Name: 骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: 学ぶ骨肉腫由来細胞外小胞による間葉系幹細胞のLINE-1メチル化解析法。メチル化特異的プローブ増幅法を用いて、がん細胞が周囲の幹細胞に与えるエピジェネティック影響を評価します。

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この研究は、ヘルシンキ大学プロジェクト資金(WBS490302、WBS73714112)ヘルシンキ大学病院国立大学レベルの健康研究のための資金(Y1014SUL05、TYH2016130)、フィンランドノルウェー医療財団、セルマとマジャ・リサ・セランダー基金(ミネルバ財団)。私たちは、変更されたMSPAプロトコルを提供し、関連する技術サポートのためにウォルター・パヴィッチに感謝します。ティーム・マザリン(ヘルシンキ大学)がビデオ制作を手伝ってくれたことに感謝しています。

この研究は、ヘルシンキとウシマ病院地区の倫理委員会によって承認されました(倫理承認第217/13/03/02/2015)。
1. 超遠心分離によるEV枯渇FBSの調製
<ol><li>FBSを(超)遠心管に入れ、超遠心分離機のバケツに入れ。超遠心分離がスムーズかつ安全に実行されるように、互いの10mg以内のバケットのバランスをとります。</li>
	<li>バケットをスイングローターにロードします(SW28、kファクター246と入力)。ローターを超遠心分離機に入れ、4 °Cで19時間100,000 x gで走ります。</li>
	<li>上清の明るい色の上層(約9分の1)を注意深く集め、50mLチューブに移します。FBSのEVが含まれているため、ダークブラウンペレットを邪魔したりピペットしたりしないでください。</li>
	<li>0.22 μm フィルターを通して上清を新しい 50 mL チューブに渡します。</li>
	<li>EV分離のために細胞を成長させた場合、細胞培養培地にフィルター滅菌、EV枯渇FBSを加える。</li>
</ol>2. 骨肉腫由来EVの分離
<ol><li>プレートOS細胞(HOS-143B細胞株)は、RPMI 1640培地を有するT-175フラスコに、10%の正常FBSおよび1%の抗生物質(100 U/mLペニシリン、0.1mg/mLストレプトマイシン)を補充した。フラスコを37°Cおよび5%のCO2のインキュベーターに置く。</li>
	<li>フラスコが70%~80%のコンフルエントな場合、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、10%のEV枯渇FBS(以下EV枯渇培地と呼ばれる)を含む培地で増殖させます。 注:T175フラスコで1 x 106 6 HOS-143B細胞をメッキすると、約60時間後に70%のコンフルエンシーに達する。</li>
	<li>次の48時間の間に、24時間ごとに骨肉腫細胞から調整された培地を収集し、新鮮なEV枯渇培地を追加します。</li>
	<li>4°Cで20分間2500 x gで調整培地を遠心分離し、細胞および細胞の破片を除去します。上清を新しいチューブに移し、下部に約2 mLの媒体を残します。 注: この段階で EV 分離を直接進めなければ、上清は -80 oC で保管できます。</li>
	<li>上澄み剤を超遠心管に注ぎ、以前と同じバランスをとります。4 °Cで2時間100,000 x gでチューブを遠心分離する。</li>
	<li>上清を慎重に捨て、底部に1mL前後を残します。チューブとピペットに約20 mLのPBS(0.1μmろ過)を加え、EVペレットを洗って再懸濁します。</li>
	<li>チューブのバランスをとり、同じ設定で超遠心分離の別のラウンドを実行します。</li>
	<li>上清を慎重に取り出し、穏やかなピペッティングで200μLのPBSにEVペレットを再懸濁します。低結合チューブに EV を格納します。 注: EV は、必要になるまですぐに使用することも、-80 °C で保存することもできます。</li>
</ol>3. OS-EVの特性評価
注:精製されたEVは、ウェスタンブロッティング(WB)、ナノ粒子追跡分析(NTA)、透過電子顕微鏡(TEM)16によって特徴付けることができます。
<ol><li>EVマーカーCD63、TSG101、およびHsp70を用いて標準プロトコル16に従ってWBを行い、かつ、EVサンプル20の純度を示す負の対照としてカルネキシンを用いた。</li>
	<li>NTAの場合、まず、ダルベッコのPBSをろ過した0.1μmでEVサンプルを希釈し、フレームあたり30~100個の粒子を得ます。<ol>
<li>サンプルの約500μLを1 mLのシリンジに取り込み、NTAインストゥルメントの入口ポートにロードします。正確な測定のために、フレームごとに十分な粒子があることを確認してください。</li>
		<li>NTAソフトウェアを開き、周囲温度でカメラレベル13を使用して、60sの持続時間の5つのビデオを記録します。分析中は、検出しきい値 = 5、ゲイン = 10 を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前述の21に従って、TEM による EV サンプルの分析</li>
</ol>4. AT-MSC 文化
注:間葉系幹細胞分離のためのヒト脂肪組織は、脂肪吸引吸引吸引吸引として提供された(フィンランドレーザーティルッカ株式会社形成外科)。書面によるインフォームド・コンセントは、選択的脂肪吸引処置を受けていた脂肪吸引ドナーから取られた。
<ol><li>標準的な機械的および酵素的分離方法22を使用して、脂肪吸引吸引吸引から AT-CS を分離する。 注: 他のソース(市販の細胞株を含む)からのMSCも使用することができます。</li>
	<li></ol><ol><li><li><li><ol><li> </li></ol></li><li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li><li><li><ol><li></ol></li><li><li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li><li></li></ol></li><li><ol><li> </li><li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60705/60705eq1.jpg"> </li></ol></li></ol>

<ol><li>Esteller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+epigenomics%3A+DNA+methylomes+and+histone-modification+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer epigenomics: DNA methylomes and histone-modification maps.</a> Nature Reviews Genetics. 8, 286-298 (2007).</li>
<li>Herman, J. G., Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+cancer+in+association+with+promoter+hypermethylation%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in cancer in association with promoter hypermethylation.</a> New England Journal of Medicine. 349, 2042-2054 (2003).</li>
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<li>Puhka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+of+extracellular+vesicles+and+alternative+normalization+methods+reveal+enriched+metabolites+and+strategies+to+study+prostate+cancer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling of extracellular vesicles and alternative normalization methods reveal enriched metabolites and strategies to study prostate cancer-related changes.</a> Theranostics. 7 (16), 3824(2017).</li>
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<li>Pavicic, W., Joensuu, E. I., Nieminen, T., Peltomäki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LINE-1+hypomethylation+in+familial+and+sporadic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">LINE-1 hypomethylation in familial and sporadic cancer.</a> Journal of Molecular Medicine. 90, 827-835 (2012).</li>
<li>L1.2 sequence on GenBank (accession number: AH005269.2). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AH005269</a> (2000).</li>
<li>Designing synthetic MLPA probes (v04). MRC-Holland. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes">https://support.mlpa.com/downloads/files/designing-synthetic-mlpa-probes</a> (2018).</li>
<li>Takara Bio Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview">https://www.takarabio.com/us/products/cell_biology_and_epigenetics/epigenetics/dna_preparation/msre_overview</a> (2018).</li>
<li>Pisanic, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+interspersed+nuclear+element+1+retrotransposons+become+deregulated+during+the+development+of+ovarian+cancer+precursor+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Long interspersed nuclear element 1 retrotransposons become deregulated during the development of ovarian cancer precursor lesions.</a> The American Journal of Pathology. 189 (3), 513-520 (2019).</li>
</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

この研究は、MSPAを使用して特定の遺伝的要素のメチル化状態を検出し、定量化する方法を示しています。ここでの焦点はLINE-1でしたが、プローブは遺伝子や配列の範囲をターゲットに設計することができます。さらに、さまざまな用途に利用できるプローブミックスのリストが増えています。MSPAは、亜硫酸水素変換10を必要としないDNAメチル化分析のための簡単で堅牢な技術です。サンプルの準備からデータ分析までの完全な手順は約 2 日かかりますが、実際の実践的な作業は 4 ~ 5 時間しか必要とされません。ここに示すように、少量のDNA(70ng以下)に適用可能です。
メチル化分析プロトコルの最も重要な部分は、この研究におけるLINE-1プローブミックスのようなカスタムプローブミックスの調製である。その長さが異なるために、LINE-1プローブオリゴヌクレオチドは4〜40nMの範囲で合成されたため、溶解ステップとその後の希釈液は、製造業者の指示25に従って慎重に行わなければならなかった。ここで使用される...

DNAメチル化は、ヒト細胞で起こる主要なエピジェネティック修飾である。DNAメチル化とは、CpGジヌクレオチド中のシトシン残基に対するメチル基の結合をいう。このようなジヌクレオチドは、通常、遺伝子1の5'領域のクラスター(CpG島)に見られる。正常な細胞では、これらのジヌクレオチドの大部分は非メチル化状態で存在し、DNA転写を可能にする。なお、多くの癌は、高メチル化CpG島および転写抑制2に関連しており、特に腫瘍抑制遺伝子において、癌3の様々な特徴に寄与する。
一方、長い散在核元素-1(LINE-1またはL1)は、CpG諸島で通常高レベルのメチル化を有する反復的でトランスポーザブルなDNA元素である。LINE-1のメチル化は転位を防ぎ、ゲノムの完全性を維持するのに役立つ。いくつかのタイプの癌において、LINE−1は、低メチル化され、活性化およびそれに続く経転媒性染色体不安定性4をもたらす。LINE-1はヒトゲノム5のほぼ17%を占め、そのメチル化状態は、世界のゲノムメチル化レベル6の指標として役立つ可能性がある。グローバルLINE-1ハイメチル化は、細胞から腫瘍表現型7への移行に先立つと考えられている。したがって、早期癌発症の潜在的なマーカーとしての約束を保持する。
現在、メチル化分析には、ピロースケンシング、メチル化特異的PCR、マイクロアレイ、クロマチン免疫沈降法1など、いくつかの方法があります。次世代シーケンシングの使用により、DNAメチル化の検出にゲノム全体のアプローチを組み込むことも可能になりました。これらの方法の多くは、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、メチル化されたシトシンが変わらないバイサルファイト処理DNAに依存しています。しかし、亜硫酸水素塩処理DNAを使用すると、非メチル化シトシンからウラシルへの不完全な変換、配列の偏った増幅、シーケンシングエラーなど、いくつかの落とし穴があります。
メチル化特異的プローブ増幅(MSPA)において、メチル化感受性制限酵素HhaI9に対する制限部位(GCGC)を含む2つのオリゴヌクレオチド標的DNA配列からなるプローブ。プローブがDNAにハイブリダイズした後、各サンプルは2つのセットに分けられます。第1セットのプローブはライゲーションを受け、第2セットではプローブがライゲーションを受け、次いでメチル化されていないCGCG部位でHhaI媒介消化を行う。その後、両方のサンプルセットをPCRで増幅し、キャピラリー電気泳動により分離します。非メチル化部位のプローブはHhaIによって消化され、PCR中に増幅されず、ピークシグナルが発生しません。これに対して、メチル化部位のプローブは消化から保護され、PCR中に増幅され、その後ピークシグナル10を生成する。
MSPAには、代替方法に対していくつかの利点があります。まず、少量のDNA(50~100ng)を必要とし、ホルマリン固定パラフィン埋込サンプル10からDNAを分析するのに適しています。これは、亜硫酸水素塩処理DNAを必要としません;実際、この方法で修飾されるDNAには適していません。同時に多くのサンプルを分析することができ、MSPAプローブは複数の遺伝子または配列を同時に標的にするように設計することができます。さらに、プローブは、HhaI制限部位がCpG島10の典型的な配列に対応するように、メチル化DNAに対して特異的かつ感受性である。
本研究では、脂肪組織由来間葉系幹細胞(AT-MSC)におけるLINE-1メチル化に対する骨肉腫(OS)由来細胞外小胞(EV)の影響を調べた。図 1を参照してください。EVは、ほとんどの細胞タイプによって分泌されるナノスケールの膜結合小胞です。それらは、親細胞11、12からタンパク質、脂質、mRNA、マイクロRNA、および追加の分子を運びます。EVは細胞間通信を媒介し、いくつかの病態生理学的条件において重要な役割を果たす13、14。最近の研究では、癌由来のEVが能動的なLINE-1をレシピエント細胞15に移す可能性が示された。HOS-143B細胞系のEVは、他の遺伝的効果16に加えて、MSCにおけるLINE-1のメチル化状態を変化させることができることが以前に報告されている。
EV単離のために細胞を増殖させる場合、FBS由来のEVは他の供給源からのEVを妨害し、結果17、18を妨げる可能性があるため、成長培地にEV枯渇したウシ血清[FBS]を使用することが重要である。超遠心分離は、FBSからEVを枯渇させる最も一般的な方法の1つです。これは、限外濾過や商用EV枯渇FBS19などの代替手段と比較して、比較的簡単で費用対効果の高い手順です。ここで、このプロトコルは、超遠心分離によってEVで枯渇したFBSを調製する方法も示す。
この記事では、OS 細胞系からの EV の分離から、OS-EV 処理された MSC における LINE-1 のメチル化解析まで、前述の技術に関する詳細なプロトコルを紹介します (図 1)。

<table><tbody>NTA 24 ウェルプレート<tr><td>用</td> <td>1 mL シリンジ</td><td>テルモ</td><td>SS+01T1</td></tr><tr><td></td><td>コーニング</td><td>3524</td><td>MSC 細胞培養</td></tr><tr><td>3730xl DNA アナライザー</td><td>Applied Biosystems, ThermoFisher Scientific</td><td>3730XL</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 遠心チューブ</td><td>コーニング</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン オプティマ LE-80K 超遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BlueStar Prestained Protein Marker</td><td>Nippon Genetics</td><td>MWP03</td><td>WB: タンパク質マーカー</td></tr><tr><td>カルネキシン (クローン C5C9)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2679</td><td>WB, 希釈率 1:800</td></tr><tr><td>CD63 (クローン H5C6)</td><td>BD Biosciences</td><td>556019</td><td>WB, 希釈率 1:1000</td></tr><tr><td>Centrifuge 5702 R</td><td>Eppendorf</td><td>5703000010</td><td>馴染培地および細胞用</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810</td><td>Eppendorf</td><td>5810000010</td><td>スピンダウン用 96ウェルプレート</td></tr><tr><td>遠心チューブ (ポリアロマー, 14x95 mm)</td><td>Beckman</td><td>331374</td><td>超遠心分離</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 + GlutaMAX 培地</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>31331-028</td><td>AT-MSC培養用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>GeneScan 500 LIZ サイズ標準</td><td>適用バイオシステムズ、ライフサイエンス</td><td>キャ</td><td>ピラリー電気泳動用</td>4322682</tr><tr><td>GenomePlex 完全全ゲノム増幅(WGA)キット</td><td>Sigma</td><td>WGA2-10RXN</td><td>MSPAネガティブコントロール用</td></tr><tr><td>Hi-Diホルムアミド</td><td>Applied Biosystems、Life Technologies</td><td>4311320</td> キャ<td>ピラリー電気泳動用</td></tr><tr><td>HOS-143B細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-8303</td><td></td></tr><tr><td>Hsp70 (クローン 5G10)</td><td>BD Biosciences 554243</td><td></td><td>WB、希釈 1:1000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW ヤギ抗マウス</td><td>Li-Cor</td><td>926-32210</td><td>WB: 二次</td></tr><tr><td>IRDye 800CW ヤギ抗ウサギ</td><td>Li-Cor</td><td>926-32211</td><td>WB: 二次</td></tr><tr><td>LINE-1 プローブミックスプライマー</td><td>IDT</td><td></td><td>表 1</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-well 反応プレート バーコード付き</td><td>Applied Biosystems, Life Technologies</td><td>4306737</td><td>にはシーリングフィルムも必要です</td></tr><tr><td>マイクロBCAタンパク質アッセイキット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>23235</td><td>タンパク質濃度の測定</td></tr><tr><td>MiniProtean TGX 10% ゲル</td><td>バイオ・ラッド</td><td>456-1034</td><td>WB: ゲル電気泳動</td></tr><tr><td>NanoSight LM14C</td><td>NTA</td>ニトロセルロース膜用<td>マルバーン機器</td><td></td></tr><tr><td>0.2 & マイクロ;m</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1620112</td><td>WB: タンパク質導入</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue XS</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740901.50</td><td>DNA 抽出用</td></tr><tr><td>Odyssey Blocking Buffer</td><td>Li-Cor</td><td>927-40000</td><td>WB: ブロッキング、抗体</td></tr><tr><td>PBS、1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CVR</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco、Life Technologies</td><td>DE17-602E</td><td>抗生物質培地</td></tr><tr><td>Protein LoBind tube, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431064</td><td>Evs</td></tr><tr><td>REVERT Total Protein Stain and Wash Solution Kit</td><td>Li-Cor</td><td>926-11015</td><td>WB: 総タンパク質染色</td></tr><tr><td>RKO 細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-2577</td><td>MSPA ポジティブコントロール</td></tr><tr><td>RPMI 培地 1640 + GlutaMAX</td><td>Gibco, Life Technologies</td><td>61870-010</td><td>HOS-143B 細胞培養用</td></tr><tr><td>サルサ MLPA HhaI 酵素</td><td>MRC-ホランド</td><td>SMR50</td><td></td></tr><tr><td>サルサ MLPA 試薬キット</td><td>MRC-ホランド</td><td>EK1-FAM</td><td></td></tr><tr><td>SALSA MLPA P300 プローブミックス</td><td>MRC-ホランド</td><td>P300-100R</td><td></td></tr><tr><td>スイングローター SW-28</td><td>ベックマン・コールター</td><td>342207</td><td>超遠心シ</td></tr><tr><td>リンジ フィルター、0.22 & マイクロ;m</td><td>Jet Biofil</td><td>FPE-204-030</td><td>滅菌ろ過 FBS</td></tr><tr><td>Tecnai 12</td><td>FEI Company</td><td></td><td>with Gatan Orius SC 1000B CCD-camera (Gatan Inc., USA); for TEM</td></tr><tr><td>TBS, 1X tablets</td><td>Medicago</td><td>09-7500-100</td><td>WB: バッファー</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>WB: トランスファー</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td>TCA0096</tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>細胞のトリプシン化用</td></tr><tr><td>TSG101 (クローン 4A10)</td><td>Sigma</td><td>SAB2702167</td><td>WB、希釈率 1:500</td></tr></tbody></table>

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

メチル化特異的プローブ増幅(MSPA)は、DNAサンプルのメチル化レベルの相対的な差異を検出するために使用できる、シンプルで堅牢な手法です。それは、機知に富み、少量のDNAを必要とし、約4〜5時間の実作業を要します。提示された技術では、DNAサンプルはまず、メチル化または参照部位のいずれかでDNAを標的とするプローブに対してハイブリダイズされます。ハイブリダイズされたDNAは並列反応に分離され、1つはライゲーションのみを受け、もう1つは結紮を受け、もう1つは非メチル化GCGC配列でHhaI媒介消化を経る。得られたDNA断片はPCRにより増幅され、毛細管電気泳動によって分離される。メチル化GCGC部位はHhaIによって消化されず、ピークシグナルを生成しますが、非メチル化GCGC部位は消化され、ピーク信号は生成されません。各サンプルの消化済みおよび未消化のバージョンの制御正規化ピークを比較すると、DNAサンプルのメチル化投与量比が得られます。ここでは、MSPAは間葉系幹細胞における長い間在在核元素1(LINE-1)のメチル化状態に対する骨肉腫由来細胞外小胞(EV)の影響を検出するために使用される。LINE-1sは、通常、癌において低メチル化を受ける反復的なDNA元素であり、この能力において、バイオマーカーとして働く可能性がある。超遠心分離はまた、生物学的流体から細胞外小胞を分離するための費用対効果の高い方法として使用される(すなわち、EV枯渇した胎児ウシ血清[FBS]を調製し、骨肉腫条件化培地[差動遠心分離]からEVを単離する場合)。メチル化分析のために、カスタムLINE-1プローブは、LINE-1プロモーター配列と7つの制御部位の3つのメチル化部位を対象とするように設計されています。このプロトコルは、LINE-1メチル化分析のためのMSPAの使用を実証し、超遠心分離によるEV枯渇FBSの調製を記述する。

本研究の主な目的は、MS-EVがMSCに及ぼすエピジェネティックな影響を評価することであった。ウェスタンブロッティングによる代表的なEVマーカーCD63、Hsp70、TSG101の発現は、OS−EVの存在を確認した。(図2A)。カルネキシンシグナルの欠如は、OS−EV分離の純度を示した。TEMではさらなる純度の指標が認められ、様々なサイズの無傷の小胞が存在する(図2B)。平均OS-EV粒子濃度は7.63x1011/mL(図2C)であった。EVのサイズ分布は50~500nmで、約80%の粒子が50~200nmの範囲に収まる(図2D)。
AT-MCCはOS-EVで処理され、DNAは異なる時刻でM...

ここでは、骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞における間葉系幹細胞における、メチル化特異的プローブ増幅法を用いて、LINE-1要素のメチル化レベルを解析する。ウシ胎児血清から細胞外小胞を分離するための一般的な手順である超遠心分離も実証されている。

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

DNAメチル化は、最も研究されたエピジェネティックシグネチャの1つです。多くの癌は、異常な遺伝子発現および他のゲノム異常に関連するDNAメチル化レベルの変化によって特徴付けられる。長く介在する核元素は、通常はメチル化のレベルが高い反復的なトランスポス可能なゲノム配列です。しかし、癌では多くの場合、過剰メチル化され、活性化し、染色体不安定性を引き起こし得る。本研究では、骨肉腫由来の細胞外小胞を用いた間葉系幹細胞を治療し、がんEVがMECにおけるLINE-1メチル化に影響を及ぼすかどうかを調べた。哺乳類細胞培養培地の不可欠な構成要素であるウシ胎児血清には、多数のウシ由来のEVが含まれています。これらのEvsは、私たちの関心のある細胞からのEvsの分析を妨げるので、EVの分離のために細胞を成長させると、EV枯渇したFBSを使用することが重要です。超遠心チューブでFBSを取り、超遠心分離バケツに入れておきます。スイングローターにロードする前に、お互いの10ミリグラム以内にバケツのバランスを取ります。ローターを超遠心分離機に入れ、摂氏4度で19時間100,000 Gで走ります。実行後、上清の明るい色の上層を慎重に収集し、50ミリリットルのチューブに移します。暗褐色のペレットはFBSのEVを含んでいるため、邪魔したり、パイプを入れたりしないでください。上清を0.22ミクロンフィルターを通して新しい50ミリリットルチューブに入れる。このフィルター滅菌、EV枯渇したFBSは、EV分離のために細胞を成長させるときに細胞培養培地に添加できるようになりました。EVを使い果たした培地で増殖した骨肉腫細胞から、条件付き培地を収集する。細胞および細胞の破片を除去するために、2500 Gで条件付き培地を摂氏4度で20分間遠心する。上清を超遠心チューブに移し、以前と同じバランスをとります。チューブを摂氏4度で2時間100,000Gで遠心分離します。慎重に下部に1ミリリットルの周りに残して上清を捨てます.EVペレットを洗浄して再中断するために、約20ミリリットルのPBSをチューブとピペットに静かに加えます。チューブのバランスをとり、同じ設定で超遠心分離の別のラウンドを実行します。慎重に上清を除去し、穏やかなピペット処理により、PBSの200マイクロリットルでEVペレットを再懸濁します。EVは低結合チューブに保管してください。精製されたEVは、ウェスタンブロッティング、ナノ粒子追跡解析、透過型電子顕微鏡法を特徴とする。24ウェルプレートにウェルあたりプレート15,000 MSC。24時間後、古い培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄し、EV枯渇培地に変更します。OS-EV を含むセルをスケジュールされたタイム ポイントで処理します。EV処理を停止した後、適切な方法を用いて細胞からDNAを抽出する。メチル化分析では、カスタムメイドのメチル化特異的プローブ増幅法を用いた。以前のように、PavicicなどによってカスタマイズされたLINE-1プローブを設計します。メチル化プローブの場合、プロモーター領域内にHhaI制限部位を含む3つの配列を選択する。制御プローブの場合、残りのLINE-1配列からHhaI制限部位を欠いた7つの配列を選択します。TEバッファー中のDNAサンプル70ナノグラムを5マイクロリットルに希釈する。サンプルを摂氏98度で10分間加熱し、摂氏25度まで冷却します。各サンプルに3マイクロリットルのプローブハイブリダイゼーションミックスを加え、サーモサイクラーを実行してプローブをDNAにハイブリダイズできるようにします。室温で、各サンプルに30マイクロリットルのポストハイブリダイゼーションミックスを加えます。10マイクロリットルを2チューブに移します。両方のチューブをサーモサイクラーに入れ、少なくとも1分間摂氏48度でインキュベートします。サンプルは摂氏48度ですが、チューブの最初のセットに10マイクロリットルのライゲーションミックスを加え、2番目のチューブセットにライゲーション-消化ミックスの10マイクロリットルを加えます。次のサーモチルカープログラムを実行します。次に、チューブを回転させ、同時にサーモサイクラーを摂氏72度に設定します。各チューブに5マイクロリットルのポリメラーゼミックスを加え、チューブをサーモサイクラーに入れます。PCR プログラムを実行します。PCRプログラムの実行中に、サイズ標準の2.5マイクロリットルを含む1ミリリットルフォルマミドの溶液を調製します。この溶液の10マイクロリットルを光学96ウェルプレートの各列にピペットする。PCR後、未消化のサンプルと消化したサンプルを、それぞれ1~100~200に希釈し、超純水で希釈します。希釈PCR製品を2マイクロリットルの96ウェルプレートに加えます。気泡を取り除くために15〜20秒間200Gでプレートを遠心します。毛細管電気泳動によるサンプルのフラグメント分析を行う。毛管電気泳動を開くと、電気泳動解析ソフトウェアが得られます。サンプルを選択し、メニューから MLPA にパネルを設定します。パネルをクリックし、コントロールDを押して、この設定をすべてのサンプルに適用します。同様に、すべてのサンプルのマイクロサテライトのデフォルトに解析方法を設定します。すべてのサンプルを選択し、緑の再生ボタンをクリックして分析を実行し、すべてのサンプルを選択してグラフボタンをクリックしてプローブのピークを視覚化します。個々のピークの解像度を高くするには、ピーク領域を拡大します。LINE-1 プローブミックスのプローブに対応する 10 個のピークがすべてラベル付けされていることを確認します。[遺伝子タイプ] タブで、結果を CSV 形式でエクスポートします。データ分析ソフトウェアで CSV ファイルを開き、データを列に並べ替えます。3つのメチル化部位のピークにサイズに基づいてラベルを付けます。残りの7つのピークは、制御プローブに対応しています。ここでは、約117塩基対のサイズを持つLINE-1 2Mプローブピークを使用しています。各サンプルについて、7 つのコントロールのピークの合計ピーク領域を計算します。LINE-1プローブのピーク面積をこの合計で割ります。各サンプルについて、消化されたサンプルの値を未消化試料の値で割って、メチル化投与量比を求める。ウェスタンブロッティング分析では、TSG101、HSP70、およびCD63に対して観測された信号を持つOS-EVの存在を確認しました。カルネキシンシグナルの不在は、EVサンプルが純粋であることを示した。純度の追加の指標は、OS-EVサンプルに存在する様々なサイズの無傷の小胞を有するTEMで観察された。OS-EV粒子濃度及びサイズ分布をNTAにより測定した。EVの80%は50〜200ナノメートルのサイズ範囲であった。ここでは、EV治療の異なる時点でのMSCからのLINE-1のメチル化投与量比を見ることができます。灰色の線は、ポイント 0 からのベースラインメチル化レベルを表します。ポイント3では、EVの投与後の平均メチル化投与量比の低下があり、それによりハイパーメチル化を示す。このEVの過メチル化効果は、ポイント7ではあまり顕著ではありません。ここでは、メチル化分析のための単純で、高感度で、堅牢な手法を示しました。バイサルファイト変換を伴わない少量のDNAを必要とし、パラフィン埋め込みサンプルから単離されたDNAにも適しています。実験と分析の部分を含む全体の方法は、約2日かかります。ゲノム中のLINE-1のコピー数が多いため、通常サンプルではLINE-1のベースラインメチル化が高くなっています。したがって、この方法で観察されるサンプルのメチル化レベルの差は微妙であり得る。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

癌由来細胞の小胞 (Ev) の直噴は骨髄腫瘍進行をサポートのリプログラミングにつながるただし、セルは、この効果を仲介する明確ではありません。ここで、我々 転移の MSCs の EV 教育に重要な役割を明らかに EV を介する腫瘍間葉系幹細胞 (MSC) 相互作用は生体内で、調査するステップバイ ステップ...

腫瘍と間葉系幹細胞の間細胞小胞を介した通信を定義する骨肉腫のマウスの前臨床モデル

ここでは、プロトコルを提案誘導多能性幹細胞 (Ips) の世代の李 Fraumeni シンドローム (LFS) 患者派生繊維芽細胞、間葉系幹細胞 (MSCs) 経由で Ips の分化から骨芽細胞、およびモデリングの体内にLFS...

李 Fraumeni 症候群患者由来の誘導多能性幹細胞を用いた骨肉腫をモデリング

このプロトコルは、小さな RNA ライブラリーの構築と次世代シーケンシングのための細胞培養媒体からマイクロ Rna は細胞を浄化する方法を示します。さまざまな品質管理のチェックポイントは、exRNAs...

分離、シーケンスおよびヒト間葉系幹細胞からの細胞のマイクロ Rna を分析

骨肉腫 (OS) の骨細胞外マトリックス (BEM) モデルは、よく確立され、表示をここでです。原発腫瘍の成長の in vitro真似をして OS の組織学的および cytogenic...

骨肉腫に対する三次元骨細胞外マトリックス モデル

このプロトコルは、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞(hUC-MSC-sEV)を、シンプルなラボスケールのベンチトップ設定で分離する方法を示しています。単離されたhUC-MSC-sEVのサイズ分布、タンパク質濃度、sEVマーカー、および形態は、それぞれナノ粒子追跡分析、BCAタンパク質アッセイ、ウェスタンブロット、および透過型電子顕微鏡によって特徴付けられます。...

ヒト間葉系幹細胞から小さな細胞外小胞を単離するための簡単なベンチトップろ過法

本プロトコルは、培養ヒト間葉系幹細胞から代表的なEV(エキソソームおよびマイクロベシクル)を単離および特性評価するための差動遠心分離について説明しています。これらのEVのさらなる用途についても、本稿で解説しています。...

培養ヒト間葉系幹細胞からの細胞外小胞の単離、特性評価、および治療応用

このプロトコルは、間葉系間質細胞によって放出される細胞外小胞(EV)の選別について詳細に説明しています。特に、機器の設定と選別条件の最適化に焦点を当てています。目標は、細胞外小胞の特性を維持しながら選別することです。...

細胞外小胞単離のための適切なソーティングの設定

このプロトコルは、MeRIP-qPCRを用いて特定のRNAのm6A修飾レベルを評価する詳細なアプローチを提供します。...

骨肉腫細胞における特異的RNAのm6A修飾レベル検出のためのMeRIP-qPCRアッセイ

このレポートは、具体的には、哺乳動物細胞において標的遺伝子のスプライシングを調節する新規な人工スプライシング因子（ASFS）を設計および構築する生物工学の方法を記載しています。この方法はさらに、RNA代謝の他の側面を操作するための様々な人工的な要因を設計するために拡張することができます。...

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

ここでは、生理的酸素条件下でmRNAの5'キャップに結合する翻訳開始因子を分析するためのヒト細胞培養プロトコルを紹介します。この方法は、アガロース結合m7GTPキャップアナログを利用しており、キャップ結合因子とその相互作用パートナーの研究に適しています。...

生理的酸素条件に曝露されたヒト細胞におけるキャップ結合タンパク質の解析

学ぶ骨肉腫由来細胞外小胞による間葉系幹細胞のLINE-1メチル化解析法。メチル化特異的プローブ増幅法を用いて、がん細胞が周囲の幹細胞に与えるエピジェネティック影響を評価します。

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

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