Name: 並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: 学ぶ並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析法。質量分析を用いた標的プロテオミクスアプローチで、ユビキチン連鎖トポロジーの変化を特定・定量します。生化学研究に有用です。

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著者らは、代表的な結果に記載されているようにMG-132の治療を伴う細胞ペレットの作成に関するセリーヌ・ジャンティの支援と、プロトコルで使用される大腸菌ペレットの提供に対するエリーゼ・モマーツに感謝したいと考えている。

1. 重いペプチド標準の調製
<ol><li>購入した重いペプチドのサプライヤーと品質に応じて、重いペプチドを希釈する必要があります。このプロトコルは、表1で報告されたペプチド配列を使用し、リジン(13C615N2-リジン)またはアルギニン(13C615N4-アルギニン)に修飾したC末端アミノ酸を有する。<ol>
<li>重いペプチドを混合し、50%アセトニトリル(ACN)と混合して、10μMの各ペプチドとのペプチドミックスを作成する。</li>
		<li>ペプチドミックスのアリコートを作成し、-80°Cで保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. サンプル準備
<ol><li>サンプルのリシス 注: ユビキチン鎖の安定性は、サンプル調製中に考慮する必要があります。生物学的サンプルとバッファーを 4 °C で冷やし、できるだけ迅速にユビキチン安定化バッファーにサンプルを追加します。<ol>
<li>水に1 M NH4HCO3( 炭酸アンモニウム)の溶液を調製し、1 M NaOHを使用してpHを8に調整します。</li>
		<li>水に200 mM N-エチルマライムミド(NEM)の溶液を準備します。</li>
		<li>ユビキチン安定化バッファーは、50 mM NH4HCO3/10 mM NEM で 8 M 尿素を使用して準備します。 注:8 M尿素の5 mL溶液は尿素と飽和溶液で水の膨張を与えられて水のかなり少ない5 mLを必要とします。 注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°C以上のバッファーを準備しないでください。</li>
		<li>0.5 μG/μLのタンパク質を目指すユビキチン安定化バッファーで調べる生物学的サンプルを再中断し、サンプルに適した方法で細胞をライゼします。SFX 150ブランソンソニフィエを有する3つの10sパルスからなる超音波処理方法は、各パルス間の氷上で10のブレークを有する70%の強度に設定され、このプロトコルの細胞株に使用された。</li>
		<li>卓上遠心分離機で4°Cで10分間18,000xgの遠心分離機サンプル。</li>
		<li>上清を新鮮な低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移す。サンプルは必要に応じて、この時点で-20 °Cで保存することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプルとコントロールの準備
	<ol>
<li>サンプルが凍結している場合は、尿素を急速に溶解させるために解凍されている間に混合します(例えば、サーモミキサーで)。 注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°Cを超える温度を使用しないでください。</li>
		<li>卓上遠心分離機で4°Cで10分間18,000xgの遠心分離機サンプル。</li>
		<li>20 μgのサンプルを新しい低結合マイクロ遠心分離チューブに移し、ユビキチン安定化バッファーでボリュームを 50 μL に調整します。</li>
		<li>ユビキチン安定化バッファー(50 μL)の正規化されたボリュームを使用して、負のコントロールを作成します。このサンプルでは、各ペプチドの光バージョンが存在してはならないため、スパイクイン重いペプチドから生じる光の汚染を観察することができます。この陰性制御は、セクション3.1で説明したPRMの保持時間スケジューリングにも使用された。</li>
		<li>また、ユビキチン安定化バッファーと、ユビキチン安定化バッファー (50 μL) の正規化されたボリュームに市販のチェーンタイプを追加して、正のコントロールを作成しました。一般的に、K63、K48、および M1 が利用可能です。代表結果ではK48、K63、M1の20ngを利用した。</li>
	</ol></li>
	<li>還元、アルキル化、消化
	<ol>
<li>50 mM重炭酸アンモニウム(NH4HCO3)の溶液を水中に調製し、サンプルをpH = 8に1 M NaOHで調整します。</li>
		<li>LBスープで栽培された大腸菌の培養液を5分間遠心してペレットを形成し、その後5μg/μLのユビキチン安定化バッファーで再懸濁する前にPBSで2倍洗浄した。</li>
		<li>各サンプルとコントロールに大腸菌の1μgを加えます。このプロトコルは大腸菌(DH10B)を使用しますが、ユビキチンのない任意の複雑なライセートを使用することができます。ユビキチンは、すべての真核生物に共通であることに注意してください。 注:大腸菌の母質マトリックスを使用すると、プラスチック製品への非特異的接着によるペプチドの損失を減少させます。これは、タンパク質含有量が限られている陰性コントロールまたはサンプルにおいて特に顕著であり、K6312の観察に強い影響を与える。</li>
		<li>MSグレード水で500 mMトリス(2-カルボックスエチル)ホスフィン(TCEP)の溶液を準備します(DTTは代替として使用することができます)。</li>
		<li>TCEPを最終的な濃度50 mMに加えることによって、サンプルとコントロールを減らします。室温(RT)で30分間インキュベートする前に短時間渦を起こさせる。DTTを使用する場合、温度を50°Cに上昇させる必要があります。 注意:尿素が高温でポリ尿素を形成する傾向があるため、50°Cを超える温度を使用しないでください。</li>
		<li>550 mM クロロアセトアミド (CAA) の溶液を NH4HCO3で準備します。暗闇の中で保管してください。</li>
		<li>CAAを最終濃度55mMに添加して、サンプルとコントロールをアルキル化します。暗闇の中でRTで20分間インキュベートする前に短時間渦を起た。 注:CAAは、−GG修飾(114.0429)13と間違えられるリジン残基に対する二重カルバミドメチル改変(114.0429)の可能性を減少させる還元剤としてヨードアセトアミドの代わりに使用される。</li>
		<li>タンパク質含有量に対する比率 1:25 (w/w) でサンプルに Endopeptidase LysC を加えます。37°Cで3時間インキュベートする。</li>
		<li>サンプルとコントロールを200 μLの50 mM NH4HCO3 pH = 8 (1:5 v/v)で希釈します。</li>
		<li>タンパク質含有量に対する1:25 w/w比でサンプルにトリプシンを加えます。37°Cで12時間インキュベートする。</li>
		<li>各サンプルおよび対照サンプルに対して1:10比v/vでMSグレード水に10%のギ酸(FA)溶液を加えます。pH が <3) C18 クリーンアップの前であることを確認し、必要に応じてさらにギ酸を追加します。</li>
		<li>各サンプルおよび対照に、セクション1で作成された重いペプチド標準の0.5 μLを加えます。</li>
	</ol></li>
	<li>ペプチドのクリーンアップ
	<ol>
<li>いくつかのメーカーは、C18 クリーンアップのヒントやプレートを提供しています。使用する製品に関するメーカーの指示に従い、真空遠心分離機で溶出したペプチドをMS分析の準備を整えます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. LC-MS/MSによる分析
<ol><li>重いペプチド標準に関する初期PRM分析を予定外の方法で実行します。<ol>
<li>乾燥したサンプルをMS負荷バッファー2%ACN/0.05%トリフルオロ酢酸(TFA)の10 μLで再懸濁します。</li>
		<li>ナノフロー用に設計された逆相C18 分析カラム(75 μm x 15 cm、2 μm 100 Å C18 ビーズ)をHPLCに装備し、MSグレード水を交換する線形勾配を0.1%FAに0.1%含むACNで交換します。分析カラムの寿命を保つ犠牲トラップカラム(75 μm x 2 cm、3 μm、100 Å C18 ビーズ)は、ここで使用しましたが、必須ではありません。</li>
		<li>分析カラムの出力を高解像度の質量分析計上のナノESIソースに結合します。</li>
		<li>質量分析計に適当な標的プロテオミクス法を利用する。たとえば、Q-Exactive と 2 つの実験方法では、完全 MS と PRM 実験の間でサイクルを行います。完全な MS 実験では、最大 IT として 1e6 と 240 ミリ秒の AGC 目標を持つ 120,000 の解像度が使用されました。PRM実験では、同じAGC目標と最大ITを使用し、解像度は60,000、分離ウィンドウは1.2 m/zでした。</li>
		<li>HPLCオートサンプラーを使用して、200 ngの陰性制御を分析カラムに注入します。分析カラムのサンプルに線形勾配を適用し、ACN濃度を〜45分の期間で2~25%上昇させます。 注:25%のACN濃度は、典型的なユビキチントポロジ特性ペプチドの親水性が低いため、プロテオミクスでは通常より低くなっています。他のペプチドが定量化される場合、より高いACN濃度が良好な標的分離を達成することが望まれる。</li>
		<li>セクション 4.2 で説明したように、スケジュール実行の結果を分析して、スケジュール済み対象リストを作成します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルの分析<ol>
<li>セクション 4.2 で作成されたスケジュール済み包含リストを使用する場合とは別に、3.1 でのスケジュールの説明に従って残りのサンプルを実行します。 注: 前の実行からの繰り越しが後続のサンプルで検出されないように、正のコントロールの後にブランクを実行する必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. ソフトウェア分析
<ol><li>使用する MS に適した書式の一覧を作成します。このプロトコルは、オープンソースソフトウェアSkyline(バージョン19.1.0.193)(https://skyline.ms)を使用し、十分に文書化されたサポートとヘルプを提供しています。包含リストは、エクスポート隔離リスト機能を使用して、複数の質量分析計に対して作成できます。<ol>
<li>新しいスカイライン ドキュメントを開きます。</li>
		<li>重いトポロジ特性ペプチドに適した重い同位体修飾を選択します。[設定] で|[変更]タブの下にある[ペプチド設定]をクリックし、名前フィールドをクリックして、潜在的な変更を確認します。選択は、購入した重いペプチドの同位体状態に基づく。この例では、C末語で重リジン(13C615N2-リジン)または重アルギニン(13C615N4-アルギニン)のいずれかを担持した合成ペプチドが使用された。適切なラベルは、「ラベル:13C(6)15N(2)(C-用語K)」と「ラベル:13C(6)15N(4)(C項R)」となります。</li>
		<li>[設定]を選択します|遷移:[フィルタ] タブには、前駆体料金2、3、4 が含まれます。 </li>
		<li>[編集]を選択してペプチドを挿入します|挿入|ペプチド .</li>
		<li>トポロジ特性ペプチド配列とタンパク質名(例えば、「Chain–K63」)を含む関連フィールドを記入してください。</li>
		<li>ターゲットパネルに表示されている各ペプチドを展開します。不要な充電状態を削除します。好ましい電荷状態および衝突エネルギーは、使用される質量分析計に基づいて異なる場合があり、トポロジ特性ペプチドごとに表1に示されている。</li>
		<li>トポロジ特性ペプチドごとに(GGがシーケンスに含まれているM1を除く)、シーケンスを右クリックして [修正]を選択します。名前フィールドをクリックして <すべてを表示.> を選択する前に "GlyGly (K)"。</li>
		<li>分離リストファイルをエクスポート します|輸出|[隔離リスト]で、計測器の種類を選択し、メソッドの種類を [標準] に設定します。 [OK] を 選択すると、PRM メソッドの作成に使用できる *.csv ファイルを保存するプロンプトが開きます。</li>
	</ol></li>
	<li>オープンソースのSkylineソフトウェアを使用して、ここで説明する重いペプチドスケジューリングの実行に基づいて、スケジュールされた包含リストを作成します。<ol>
<li>セクション 4.1 で説明されているようにターゲット リストを作成します。</li>
		<li>[ファイル]を選択して、スケジューリング実行を 3.1 でインポート します|インポート|結果:</li>
		<li>ID を確認します。各ペプチドの重いシグナルは、重いペプチドのエントリごとに質量をクリックすることによって観察可能です。ピークの正しい認識は自動的に決定されることが多いが、ソフトウェアはクリックしてX軸下にドラッグしてピークを選択することによって手動キュレーションを必要とする場合がある。</li>
		<li>重いバリアントに対して選択された保持時間もライト バージョンに適用され、PRM のスケジュールが作成されます。スケジュール設定ウィンドウは、[設定]で変更できます|[予測] タブを使用して、タイム ウィンドウを変更してペプチド設定を行います。</li>
		<li>スケジュールされた対象リストを File を使用してエクスポートできるようになりました |輸出|分離 リストを選択し、適切な機器の種類と設定方法の種類を [スケジュール済み] にします。</li>
	</ol></li>
	<li>データを分析します。<ol>
<li>セクション 4.2 のスケジューリング実行分析と同じ方法でサンプルをインポートします。</li>
		<li>すべてのサンプルを完全にインポートした後、遷移のキュレーションを推奨します。これは、干渉や低い信号対雑音比を持つ遷移を除去するプロセスです。キュレーション前後のクロマトグラムの例を 図4に示します。</li>
		<li>データをエクスポートするには、関連するグラフを右クリックして[データを コピー ]を選択するか、[ファイル]を選択 します|輸出|結果:</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Khoury, G. A., Baliban, R. C., Floudas, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+post-translational+modification+statistics%3A+frequency+analysis+and+curation+of+the+swiss-prot+database%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide post-translational modification statistics: frequency analysis and curation of the swiss-prot database.</a> Scientific Reports. 1, 90(2011).</li>
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</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

プロテオーム内のユビキチン状態の解析は、多種多様な生物学的問題に対して重要性を増している。サンプルのユビキチン化状態の記述は、ユビキチン化されるタンパク質のプロファイルだけでなく、ユビキチン化のトポロジーにも焦点を当てる必要があります。ここで説明するように、標的MSによるこのトポロジーの評価は、広範囲の生物学的調査において役割を有する。
ここで説明するプロトコルは、グローバル トポロジ プロファイルを提供することを理解する必要があります。ボトムアッププロテオミクスアプローチを使用すると、ユビキチンペプチドを含むユビキチン化されたペプチドの決定が可能になります。ユビキチンペプチドのユビキチン化の観察は、鎖位相の決定を可能にするが、ユビキチンの標的へのリンクは失われる。したがって、特定のタンパク質上の特定の連鎖トポロジーは特定できませんが、グローバルトポロジープロファイルが導出されます。このメソッドをエンリッチメント戦略と組み合わせて、よりターゲットを絞った結果を提供することもできます。このような濃縮は、チェーンの安定性とチェーンポスト濃縮の豊富さを考慮する必要があります。鎖位相の検出...

タンパク質の機能と安定性の密接な調節は、生物学の表現法制御の主要な原動力であるため、最も重要です。タンパク質の機能は、その本質的なポリペプチド配列と翻訳後修飾(PTM)の2つの成分から構成されます。グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化1など、様々な化学PTMが同定されている。1975年、Goldsteinらの2 は小さなタンパク質を同定し、そのユビキタスな性質のためにユビキチンと名付けた。ユビキチンはタンパク質分解3において重要であることが判明した。しかし、それ以来、シグナル分子としてのユビキチンの機能は、タンパク質安定性の調節をはるかに超えて広がったことが確立されています。ユビキチンシグナル伝達は、タンパク質安定化、オートファジー、細胞周期制御、およびタンパク質の人身売買4のような他の生物学的機能の広い範囲に関与している。
他のPTMは一般的に、特定の部位に対してバイナリ(すなわち、タンパク質が改変または未修飾のまま)であるが、ユビキチンは単量体またはポリマー鎖の両方としてタンパク質を修飾することができ、その後ユビキチン自体はユビキチン化される。また、このポリユビキチン化鎖は、前のユビキチンのユビキチン化を伴ういくつかのトポロジーで開発することができ、8つのリンケージサイト5、6のいずれかに付着している。ユビキチンは、ユビキチンのC末端が7つのリジン残基(K06、K11、K27、K29、K33、K48、またはK63)または以前のユビキチンのN末端(M1または線形5と呼ばれる)にリンクされている多段階酵素プロセス(図1)によって伝達される。この連鎖トポロジーは、修飾下のタンパク質の運命の鍵です。例えば、K48またはK11連結鎖を用いた修飾はプロテアソームでの改変タンパク質の分解をもたらし、一方、NF-kBシグナル伝達の活性化には線形鎖が必要である。したがって、これらの連鎖トポロジの相対的分布は、多種多様な生物学的問題に関連する。
質量分析(MS)の使用は、ユビキチン鎖トポロジ解析には、抗体ベースまたは親和性に基づく相互作用7,8に依存しておらず、その多くは特異性が限られており、様々な鎖型を区別しないため、特に有益である。別の検出可能性は、遺伝子組み換えユビキチン変異体を使用しています。ここで、特定のリジンはアルギニンと交換され、ユビキチンによる修飾を支持することができない。基質タンパク質上のユビキチン鎖形成の欠如は、特定のトポロジ9の証拠として解釈される。
ユビキチン化タンパク質のMSベース同定は、ユビキチンのC末端に、MS分析のためのサンプルのタンパク質分解調製中にトリプシンによって認識される74位にアルギニン残基が含まれているという事実に基づいており、C末端のダブルグリシンを分離する。このGlyGly(-GG)は、基質タンパク質のリジン残基のε-アミノ基に結合したままである。ユビキチントポロジ解析では、ユビキチンの7つのリジン残基のうちの1つに修飾が起こります。これにより、GGによって修飾されたリジン残基を持つ7つの主要なペプチドのセットが作成され、各トポロジーに固有である(図2)。例えば、K06トポロジーでは、アミノ酸配列の位置6のリジンは、このリジンに114 Daの-GG修飾を加えてトリプシン消化から保護される。
MSによる特定の所定のペプチドの同定は、標的プロテオミクス、またはより具体的には、標的ペプチド獲得10と呼ばれる。使用されている質量分析計の性能に応じて、2つの方法が開発されています。これらは、反応モニタリング(SRM)、多重反応モニタリング(MRM)、および並列反応モニタリング(PRM)とも呼ばれる選択される。SRM では、前駆体 m/z と製品イオン m/z からなる遷移の選択が行われます。反対に、PRM は前駆体 m/z のみを必要とします。選択後、生成イオンの完全な調査スキャンが行われる。これは、測定11の前に、特定の質量分析計で定量するための適切な生成イオンの選択が不要であるという利点を有する。SRM と PRM の両方を、計測器に応じてスケジュールできます。スケジューリングとは、特定のイオンが分析に含まれる時間枠を割り当てる練習であり、ペプチドはクロマトグラフィーシステムから定義された保持時間で溶出します。特定の時点で尋問されるイオンの数を減らすことは、その時点で予定されているイオンの尋問の頻度を増加させ、したがって、データの精度を向上させます。
一般に、ユビキチントポロジーに対する標的プロテオミクスの適用は、他の標的プロテオミクス実験と同じである。しかし、2つの重要な違いが重要である:まず、ユビキチン鎖の安定性を考慮する必要があります。細胞のリシス時に鎖を急速に分解する複数の強力なデュービキチン化酵素(DUB)があります。ユビキチン特異的プロテアーゼは、チオエステラーゼとメタロプロテアーゼの2つのカテゴリーに分類されます。ユビキチン-ヒドロラーゼのほとんどはチオエステラーゼであり、活性中心にシステイン残基を運ぶ。このシステイン残基をアルキル化することにより、不活性化することができる。したがって、N-エチルマレイミド(NEM)のようなアルキル化剤を含むユビキチン安定化バッファーと高変性化学物質の使用、およびサンプルを冷やして保持することは、分析を成功させるために不可欠です。第2に、他の標的実験とは異なり、ペプチドの選択は固定される。典型的な標的実験では、タンパク質ペプチドを選んで、クロマトグラフィーとイオン化の性能を良好にします。K48のようないくつかのトポロジ特性ペプチドは、これらの特性は良好であるが、他の人にとっては、それらはあまり望ましくない。例えば、典型的な逆相セットアップにおけるK33クロマトグラフィーは、伸伸溶性プロファイルの形成により不良であり、かつK27ペプチドのイオン化特性が悪いため、MS12によってその視認性が低下する。
本プロトコルでは、PRMによる生体試料のユビキチントポロジアセスメントを行う方法について説明する。この手順のサンプルデータは、いくつかの異なる細胞タイプにおけるMG-132阻害剤処理を用いたプロテアソームの摂動を用いて提示される。

<table><tbody><tr><td>アセトニトリル (ACN)</td><td>メルク</td><td>100029</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム (ABC)</td><td>Fluka</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>Microfuge 16</td><td></td></tr><tr><td>クロロアセトアミド (CAA)</td><td>Sigma</td><td>22790</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸 (FA)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>85178</td><td></td></tr><tr><td>ヘビーペプチド</td><td>JPT ペプチドテクノロジー</td><td></td><td></td></tr>ズ <tr><td>HPLC</td><td>Dionex</td><td>Ulitimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>LC カラム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>160321</td><td></td></tr><tr><td>Lys C</td><td>Wako</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>質量分析計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>Q-Exactive Plus</td><td></td></tr><tr><td>N-エチルマレイミド (NEM)</td><td>ACROS Organics</td><td>156100050</td><td></td></tr><tr><td>ポジティブコントロールチェーン K48</td><td>ボストンバイオケム</td><td>UC-240</td><td></td></tr><tr><td>ポジティブコントロールチェーン K63</td><td>ボストンバイオケム</td><td>UC-340-100</td><td></td></tr><tr><td>ポジティブコントロールチェーン M1</td><td>ボストンバイオケム</td><td>UC-710B-025</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td> <td>シグマ</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>ソニファイア</td><td>ブランソンソニファイア</td><td>SFX 150</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー</td><td>エッペンドルフ</td><td>サーモミキサー コンフォート</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td><td>Sigam</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>77720</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>プロメガ</td><td>V1511A</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターズ &mu;溶出 C18 プレート</td><td>Waters</td><td>186002318</td><td></td></tr></tbody></table>

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

プロテオーム内のユビキチン鎖トポロジーのグローバルプロファイルの評価は、幅広い生物学的問題に答える上で興味深いものです。ここで概説するプロトコルは、鎖に組み込まれたユビキチンのトリプティック消化後に残されたジグリシン(-GG)修飾を利用する。これらのトポロジ特性ペプチドを定量化することにより、ユビキチン鎖トポロジーの相対的な存在量を求めることができる。これらのペプチドを並列反応モニタリング実験で定量するために必要なステップは、ユビキチン鎖の安定化を考慮して報告されている。重いコントロール、細胞の分解、および消化の準備は、適切な質量分析計のセットアップとデータ分析のワークフローと共に記述されています。ユビキチントポロジーにおける摂動を伴うデータセットの例は、プロトコルの最適化が結果に与える影響の例を伴って提示される。概説された手順に従うことによって、ユーザーは生物学的文脈の中でユビキチントポロジ景観のグローバル評価を行うことができる。

PRMによるユビキチン鎖分析の使用を実証するために、マウスメラノーマ細胞株B16と2つの一般的なヒト細胞株A549(腺癌性肺胞基底細胞)およびHeLa(子宮頸癌細胞)の3つの細胞株が選択された。これらの培養物は、収穫前に4時間0、10、または100 mM MG-132で処理される前に、適切な培地で中電関数的な相に成長した。MG-132は、プロテアソーム14によるユビキチン共役タンパク質の分解を防止するプロテアソーム阻害剤である。このような場合、ユビキチン連鎖解析を実証することは適切な試験条件である。K48鎖の増加の結果は 図3に見ることができる。プロテアソーム阻害剤治療は、K48鎖15の増加を誘発した。
導入に記載されているように、SRMまたはMRMとは異なり、PRMは前駆体イオンの選択後にフル製品イオンスキャンを行う。これは、製品イオンが実行前に指定される必要がないことを意味しますが、実行後にキュレーションする必要があります。...

この方法はユビキチン鎖トポロジーにおけるグローバルな変化の評価を記述する。この評価は、質量分析法に基づく標的プロテオミクスアプローチの適用によって行われます。

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

ユビキチン鎖のトポロジーはそれぞれ異なるため、その存在量の変化を理解することは、さまざまな生物学的状態に関連しています。ユビキチン鎖解析にパラレル反応モニタリングを適用することで、ユビキチン鎖トポロジーの特異的な同定と定量が可能になります。一般的なPRM実験とは異なり、ユビキチン鎖トポロジーの解析は特定の修飾ペプチドに限定されており、その多くはMS解析には理想的ではありません。この手法の視覚的なデモンストレーションでは、これらの非理想的なペプチドについて観察された調整と期待される結果が強調されています。まず、本文原稿に記載されているように、重炭酸アンモニウム溶液、n-エチルマレイミド溶液、およびユビキチン安定化バッファーを調製します。生体試料をユビキチン安定化バッファーに再懸濁し、適切な方法で細胞を溶解します。細胞溶解後、サンプルを18,000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、上清を新鮮な低タンパク質結合微量遠心チューブに移します。必要に応じて、サンプルを摂氏マイナス20度で保存してから続行してください。サンプルを解凍するには、ThermoMixerで急速に混合し、摂氏50度を超える温度は使用しないでください。解凍したら、サンプルを18, 000倍Gで摂氏4度で10分間遠心分離し、20マイクログラムを新鮮な低結合マイクロ遠心チューブに移し、ユビキチン安定化バッファーで容量を50マイクロリットルに調整します。ユビキチン安定化バッファーの正規化された容量を持つネガティブコントロールと、バッファーと市販の鎖タイプを持つポジティブコントロールを調製します。50ミリモルの重炭酸アンモニウムを水に溶かした溶液を調製し、1モルの水酸化ナトリウムでpHを8に調整します。大腸菌培養物を5,000倍Gで5分間遠心分離することによりペレット化します。細胞をPBSで2回洗浄し、ユビキチン安定化バッファーに5マイクログラム/ミリリットルで再懸濁します。各サンプルとコントロールに1マイクログラムの大腸菌ライセートを加えます。次に、MSグレードの水で500ミリモルのTCEPを調製し、最終濃度50ミリモルになるまで各サンプルに添加します。サンプルを短時間ボルテックスし、室温で30分間インキュベートします。次に、500ミリモルのクロロアセトアルデヒドと重炭酸アンモニウムの溶液を調製し、それをサンプルとコントロールに添加して最終濃度55ミリモルにします。サンプルを短時間ボルテックスし、暗闇で20分間インキュベートします。エンドペプチダーゼLys-Cをサンプルに加え、摂氏37度で3時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルを200マイクロリットルの50ミリモル重炭酸アンモニウムで希釈し、トリプシンを加えて、さらに12時間インキュベートします。翌日、各サンプルに10%ギ酸溶液を加え

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ユビキチン化は、3つの酵素のセットによって行わキー翻訳後修飾である。この変更に関与する遺伝子の変異が様々なヒト疾患に関連付けられています。ここで、我々は培養細胞でのタンパク質のユビキチン化を検出するためのプロトコルを説明...

タンパク質のユビキチン化の検出

このビデオでは、複雑なペプチド混合物から残留ジグリシンペプチドを含むユビキチン化ペプチドを抽出し精製する方法について説明しています。提示された方法は、タンパク質中の元のユビキチン化部位を同定するのに役立つ可能性があります。...

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現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。...

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げっ歯類脳における細胞内ユビキチンプロテアソーム活性の定量化

このプロトコルは、治療または表現型などの特定の状態に関連するこれらの種類の翻訳後修飾(PTM)の変化を同定するために、ユビキチン(Ub)およびユビキチン様(Ubls)特異的プロテオームを確立することを目的としています。...

ユビキチンおよびユビキチン様依存性翻訳後修飾のプロファイリングと有意な変化の同定

本研究は、E3ユビキチンリガーゼ触媒活性の分析のための詳細な インビトロ ユビキトリメンテーションアッセイプロトコルを提供する。組換えタンパク質は 、大腸菌...

イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析

我々は、哺乳動物細胞における特定の基質およびE3ユビキチンリガーゼのユビキチル化アッセイのための詳細なプロトコルを提供する。HEK293T細胞株をタンパク質過剰発現に使用し、ポリユビキチル化基質を免疫沈降によって細胞溶解物から精製し、SDS−PAGEで分解した。イムノブロッティングを用いて、この翻訳後修飾を可視化した。...

哺乳動物細胞溶解物におけるE3ユビキチンリガーゼによる基質ユビキチル化の評価

このプロトコルでは、組換えタンパク質精製とユビキチン鎖切断アッセイを組み合わせることにより、神経発達障害に関連する遺伝的変異が脱ユビキチン化酵素活性に及ぼす影響を測定する方法を説明しています。...

In vitroユビキチン鎖切断アッセイによる神経発達障害関連脱ユビキチン化酵素の酵素活性の測定

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分子ドッキングおよび脱ユビキチン化酵素プローブ技術に基づくUCHL3活性阻害のための漢方薬化合物のスクリーニング

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SMAD2/SMURF2をモデルとした哺乳類細胞溶解液におけるユビキチン検出の比較戦略

学ぶ並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析法。質量分析を用いた標的プロテオミクスアプローチで、ユビキチン連鎖トポロジーの変化を特定・定量します。生化学研究に有用です。

並列反応モニタリングによるユビキチン連鎖解析

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