化されています。同時に、上記のように画像処理と粒子追跡を介して、孔スケールでの細菌軌跡を可視化した(図2B)。
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画期的な曲線(BTCs)は、多孔質媒体における細菌の輸送を研究するための効率的なツールです。ここでは、マイクロコピーとフローサイトメトリックカウントと組み合わせて流体デバイスに基づくツールを紹介し、BTCsを取得します。

Understanding the transport, dispersion and deposition of microorganisms in porous media is a complex scientific task comprising topics as diverse as ...

多孔質系における細菌の輸送を研究することは、汚染、病気の蔓延、およびバイオレメディエーションに関して重要である。単一細胞で動作する数理モデルにおけるこれらの実験では、集団と微生物群集レベルが必要である。ここでは、マイクロ流体デバイスと顕微鏡を用いた細菌輸送を研究するツールや、フローサイトメトリーと組み合わせたより大きなデバイスを紹介します。顕微鏡検査とフローサイトメトリーとマイクロ流体デバイスの組み合わせは、異なる空間スケールで細菌輸送現象を研究する可能性の範囲を提供しています。このプロトコルを十分に探求するために、顕微鏡、基本的な画像処理、マイクロ流体デバイスの設計、およびフローサイトメトリーの習得に関する以前の経験を持つものが示唆されています。このビデオでは、異なる空間スケールで細菌輸送を研究する2つの方法について説明します。マイクロ流体デバイスに基づく最初の方法は、個々の細胞を数えるために顕微鏡に依存しています。このシステムは、細孔から多孔質システムスケール全体までの複数の空間スケールにわたる細菌輸送を研究するために使用できます。第2の方法は、自動化されたディスペンサーおよびフローサイトメトリーに結合されたより大きな流体装置を使用して、多孔質システム全体の規模で細菌輸送現象を研究するために使用することができる。このような方法は、実験室規模のカラム研究や小規模なフィールド調査にも展開できます。まず、円のマトリックスから構成される目的の多孔質ジオメトリを設計します。選択したジオメトリに基づいて、標準的なSU-8フォトリソグラフィを使用して金型を準備します。きれいな使い捨て容器の中でエラストマーの90%を10%のエラストマーに10%重量で加えて50グラムのPDMSを調製し、2つの試薬をクリーンなツールと混合します。溶存空気と気泡を除去するために30分間100ミリバールの真空を適用します。ペトリ皿に金型を入れ、2〜5ミリメートルの間の所望の高さにPDMSを鋳型に注ぎます。ペトリ皿を蓋で覆い、少なくとも4時間摂氏60度に保ちます。その後、マイクロ流体装置を室温まで冷却するようにします。冷却したら、PDMSの所望の部分をメスで慎重に取り除いてください。PDMSチャネルの底面をテープで一時的に密封します。直径0.5ミリメートルのパンチャーを使用して、チャンネルを貫通して入口と出口を作成します。PDMSチャンネルからテープを取り出し、多孔質側を上に向けてチャンネルを配置します。ガラススライドとPDMS表面を室温で約45秒間プラズマで処理します。前処理されたPDMSチャネルを前処理ガラススライドに置き、ホットプレートで30分間摂氏100度で熱し、ホットプレートからマイクロ流体装置を取り外し、室温まで冷却します。PDMSから空気を除去するために30分間真空を適用します。細孔コンパートメントを含むベースを製造するには、高精度マイクロミリングを使用して、ベースPMMA層から0.5ミリメートルを除去し、ゴム製Oリングの場合は1.1×1ミリメートルの大きさの溝を粉砕します。流入口と出口用の2つのネジ穴を流体装置の上部に、ネジ用に12個の穴を開けます。これは、流体装置の蓋として機能します。流体装置を洗浄した後、12通りの穴を使用して、ベースと蓋をねじ込みます。マイクロ流体を真空から取り出し、顕微鏡ステージに置きます。シリンジポンプを使用して、運動バッファーで飽和します。ブライトフィールド顕微鏡または位相コントラストを使用して、個々の細菌細胞を可視化し、観察チャネルの中心に焦点を合わせて拡大率を調整します。光路設定を蛍光顕微鏡に切り替えます。個々の細菌細胞を解決するためにオフセットとカメラ露出時間を通して焦点を調整します。この場合、100 ミリ秒。次に、入口チューブを細菌懸濁液を含む2ミリリットルチューブに挿入する。ポンプ方向を逆にして、1分間に1マイクロリットルの流量でサスペンションの引き出しを開始します。観測チャネル全体の断面をスキャンし、毎分画像を記録します。目的のソフトウェア プラットフォームにイメージをインポートします。パーティクルが記録されていない場合は、最初の画像の平均として背景を記録します。各画像から背景を引いて、カメラのノイズと光学収差を除去します。対象の領域に画像をトリミングします。閾値よりも大きい値が細菌細胞を含むように、細胞蛍光ピクセル強度に等しいしきい値を特定します。画像処理を使用して、各画像からしきい値を引きます。生じた画像を二元化して、細菌細胞が1の値を取るのに対し、背景はゼロの値を取るようにします。最小の細菌細胞サイズより小さい領域をピクセル単位で除去します。二項化された画像を合計して、残りのクラスターの合計ピクセル数を取得します。細胞数の推定値を得るために、細菌細胞の平均サイズでピクセル数を割ります。ミリリットルあたりの粒子の濃度にカウントを変換します。注入された細菌懸濁液の濃度を特定するには、注射器を用いて清潔なマイクロ流体装置の観察チャネルに細菌懸濁液を注入する。画像を記録し、先に示したように、流暢な細菌濃度を計算します。流暢な細菌濃度C0で廃菌濃度Cを正規化し、C0以上の時間でCをプロットすることにより、画期的な曲線を視覚化します。多孔質マトリックスを介して輸送される細菌の局所的な速度と軌道を解析するために、顕微鏡ステージを対象領域に移動し、マイクロ流体装置の中心に焦点を合わせます。光学構成を位相コントラストまたは蛍光顕微鏡に設定します。タイムラプス画像と、細菌の変位を捉えるのに十分な短い露出時間を記録します。この場合、50 ミリ秒。十分な時間 (例えば 3 分) にわたって画像を記録します。各画像からノイズを除去するには、記録されたすべての画像の合計の平均である背景を減算します。数値勾配の係数を決定し、最大値で正規化します。細菌座標と画像取得の時刻を検索して、3 列のファイルに記録します。パーティクル追跡解析を実行して、記録されたデータを処理し、軌道を計算します。堆積プロファイルを得るために、前に、すなわち背景であり、マイクロ流体装置を介して細菌懸濁液を注入した後に、多孔質チャネル全体の合成画像を記録する。細菌の注入後に記録された画像から背景を削除します。多孔質チャネルの長さxの横切り部分に沿った細菌蛍光信号の合計として、堆積プロファイルDを計算する。多孔質チャネル長に対する局所蛍光信号として堆積プロファイルを可視化します。自動ディスペンサーをセットアップするには、ロボットディスペンサーを流体デバイスの近くに置きます。ロボットディスペンサーをBCNCを実行しているコンピュータに接続し、正しいcomポートを特定します。BCNCでは、ホームボタンをクリックして、ロボットディスペンサーをホームポジションに戻します。長さ50センチメートル、内径1ミリメートルのチューブを使用して、浸透性ポンプを入口に接続し、同じチューブを使用して自動ディスペンサーで流出します。流体装置を介したポンプ栽培媒体。ロボットディスペンサーに固定された出口管に媒体が到着し、流出を収集する96ウェルプレートを置きます。同時に、ロボットディスペンサーを作動させ、PMMA流体装置を通して1分間に0.2ミリリットルの流量で細菌懸濁液を注入する。いくつかの細孔容積に相当する細菌懸濁液を注入する。例えば、流体装置の体積の30倍である。注射後、実験終了まで滅菌培養培地に切り替えます。96ウェルプレートが完成したら、プレートを覆い、フローサイトメトリー分析まで摂氏4度で保存します。フローサイトメトリーでサンプルを分析し、流暢な細菌濃度C0で排水細菌濃度Cを正規化し、C0以上のCを時間でプロットすることにより、画期的な曲線を可視化します。本研究では、モチルおよび非可換シュードモナスプチダKT2440の両方を用いて、ピラーのランダム配列を有するPDMSマイクロ流体デバイスで逐次実験を行った。注入された細胞の濃度に正規化された画期的な曲線、ならびに孔スケールでの細菌の軌跡がここに示されている。PMMAから粉砕した大規模な流体デバイスの実験も行った。モチルおよび非可動シュードモナスプチダKT2440を、定期的に間隔を置いた多孔質マトリックスに注入した。驚くべきことに、バイオフィルムを欠いた多孔質環境において、モチルおよび非モチルシュードモナスプチダKT2440は、画期的な曲線に基づいて著しく異なる輸送行動を示した。複雑なストリームバイオフィルムコミュニティで48時間コロニー形成された多孔質マトリックスでは、モチルと非モチルシュードモナスプチダKT2440の間の画期的な曲線のこれらの違いが消失した。私たちはこのシステムを使用して河川内の細菌輸送を研究しますが、これらのツールは、他のエンジニアリングおよび環境システムにおける細菌輸送現象を研究するために容易に調整することができます。水和された多孔質媒体を介した細菌輸送は、複数の空間スケール上のプロセスをカプセル化します。ここで提示された方法論は、孔スケールでの細菌の局所変位を多孔質培地全体の顕微鏡輸送に結び付けることを可能にする。

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環境

マイクロ流体デバイスは、リアルタイムでかつ適切な物理的なスケールで複雑な自然のプロセスを可視化するために使用することができます。我々は地下で細菌の増殖と輸送を研究するための自​​然な多孔質媒体の主要な機能を模倣する簡単なマイクロ流体デバイスを開発しました。...

多孔質媒体中の微生物トランスポート研究のためのシンプルなマイクロ流体システム：マイクロワールドでのウィンドウ

出典: Scheidweiler, D., 他 流体装置と顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを超えた多孔質培地内の微生物輸送を研究すること。 J. Vis.

マイクロ流体装置を用いた細菌の運動性評価

出典: Kurz, D. L., 他 多孔質培地におけるバイオクロッキングを研究するためのマイクロ流体プラットフォーム。 J. Vis. Exp.

バイオフィルム形成中のリアルタイムイメージングおよび圧力追跡のためのマイクロ流体装置

我々は、コンパクトでコスト効果の高い光流体添付ファイルを使用して携帯電話上の蛍光顕微鏡やイメージングフローサイトメトリーツールの統合、我々の最近の結果を確認します。これらの携帯電話基にしたマイクロ分析装置は、以下のようなリソースが限られた設定で、例えば、水試料のハイスループットスクリーニングのためだけでなく、様々な細胞計数タスクを実行するように、フローサイトメトリー分析のために有用かもしれません。...

携帯電話上の広視野蛍光顕微鏡と蛍光イメージングフローサイトメトリー

バイオフィルムは、周囲の環境と複雑な相互作用を持っています。バイオフィルムと環境の相互作用を包括的に研究するために、バイオフィルム開発のための不均一な化学環境を作り出すための一連の方法、局所的な流速の定量化、およびバイオフィルムコロニー内および周囲の物質輸送を分析するための一連の方法を紹介します。...

バイオフィルムと生息地異質の共同開発を特徴付けるための方法

我々は、複数のマイクロ流体チャネル中の粒子の検出及びサイズを多重化するために、符号分割多重アクセス（CDMA）を有する抵抗パルスセンシング（RPS）を組み合わせた統合表面電極ネットワークとマイクロ流体プラットフォームを示します。...

粒子の空間追跡のための多重化された電子の検出とマイクロ流体プラットフォーム

発達における集団細胞移動、創傷治癒、癌転移は、多くの場合、成長因子またはシグナル伝達分子の勾配によって導かれる。ここでは、トラクション顕微鏡とマイクロ流体システムを組み合わせた実験システムと、生化学的勾配下での集団移動の仕組みを定量化する方法のデモンストレーションを行います。...

化学的集団移動のためのマイクロ流体学と統合された牽引顕微鏡

土壌の不透明度のために、その構成微生物間の相互作用は、細胞分解能で容易に視覚化することができない。ここでは、真菌と微生物の相互作用を調査するための新しい機会を提供する2つのマイクロ流体ツールを紹介します。これらのデバイスは汎用性と使いやすさを備えており、細胞レベルでの高時空間制御と高解像度イメージングを可能にします。...

細胞レベルで真菌 - 微生物相互作用をプロービングするためのマイクロ流体ツール

本プロトコルは、高解像度顕微鏡イメージングと同時圧力差測定を組み合わせることにより、...

多孔質媒体中のバイオクラッシングを研究するためのマイクロ流体プラットフォーム

このプロトコルは、イメージングフローサイトメトリーを使用して微生物の自己凝集を測定するための定量的アプローチを説明しています。...

微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

このプロトコルでは、微小管ポリマーの力学を調査するのに適したマイクロ流体デバイスの設計と製造について詳しく説明します。マイクロファブリケーション、自動フロー制御、および計算モデリング技術の合成により、 in...

微小管ポリマーメカニクス研究のためのマイクロ流体工学に基づくアプローチの開発

学ぶ 微生物輸送の研究方法として、マイクロ流体デバイスと顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせた技術を用いて、多孔質培地における細菌の動態を空間スケールを越えて解析する手法です。

流体デバイスと顕微鏡とフローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを越えた多孔質培地における微生物輸送を研究

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