流体デバイスと顕微鏡とフローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを越えた多孔質培地における微生物輸送を研究

多孔質系における細菌の輸送を研究することは、汚染、病気の蔓延、およびバイオレメディエーションに関して重要である。単一細胞で動作する数理モデルにおけるこれらの実験では、集団と微生物群集レベルが必要である。ここでは、マイクロ流体デバイスと顕微鏡を用いた細菌輸送を研究するツールや、フローサイトメトリーと組み合わせたより大きなデバイスを紹介します。

顕微鏡検査とフローサイトメトリーとマイクロ流体デバイスの組み合わせは、異なる空間スケールで細菌輸送現象を研究する可能性の範囲を提供しています。このプロトコルを十分に探求するために、顕微鏡、基本的な画像処理、マイクロ流体デバイスの設計、およびフローサイトメトリーの習得に関する以前の経験を持つものが示唆されています。このビデオでは、異なる空間スケールで細菌輸送を研究する2つの方法について説明します。

マイクロ流体デバイスに基づく最初の方法は、個々の細胞を数えるために顕微鏡に依存しています。このシステムは、細孔から多孔質システムスケール全体までの複数の空間スケールにわたる細菌輸送を研究するために使用できます。第2の方法は、自動化されたディスペンサーおよびフローサイトメトリーに結合されたより大きな流体装置を使用して、多孔質システム全体の規模で細菌輸送現象を研究するために使用することができる。

このような方法は、実験室規模のカラム研究や小規模なフィールド調査にも展開できます。まず、円のマトリックスから構成される目的の多孔質ジオメトリを設計します。選択したジオメトリに基づいて、標準的なSU-8フォトリソグラフィを使用して金型を準備します。

きれいな使い捨て容器の中でエラストマーの90%を10%のエラストマーに10%重量で加えて50グラムのPDMSを調製し、2つの試薬をクリーンなツールと混合します。溶存空気と気泡を除去するために30分間100ミリバールの真空を適用します。ペトリ皿に金型を入れ、2〜5ミリメートルの間の所望の高さにPDMSを鋳型に注ぎます。

ペトリ皿を蓋で覆い、少なくとも4時間摂氏60度に保ちます。その後、マイクロ流体装置を室温まで冷却するようにします。冷却したら、PDMSの所望の部分をメスで慎重に取り除いてください。

PDMSチャネルの底面をテープで一時的に密封します。直径0.5ミリメートルのパンチャーを使用して、チャンネルを貫通して入口と出口を作成します。PDMSチャンネルからテープを取り出し、多孔質側を上に向けてチャンネルを配置します。

ガラススライドとPDMS表面を室温で約45秒間プラズマで処理します。前処理されたPDMSチャネルを前処理ガラススライドに置き、ホットプレートで30分間摂氏100度で熱し、ホットプレートからマイクロ流体装置を取り外し、室温まで冷却します。PDMSから空気を除去するために30分間真空を適用します。

細孔コンパートメントを含むベースを製造するには、高精度マイクロミリングを使用して、ベースPMMA層から0.5ミリメートルを除去し、ゴム製Oリングの場合は1.1×1ミリメートルの大きさの溝を粉砕します。流入口と出口用の2つのネジ穴を流体装置の上部に、ネジ用に12個の穴を開けます。これは、流体装置の蓋として機能します。

流体装置を洗浄した後、12通りの穴を使用して、ベースと蓋をねじ込みます。マイクロ流体を真空から取り出し、顕微鏡ステージに置きます。シリンジポンプを使用して、運動バッファーで飽和します。

ブライトフィールド顕微鏡または位相コントラストを使用して、個々の細菌細胞を可視化し、観察チャネルの中心に焦点を合わせて拡大率を調整します。光路設定を蛍光顕微鏡に切り替えます。個々の細菌細胞を解決するためにオフセットとカメラ露出時間を通して焦点を調整します。

この場合、100 ミリ秒。次に、入口チューブを細菌懸濁液を含む2ミリリットルチューブに挿入する。ポンプ方向を逆にして、1分間に1マイクロリットルの流量でサスペンションの引き出しを開始します。

観測チャネル全体の断面をスキャンし、毎分画像を記録します。目的のソフトウェア プラットフォームにイメージをインポートします。パーティクルが記録されていない場合は、最初の画像の平均として背景を記録します。

各画像から背景を引いて、カメラのノイズと光学収差を除去します。対象の領域に画像をトリミングします。閾値よりも大きい値が細菌細胞を含むように、細胞蛍光ピクセル強度に等しいしきい値を特定します。

画像処理を使用して、各画像からしきい値を引きます。生じた画像を二元化して、細菌細胞が1の値を取るのに対し、背景はゼロの値を取るようにします。最小の細菌細胞サイズより小さい領域をピクセル単位で除去します。

二項化された画像を合計して、残りのクラスターの合計ピクセル数を取得します。細胞数の推定値を得るために、細菌細胞の平均サイズでピクセル数を割ります。ミリリットルあたりの粒子の濃度にカウントを変換します。

注入された細菌懸濁液の濃度を特定するには、注射器を用いて清潔なマイクロ流体装置の観察チャネルに細菌懸濁液を注入する。画像を記録し、先に示したように、流暢な細菌濃度を計算します。流暢な細菌濃度C0で廃菌濃度Cを正規化し、C0以上の時間でCをプロットすることにより、画期的な曲線を視覚化します。

多孔質マトリックスを介して輸送される細菌の局所的な速度と軌道を解析するために、顕微鏡ステージを対象領域に移動し、マイクロ流体装置の中心に焦点を合わせます。光学構成を位相コントラストまたは蛍光顕微鏡に設定します。タイムラプス画像と、細菌の変位を捉えるのに十分な短い露出時間を記録します。

この場合、50 ミリ秒。十分な時間 (例えば 3 分) にわたって画像を記録します。各画像からノイズを除去するには、記録されたすべての画像の合計の平均である背景を減算します。

数値勾配の係数を決定し、最大値で正規化します。細菌座標と画像取得の時刻を検索して、3 列のファイルに記録します。パーティクル追跡解析を実行して、記録されたデータを処理し、軌道を計算します。

堆積プロファイルを得るために、前に、すなわち背景であり、マイクロ流体装置を介して細菌懸濁液を注入した後に、多孔質チャネル全体の合成画像を記録する。細菌の注入後に記録された画像から背景を削除します。多孔質チャネルの長さxの横切り部分に沿った細菌蛍光信号の合計として、堆積プロファイルDを計算する。

多孔質チャネル長に対する局所蛍光信号として堆積プロファイルを可視化します。自動ディスペンサーをセットアップするには、ロボットディスペンサーを流体デバイスの近くに置きます。ロボットディスペンサーをBCNCを実行しているコンピュータに接続し、正しいcomポートを特定します。

BCNCでは、ホームボタンをクリックして、ロボットディスペンサーをホームポジションに戻します。長さ50センチメートル、内径1ミリメートルのチューブを使用して、浸透性ポンプを入口に接続し、同じチューブを使用して自動ディスペンサーで流出します。流体装置を介したポンプ栽培媒体。

ロボットディスペンサーに固定された出口管に媒体が到着し、流出を収集する96ウェルプレートを置きます。同時に、ロボットディスペンサーを作動させ、PMMA流体装置を通して1分間に0.2ミリリットルの流量で細菌懸濁液を注入する。いくつかの細孔容積に相当する細菌懸濁液を注入する。

例えば、流体装置の体積の30倍である。注射後、実験終了まで滅菌培養培地に切り替えます。96ウェルプレートが完成したら、プレートを覆い、フローサイトメトリー分析まで摂氏4度で保存します。

フローサイトメトリーでサンプルを分析し、流暢な細菌濃度C0で排水細菌濃度Cを正規化し、C0以上のCを時間でプロットすることにより、画期的な曲線を可視化します。本研究では、モチルおよび非可換シュードモナスプチダKT2440の両方を用いて、ピラーのランダム配列を有するPDMSマイクロ流体デバイスで逐次実験を行った。注入された細胞の濃度に正規化された画期的な曲線、ならびに孔スケールでの細菌の軌跡がここに示されている。

PMMAから粉砕した大規模な流体デバイスの実験も行った。モチルおよび非可動シュードモナスプチダKT2440を、定期的に間隔を置いた多孔質マトリックスに注入した。驚くべきことに、バイオフィルムを欠いた多孔質環境において、モチルおよび非モチルシュードモナスプチダKT2440は、画期的な曲線に基づいて著しく異なる輸送行動を示した。

複雑なストリームバイオフィルムコミュニティで48時間コロニー形成された多孔質マトリックスでは、モチルと非モチルシュードモナスプチダKT2440の間の画期的な曲線のこれらの違いが消失した。私たちはこのシステムを使用して河川内の細菌輸送を研究しますが、これらのツールは、他のエンジニアリングおよび環境システムにおける細菌輸送現象を研究するために容易に調整することができます。水和された多孔質媒体を介した細菌輸送は、複数の空間スケール上のプロセスをカプセル化します。

ここで提示された方法論は、孔スケールでの細菌の局所変位を多孔質培地全体の顕微鏡輸送に結び付けることを可能にする。