Name: 完全処理された組換えKRAS4b:ファルネシル化およびメチル化タンパク質の分離と特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶファルネシル化・カルボキシメチル化KRASの高収率製造プロトコル。昆虫細胞からの精製により、膜環境での生体物理学的実験が可能になり、がん研究における薬剤スクリーニング開発に貢献します。

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私たちは、カリッサ・グロース、ジェン・メルハルコ、マット・ドリューのクローン作成と発現支援を、フレデリック国立がん研究研究所タンパク質発現研究所で認めます。このプロジェクトは、契約番号に基づき、国立がん研究所、国立衛生研究所からの連邦資金の全部または一部に資金を提供しています。HHSN261200800001E.この出版物の内容は、必ずしも保健福祉省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商業製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を暗示するものではありません。

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著者たちは何も開示する必要はない。

代表的な結果セクションで述べたように、精製中に最も重要なステップは、より低い塩中のサンプルの取り扱いです。サンプルが200 mM未満のNaClにさらされる時間を制限することは、沈殿を減らし、サンプル収率を高めるのに役立ちます。プロファイルが期待値と一致しない場合、CEX の結果の解釈が困難になる場合があります (図 2参照)。プロトコルがルーチンになるまで、適切な材料が確実に取り出されるように、無傷の質量分析が完了するまで、前方に取り出されないCEX溶出分率を-80°Cで保存することをお勧めします。CEX ステップで上記のパラメータの外側では、プロトコルは lysis および IMAC ステップで比較的簡単に変更できます。また、プロトコルにサイズ排除クロマトグラフィー(SEX)分離ステップがないことも注目に値する。これは、初期の方法開発(未発表の結果)の間に観察された損失のために省略されます。これらの損失は、タンパク質がナノディスクと複雑である場合には観察されないことが注目に値し、脂質の存在しない場合の損失は、タンパク質と樹脂との疎水性相互作用によるものであることを示唆している...

翻訳後修飾は、タンパク質の機能活性を定義する上で重要な役割を果たします。リン酸化やグリコシル化などの改変は十分に確立されている。しかし、脂質修飾はあまりよく特徴付けされていない。すべての細胞タンパク質の0.5%が1を前もって打ち出す可能性があると推定されている。前駆処理は、CAAXモチーフ2を含むアクセプタータンパク質への15炭素ファルネシルまたは20炭素ゲラニルゲルニル脂質鎖の転写である。前駆加タンパク質は、早期老化3、アルツハイマー病4、心機能障害5、脈支痛症6、および癌7を含むいくつかのヒト疾患の進行に関与している。小型GTPPas、HRAS、NRAS、およびKRAS1、核ラミニン、およびキネトコレスCENP-EおよびFは、基底状態下でファルネシル化タンパク質である。他の小さなGTPアーゼ、すなわちRhoA、RhoC、Rac1、cdc-42、およびRRASはゲラニエルゲラニ化8であるのに対し、RhoBはファルネシル化またはゲラニエルゲラ化9であり得る。
この小さなGTPe KRAS4bは分子スイッチとして機能し、本質的に細胞内シグナル伝達シグナル伝達を複数のタンパク質間相互作用を介して細胞増殖および増殖を刺激する細胞内シグナル伝達経路に伝達する細胞外増殖因子を伝達する。KRAS4b生化学には、その活動に不可欠な2つの重要な側面があります。まず、非アクティブなGDPと活性GTP結合状態との間のタンパク質サイクルは、エフェクターと積極的に関与する。第二に、C末端ポリリジン領域とファルネシル化およびカルボキシメチル化システインがタンパク質を形質膜に導き、下流エフェクターのリクルートおよび活性化を可能にする。変異型KRAS4bは膵臓癌、大腸癌、肺癌10における発癌性ドライバであり、そのように、治療的介入は巨大な臨床的利益を有するであろう。ファルネシル化およびカルボキシメチル化された本格的に修飾された組換えタンパク質の製造は、リポソームまたは脂質ナノディスク11、12などの膜サロゲートと組み合わせてKRAS4bを用いた生化学的スクリーニングを可能にするであろう。
ファルネシルトランスフェラーゼ(FNT)は、KRAS4bのCAAXモチーフにおけるC末端システインにファルネシルピロリン酸を添加することを触媒する。前駆付後、タンパク質は小胞体(ER)に入れ込み、そこでRas変換酵素(RCE1)が3つのC末端残基を切断します。処理の最終工程は、ER膜蛋白質による新しいC末端ファルネシルシステイン残基のメチル化、イソプレニルシステインカルボキシルメチルトランスフェラーゼ(ICMT)である。大腸菌における組換えKRAS4bの発現は、非修飾タンパク質の産生をもたらす。処理されたKRAS4bを製造する以前の試みは、構造または薬物スクリーニング実験のための不十分な収率のために制限されているか、または天然の全長成熟タンパク質13、14を再現できなかった。ここで提示されるプロトコルは、5mg/Lの細胞培養の収率で高度に精製され、完全に処理されたKRAS4bを生成する、工学的なバキュロウイルスベースの昆虫細胞発現系および精製方法を利用する。
慎重なタンパク質特性評価は、構造生物学や薬物スクリーニング研究に着手する前に、組換えタンパク質の品質を検証するために不可欠です。完全に処理されたKRAS4bの2つの主要なパラメータは、膜置換または脂質との相互作用のための正しいプレニル修飾およびファルネシル化およびカルボキシメチル化C末端(FMe)の利用可能性の検証である。KRAS4b-FMeのエレクトロスプレーイオン化質量分析法(ESI-MS)を用いて分子量を測定し、ファルネシルおよびカルボキシメチル修飾の存在を確認した。サンプルに非変性溶媒を噴霧する天然質量分析法は、KRAS4b-FMeがGDP補因子にも結合していることを実証するために使用された。最後に、表面プラズモン共鳴分光法を用いて、固定化リポソームによるKRAS4b-FMeの直接結合を測定した。

<table><tbody><tr><td>1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials</td><td>Thermo Scientific</td><td>30211SS-1232</td><td></td></tr><tr><td>1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホコリン (POPC)</td><td>AVANTI 極性脂質</td><td></td> 850457 クロロホルム 1-パルミトイル-2-オレオイル-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン (POPS)<td>の液体ストックとして購入できます</td></tr><tr><td>。</td><td>POLAR LIPIDS</td><td>840034</td><td>クロロホルム</td></tr><tr><td>5427R 遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル、HPLC グレード</td><td>フィッシャー ケミカル</td><td>A998-1 1L</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250g</td><td></td></tr><tr><td>アルゴン ガス</td><td>エアガス</td><td>アラップ</td><td></td></tr><tr><td>アッセイ プレート 384</td><td>コーニング</td><td>3544</td><td></td> の液体ストックとして購入</tr><tr><td>Biacore T200 Instrument</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blue Snap-It Seals, T/S</td><td>Thermo Scientific</td><td>C4011-54B</td><td></td></tr><tr><td>Branson 超音波浴</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-336-1000</td><td></td></tr><tr><td>陽イオン交換クロマトグラフィー (CEX) カラム</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29018183</td><td>HiPrep SP セファロース 高性能</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Dyna Pro プレートリーダー</td><td>Wyatt Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Exactive Plus EMR 質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500Ml</td><td>試薬グレード以上の</td></tr><tr><td>Gilson バイアル 7x14 mm チューブ</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1002-12</td><td></td></tr><tr><td>PTFE フォームライナー</td><td>付きガラスねじガラスねじバイアルサイエンティフィック・スペシャリティーズ</td><td>B69302</td><td></td></tr><tr><td>高速/卓上遠心分離機</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>05-112-114D</td><td>最大4,000 xgの</td></tr><tr><td>能力 His6-タバコエッチングウイルス(TEV)プロテアーゼ</td><td>Addgene</td><td>92414</td><td>Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease.In:Burgess-Brown N.(編)大腸菌における異種遺伝子発現。分子生物学の方法、vol 1586。Humana Press, New York, NY</td></tr><tr><td>Imfixedized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9365-51</td><td>HisPrep FF 16/10</td></tr><tr><td>In-House Water Supply, Arium Advance</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>18 M&Omegaの抵抗率;ホルダー付き0cm</td></tr><tr><td>脂質押出機セット</td><td>AVANTI POLAR LIPIDS</td><td></td><td></td></tr> 610023 <tr><td>液体窒素</td><td>エアガス</td><td>NI-DEWAR</td><td></td></tr><tr><td>M110-EH マイクロフルイダイザー</td><td>マイクロ流体</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MabPac RP UHPLC カラム、4 um、3.0 x 50 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>088645</td><td></td></tr><tr><td>MabPac SEC-1 カラム、5 um、300 &Aring;、2.1 x 150 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>088790</td><td></td></tr><tr><td>MagTran ソフトウェア</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール、HPLC グレード</td><td>VWR 化学薬品</td><td>BDH20864.400</td><td></td></tr><tr><td>NGC クロマトグラフィー システム</td><td>BioRad</td><td>78880002</td><td>NGC QuestTM 100 クロマトグラフィー システム</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 EDTA またはその他のキレート剤を含まないカクテル</td><td>ミリポア シグマ</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>ラバー キャップ タイプ 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR-1005-02</td><td></td></tr><tr><td>シリーズ S センサーチップ L1</td><td>GE ヘルスケア</td><td>29104993</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>13-400-519</td><td>280nm</td></tr><tr><td>Ultra-15 遠心フィルターユニット、10K NMWL</td><td>ミリポアシグマ</td><td>UFC901008</td><td>PES メンブレン</td></tr><tr><td>Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL 遠心分離フィルター</td><td>Amicon</td><td>UFC501024</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima - L80K</td><td>100,000 xg</td></tr><tr><td>Vanquish UHPLC (ポンプ、カラムハーター、LC システム)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Fisher</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>水、HPLC グレード</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-1L</td><td>社内の水源を使用できます(下記参照)</td></tr><tr><td>Whatman GD/XP PES 0.45 mm シリンジフィルター</td><td>GE Healthcare - Whatman</td><td>6994-2504</td><td></td></tr><tr><td>Xcalibur QualBrowser</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>プロテオミクスソフトウェア</td></tr></tbody></table>

完全処理された組換えkras4b:ファルネシル化およびメチル化タンパク質の分離と特徴付け

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

タンパク質のプレニル化は、タンパク質を細胞内膜に標的化する重要な修飾です。ヒト癌の22%で変異しているKRAS4bは、C末端に「CAAX」ボックスモチーフの存在によるファルネシル化およびカルボキシメチル化によって処理される。工学的なバキュロウイルス系は、昆虫細胞においてファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bを発現するために使用され、以前に説明されている。ここでは、タンパク質の詳細かつ実用的な精製および生化学的特性評価について説明する。具体的には、アフィニティーおよびイオン交換クロマトグラフィーを使用して、タンパク質を均質化して精製した。無傷および天然質量分析法は、KRAS4bの正しい修飾を検証し、ヌクレオチド結合を検証するために使用された。最後に、ファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bとリポソームの膜会合を、表面プラズモン共鳴分光法を用いて測定した。

プロトコルの最大の変数の1つは、発現された標的タンパク質(His6-MBP-tev-KRAS4b)の量です。このプロトコルは、トリコプラスシアni細胞株、Tni-FNL17からの単離を用いて開発され、懸濁成長に適応し、血清から離離れた。バキュロウイルス発現系を用いて様々な昆虫細胞株にわたって報告された結果の広い範囲を考えると、Tni-FNLは、少なくとも最初は、KRAS4b-FMeを産生するために使用することをお勧めします。
~65 kDa に移行する暗いタンパク質は、透明化された溶解物と溶出画分 (図 1A)で明らかである必要があります。融合タンパク質は、溶解物中で最も顕著な2つの染色バンドの1つであり、他方は~48kDaで共移行する共発現FNTA/Bである。
精製の中で、CEXステップは2つの理由で重要である:1)超可変領域(HVR)が非常に影響を受けやすいようにタ...

プレニル化は、末梢膜結合タンパク質に対する重要な修飾である。昆虫細胞を操作して、タンパク質とタンパク質と脂質の相互作用の生物物理学的測定を可能にする量でファルネシル化およびカルボキシメチル化KRAS4bを生成することができます

完全処理された組換えKRAS4b:ファルネシル化およびメチル化タンパク質の分離と特徴付け

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

当社のプロトコルは、高収率で適切に処理されたKRASの分離と分離を可能にします。本物の遠分化およびカルボキシメチル化KRASの生産は、哺乳類細胞と同様に膜中のKRASを有する実験を行うことを可能にする。プロトコルの高い収率は、前の作業とは一部離れて設定します。我々は通常、発現物質の1リットル当たり3〜5ミリグラムのタンパク質を精製する。これにより、生物物理学や構造生物学の実験を行うことができます。KRASは、膵臓癌の20%と90%の癌で変異する。したがって、本物の加工タンパク質を産生するプロトコルを持つことは、実際のタンパク質を癌細胞の膜上にあるように研究できるように、薬物スクリーンを開発するのに非常に有用です。このプロトコルは、細胞内で遠く、完全に処理される他のタンパク質を研究するのにも非常に有用である。したがって, あなたがする必要があるのは、目的のタンパク質とKRASを交換し、バキュロウイルスにそれを入れる.重要なステップは、カチエーション交換クロマトグラフィーの周りにあるものです。適切なカラムを使用し、タンパク質が低塩バッファーにある時間を制限することは、成功のために不可欠です。降水量がスノーグローブタイプのイベントではないことを理解することは、プロトコルに新しいイベントを導くのに役立ちます。これは、カチネーション交換列の負荷を複数の小さな負荷に分割する必要性を示すことによって強化されます。細胞をライジングした後、ライセートを明らかにし、標的タンパク質をIMACで精製し、SDSページとクマシー染色を用いてタンパク質画分を分析する。ピーク画分をプールし、摂氏4度でバッファDの2リットルに対して一晩プールを透析します。翌日、透析からサンプルを取り出し、遠心分離機を4,000回gで10分間遠心分離し、任意の沈殿物を除去します。最終的な透析および明確化されたサンプルは、多くの場合、まだかすんでいるが、それ以上の処理なしでCEXカラムに適用することができます。バッファーGの3つのカラム量でそれを洗浄することによって20ミリリットルのカチオン交換カラムを準備し、次にバッファF.Nextの3列の体積で、20ミリリットルのバッファーEを加えることによって、透析サンプルの20ミリリットルを最終的な塩化ナトリウム濃度100ミリモルに希釈し、交換カラムにサンプルを適用します。一度にすべてではなく少量のサンプルを希釈することが重要であり、希釈されたサンプルは、タンパク質の沈殿を制限するために希釈直後にカラムに適用する必要があります。前の希釈が荷重の終わりに近づくと、希釈したてのサンプルでカラムをロードし続けます。次に、通常3つのカラム体積を必要とするバッファFでカラムをベースライン吸光度280に洗浄する。バッファーFから65%緩衝Gまでの400ミリリットルの勾配でカラムからタンパク質を溶出し、6ミリリットル分数で溶離を回収する。勾配が完了したら、65%バッファGの追加の1.5カラムボリュームのカラムを洗浄し続けます。SDSページとクマシーブルー染色分析の両方に基づいて正の分数を選択し、クロマトグラムのUVトレースの検査を行います。その後、タンパク質をプールし、原稿の指示に従ってHis6 TEVプロテアーゼでそれを消化します。消化と透析の後、1分間に3ミリリットルのバッファーAで平衡化された20ミリリットルのIMACカラムにタンパク質をロードします。このクロマトグラフィー中に7ミリリットル分を収集し、合計3カラムのバッファーAの体積で、またはベースライン吸光度に達するまでカラムを洗浄します。バッファーCの5カラム体積勾配を0%から10%にして標的タンパク質を溶出し、7ミリリットル分を回収する。次に、SDS ページで正の分数を識別します。SDSページで分析する場合、明確化されたライセートは、融合タンパク質His6-MBP-tev-KRAS4bに対応する約65キロダルトンに移行する暗いバンドを含むべきである。共発現したFNTAbは48キロダルトンに移行する。精製中のCEXステップは、タンパク質分解の程度を減らし、完全に処理されたタンパク質を豊かにするので重要ですが、プロトコルの中で最も複雑な部分です。このステップの典型的な結果はKRAS4b-FMeの顕著なピーク3を有するが、溶出プロファイルは可変であり得る。ESIMSを用いた無傷の質量分析は、タンパク質の正確な分子量を確認し、それによってファルネシレーションまたはカルボキシメチル化の相対的な割合を確認します。典型的な最終ロットには検出可能なKRAS4b-FARNが含まれていましたが、この割合はこの分析によるピーク高さの点で15%未満でした。ネイティブ質量分析は、GDPに結合KRAS4bの質量を決定するために使用されました.サンプル溶媒を酢酸アンモニウムと交換し、より柔らかいイオン化を確実にするため、天然複合体はそのまま残ります。KRAS4b-FMeとリポソームの相互作用を表面プラズモン共鳴で測定し、KRAS4b-FMeが膜に結合するためにはファルネシリ化とカルボキシメチル化が必要であることを検証した。予想通り、KRAS4b-FMeはリポソームに結合し、未処理KRAS4bは結合しなかった。低塩にタンパク質が曝される時間を最小限に抑えることは、収量に影響を与えるプロトコルの唯一の最も重要な側面です。タンパク質は、バッファーEの希釈後、この低塩濃度で短時間でしかありませんが、タンパク質は、KRASがどの脂質と相互作用するかを調査するためにリポソームやナノディスクのような膜模倣体を使用する様々な生物物理学的実験に使用できます。これらのデータを使用して、KRASが細胞の血漿膜とどのように相互作用するかを推定し始めることができます。今回、我々の研究グループは、KRASのX線結晶構造を、このタンパク質の遠分化およびメチル化形態に特異的なシャペロンと複合体で解くことができた。

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