インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

当社のプロトコルは、オルガノイドの構造の複雑さを可視化するために使用することができ、単一細胞解像度でこれらの3D構造における同一性、硫酸塩、分布のマッピングを可能にします。当社の迅速な3日間プロトコルは、様々な起源のオルガノイドに対して完全に最適化されており、非毒性の光学クリアリングステップとシリコンベースの取り付け方法を含む簡単なサンプル調製物を使用しています。プロトコルは簡単ですが、一部は整理された処理やスライドの準備などの重要な手順ですが、テキストを使用するよりも視覚的なデモンストレーションを通じて説明できます。

24ウェルプレートの基部膜抽出物で成長した直径100~500マイクロメートルのオルガノイドを回収するには、各溶接部を洗浄して3Dマトリックスを破壊することなくPBSで収穫し、プレートを氷の上に置きます。各井戸に氷冷回収液を1ミリリットル加え、プレートを摂氏4度の水平シェーカーの上に30〜60分間置きます。PBS溶液中の1%BSAに1ミリリットルのピペットチップを浸し、ピペットを上下に2回浸し、各先端をBSAでコーティングします。

次に、1%PBS BSAの5ミリリットルを条件ごとに15ミリリットルチューブに加え、溶液を廃棄する前にチューブを2〜3回反転させ、チューブの内側をコーティングします。オルガノイドを収集するには、コーティングされた先端を使用してウェル内容物を5〜10回静かに再中断し、15ミリリットルチューブで各条件からオルガノイドのすべてを引き出します。1ミリリットルの氷冷1%PBS BSAでそれぞれ十分にリンスし、オルガノイドがすべて採取されたことを確認し、適切なチューブに流し込みます。

各チューブの最終容積を冷たいPBSで最大10ミリリットルにし、遠心分離によってオルガノイドを沈下し、3Dマトリックスの目に見える層のないタイトなパレットを得る。オルガノイドを固定するには、コーティングされた1ミリリットルのピペットチップを使用して、各ペレットを氷冷パラホルムアルデヒドの1ミリリットルで慎重に再中断し、45分間摂氏4度で固定します。固定時間の途中でオルガノイドを穏やかに再中断します。

45分後、各チューブに10ミリリットルの氷冷PBSとトゥイーン20を加え、反転して軽く混ぜ合わせ、チューブを摂氏4度で10分間置きます。オルガノイドを遮断するには、インキュベーションの終わりに、サンプルをスピンダウンし、メッキされるウェルあたり少なくとも200マイクロリットルの氷冷オルガノイド洗浄バッファーでペレットを再中断する。その後、オルガノイドを摂氏4度で15分間インキュベーションするために、24ウェルのサスペンションプレートの個々の井戸に移します。

免疫標識のために空の参照ウェルにオルガノイド洗浄バッファーの200マイクロリットルを追加し、オルガノイドがプレートの底に落ち着くようにします。オルガノイドが落ち着いたら、洗浄バッファーの最後の200マイクロリットルを除くすべてを除去できるように、プレートを45度の角度で傾けます。次に、目的の一次抗体を含むオルガノイド洗浄バッファーの200マイクロリットルを追加し、1分間に40回転で軽度の揺れと揺れで摂氏4度でプレートを一晩置きます。

翌朝、オルガノイド洗浄バッファーを各ウェルに1ミリリットル加え、オルガノイドをプレートの底に3分間落ち着かせる。オルガノイドが落ち着いたら、各井戸から最後の200マイクロリットルを除いてすべてを取り除き、新鮮なオルガノイド洗浄バッファーの1ミリリットルで3回の2時間の洗浄でオルガノイドを洗浄し、洗浄ごとに軽度の揺れと揺れを行います。3回目の洗浄後、オルガノイドをプレートの底に3分間落ち着かせ、各井戸からオルガノイド洗浄バッファーの最後の200マイクロリットルを除くすべてを取り除きます。

適切な二次抗体を含むオルガノイド洗浄バッファーを200マイクロリットル加え、穏やかな揺れと揺れで摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、デモンストレーションのように、1回の洗浄ごとに新鮮なオルガノイド洗浄バッファーの1ミリリットルで3回の2時間の洗浄でオルガノイドを洗浄します。最後の洗浄後、オルガノイドを井戸あたり1.5ミリリットルチューブに移し、遠心分離によってオルガノイドを採取する。

オルガノイドの光学的洗浄のために、オルガノイドを破壊することなく、各チューブからできるだけ多くの洗浄バッファーを取り出し、各ペレットに少なくとも50マイクロリットルのFUnGIを加えるために、修正された200マイクロリットルのピペットチップを使用する。室温で20分間のインキュベーションの後、オルガノイドは摂氏4度で最大1週間、またはマイナス20°Cで最大6ヶ月間保存することができます。共焦点顕微鏡によるオルガノイドイメージング用のスライドを準備するには、10ミリリットルのシリンジにシリコーンシーラントを充填し、変更された200マイクロリットルのピペットチップをシリンジに取り付けます。

シリンジを使用してスライドの中央に1×2センチメートルの長方形を描き、2番目の修正された200マイクロリットルピペットチップを使用して、クリアされたオルガノイドを長方形の真ん中に配置します。オルガノイドの上にカバースリップを置くために、カバーの左側を最初に下げ、カバースリップを左から右にゆっくりと下げて空気が閉じ込めなくなるまで置きます。その後、カバースリップの端すべてに静かに圧力をかけ、シリコーンシーラントにしっかりと取り付けます。

オルガノイドを画像化するには、スライドを共焦点レーザー走査顕微鏡のステージに置き、共焦点イメージング用のマルチ浸漬25 X目的を選択します。顕微鏡を適切な取得設定に設定し、低レーザーパワーを選択して、写真の漂白を低減します。Z スタック モードを使用して下端の上限を定義し、Z ステップ サイズを最適に設定します。

大きなオルガノイド構造、または複数のオルガノイドを一緒にイメージングする場合は、10%のオーバーラップを持つタイリングモードを使用し、対象領域を示します。すべてのパラメータが設定されたら、イメージング ソフトウェアでイメージングの 3D レンダリング表現を取得し、明るさ、コントラスト、および 3D レンダリング プロパティを最適化します。その結果の RGB スナップショットを TIFF ファイルとしてエクスポートします。

2Dイメージングと比較した3Dイメージングの強度は、実証したように生成されたマウス乳腺オルガノイドのこれらの画像によって示されています。これらの代表的なオルガノイドの中心層は、柱状のK8/K18陽性の発光細胞で構成され、外層には細長いK5陽性バジル細胞が含まれ、インビボの乳腺の形態を再現する。この偏光組織は、同じオルガノイドの2D光学部分から鑑賞することは困難です。

3D情報なしで解釈することができない複雑な構造の別の例は、ヒト肝オルガノイドの胆汁液の収集を容易にするMRP2陽性カナリクリのネットワークである。さらに、得られた品質と解像度は、半自動セグメンテーションと画像解析を可能にします。したがって、総細胞数およびマーカーの存在は、オルガノイド全体における特定の細胞サブタイプで定量化することができる。

140個の細胞を含むオルガノイド全体の核をセグメント化することで、Ki67細胞周期マーカーに対して高い陽性を示す3つの細胞を同定することができる。光学的な清算剤FUnGIは、オルガノイドの奥深くにある蛍光シグナル品質において、不明瞭でフルクトースグリセロールクリアリングを上回る。FUnGIは、不明なオルガノイドと比較して全体的に強化された蛍光強度を示すオルガノイドをクリアしました。

なお、サンプル中の残りのBMEは抗体の浸透を減らし、高いバックグラウンドシグナルを引き起こす可能性があることに注意してください。さらに、嚢胞性オルガノイドは、崩壊した場合に光学的にクリアされるべきではありません。プロトコルにわずかな適応によって、サンプルは超決断共焦点、多光子およびライトシート顕微鏡で使用することができる。