Name: インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶ インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング手法。光学クリアリングと共焦点顕微鏡を用いて、オルガノイドの構造複雑性と細胞分布を可視化する3日間プロトコルを解説。

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私たちは、プリンセス・マヒマ小児腫瘍学センターとフブレヒト研究所とツァイスのイメージングサポートとコラボレーションに対する技術サポートに非常に感謝しています。すべてのイメージングは、プリンセスマキマイメージングセンターで行われました。この研究は、マキシマ王女小児腫瘍学センターによって財政的に支援されました。JFDは、マリー・キュリー・グローバル・フェローシップとオランダ科学研究機構(NWO)からのVENI助成金によって支援されました。ACRは、欧州理事会(ERC)の助成金を開始することによって支援されました。

マウス由来オルガノイドの使用は規制基準に準拠し、ウォルター・アンド・イライザホール研究所(WEHI)動物倫理委員会によって承認されました。すべてのヒトオルガノイドサンプルは、フブレヒトオルガノイド技術(HUB、www.hub4organoids.nlを介してバイオバンクから回収された。UMCユトレヒト医療倫理委員会(METC UMCU)は、ヒト被験者法に関するオランダ医学研究の遵守を確保するために、HUBの要請により取得され、必要に応じてドナーからインフォームド・コンセントを得た。
1. 試薬の調製
<ol><li>4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA)を調製し、400mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を水浴中で60°C弱に加熱します。20gのPFA粉末を加え、撹拌機を使用して溶解します。<ol>
<li>次に、10 M NaOH の数滴を追加します。氷の上で冷却し、7.4にpHを調整するために10 M HClの数滴を追加してみましょう。500 mLとアリコートにPBSを上げる(2ヶ月まで-20°Cで保管してください)。 メモ:PFAの劣化を避けるために60°C以上に加熱しないでください。準備時間= 4時間。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tween-20(PBT)(0.1%v/v)でPBSを準備するには、1 mLのTween-20から1 LのPBS(4°Cで最大4週間保存)を加えます。 注意:準備時間= 10分。</li>
	<li>0.5 Mエチレンアミン酢酸(EDTA)の100mLを調製するには、EDTAの18.6 gと2.5gのNAOHをdH2Oの80 mLに加え、pHを1M NaOHで8に調整し、dH2 Oで100mLに充填します。2</li>
	<li>1 Mトリスの500 mLを調製するには、42 mLの濃縮(36-38%)で60.55 gのトリスを溶解します。HClを300mLのdH2O. pHを8に調整し、500 mLに充填します。</li>
	<li>オルガノイド洗浄バッファー(OWB)を調製するには、トリトンX-100の1mL、10%(w/v)SDSの2mL、および2gのウシ血清アルブミン(BSA)を1 LのPBS(4°Cで2週間まで保存)を加える。 注意:準備時間= 10分。</li>
	<li>220 mLのFUnGIを作るために、20 mLのdH2Oとグリセロールの110 mL、トリスバッファーの2.2 mL(1 M,pH 8.0)およびEDTA(0.5 M)の440 μLを混合する。フルクトース50gを加え、暗闇の中で溶けるまで室温(RT)で混ぜます。クリアしたら、フルクトースを49g加え、溶かすまで混ぜます。その後、尿素33.1gを加え、溶かすまで混ぜます(暗闇の中で4°Cで保存)。 注:フルクトースがより高い温度でキャラメル化するので加熱しないでください。FUnGIは50%(v/v)グリセロール、9.4%(v/v)dH2O、10.6 mMトリスベース、1.1 mM EDTA、2.5 Mフルクトースおよび2.5 M尿素で構成されています。準備時間= 1日。</li>
	<li>PBS-BSA(1%w/v)を調製するために、1gのBSAをPBSの100mLに溶解する(4°Cで2週間まで保存する)。 注意:準備時間= 10分。</li>
</ol>2. オルガノイドの回復
注:以下の手順は、100-500 μmの大きさの24ウェルプレートで培養した基膜抽出物(BME)で成長したオルガノイドに適用されます。
<ol><li>培地を吸引し、氷冷PBSで1倍洗浄する。3D 行列を混乱させないようにします。</li>
	<li>氷の上にプレートを置き、各ウェルに氷冷細胞回収液(材料表)の1mLを追加します。水平シェーカー(40 rpm)で4°Cで30-60分インキュベートします。 注: 3D マトリックスの液滴は完全に溶解する必要があります。</li>
	<li>1%PBS-BSAに浸し、2倍のピペットを上下に浸して、BSAで1 mLピペットチップをコーティングします。このコーティングは、オルガノイドが先端に付着するのを防ぎます。15 mL円錐状チューブの内側をコーティングするには、5 mLの1%PBS-BSAを充填し、2-3xを反転し、PBS-BSAを廃棄します。 注:このコーティングは、固定(ステップ3.3)まで、すべてのプラスチック消耗品に必要です。</li>
	<li>コーティングされた先端を使用して、ウェル5-10xの内容を静かに再中断し、オルガノイドをコーティングされた15 mLチューブに移します。同一の同一の同一性を有する異なる井戸からのオルガノイドは同じ管にプールすることができる。</li>
	<li>各培養物に1mLの氷冷1%PBS-BSAを加えて、すべてのオルガノイドをすすいで収集します。</li>
	<li>冷たいPBSを10 mLに加え、70 x g および4°Cで3分間スピンダウンし、3Dマトリックスの可視層のないタイトなペレットを得る。上清を慎重に取り除いてください。</li>
</ol>3. 固定とブロッキング
<ol><li>コーティングされた1 mLの先端を使用して、1 mLの氷冷PFAでオルガノイドを慎重に再懸濁します。</li>
	<li>4°Cで45分間固定します。コーティングされた1 mLチップを使用して固定時間の途中でオルガノイドを穏やかに再懸濁し、すべてのオルガノイドの間でも固定を確保します。</li>
	<li>チューブに10mLの氷冷PBTを加え、チューブを反転して軽く混ぜ、10分間インキュベートし、4°Cで 70xgでスピンダウンします。 注:このステップ以降では、ほとんどのオルガノイドタイプが固定後に先端に固執しないので、チップのコーティングは一般的に必要ありません。しかし、一部のオルガノイドは、固定後でもコーティングされたプラスチックを必要とすることがあります。</li>
	<li>氷冷OWB(1ウェルあたり少なくとも200 μLのOWB)でペレットを再懸濁してオルガノイドをブロックし、オルガノイドを24ウェルサスペンションプレートに移します。 注:1つの大きなペレットからのオルガノイドは、異なる染色を行うために複数の井戸に分割することができます。</li>
	<li>4°Cで15分以上インキュベートします。</li>
</ol>4. 免疫標識
<ol><li>ピペット200 μLのOWBは、空の井戸に入り、参照ウェルとして機能します。 注:免疫標識は、抗体の使用を減らすために48ウェルまたは96ウェルプレートで行うこともできます。ただし、ボリュームが小さいため、染色と洗浄の両方のパフォーマンスが低下する可能性があることに注意する必要があります。</li>
	<li>オルガノイドがプレートの底に落ち着くようにします。 メモ:これは、ステレオ顕微鏡を使用して確認することができ、暗い背景を使用して容易にします。</li>
	<li>プレートを45°傾け、OWBの200 μLでオルガノイドを残してOWBを取り除きます(参照ウェルを使用して200 μLを推定します)。</li>
	<li>一次抗体2x濃縮(例えば、E-カドヘリン[1:400]とKi67[1:200])を有する200μLのOWBを加え、 図1;ケラチン5[1:500]の結果を求め、 ケラチン8/18[1:200]、MRP2[1:50]、およびKi67[ 図2の結果については1:200])で一晩インキュベートし、軽く揺れ/揺れしながら4°C(水平シェーカーで40rpm)。</li>
	<li>翌日、1 mL の OWB を追加します。</li>
	<li>オルガノイドをプレートの底に3分間落ち着かせる。プレートに200 μLを残すOWBを取り外します。1 mLのOWBを加え、軽い揺れ/揺れで2時間洗います。</li>
	<li>ステップ 4.6 をさらに 2 回繰り返します。</li>
	<li>オルガノイドをプレートの底に3分間落ち着かせる。ウェルに200 μLを残すOWBを取り外します。</li>
	<li>2次抗体を用いた200 μLのOWBを追加し、コンジュゲート抗体と2x濃縮色素(例えば、DAPI[1:1000]、ラットAF488[1:500]、マウス-AF555[1:500]、ファロロジン-AF647[1:100]の 結果を含む)DAPI [1:1000], ラットAF488 [1:500], ウサギ-AF555 [1:500], マウスAF555 [1:500], ファロイジン-AF647 [1:100] 図2の結果については;DAPI[1:1000]、ファロイジン-AF647[1:100]の結果を 図3)にし、軽く揺れながら4°Cで一晩インキュベートする。</li>
	<li>翌日、ステップ 4.5-4.7 を繰り返します。</li>
	<li>オルガノイドを1.5mLチューブに移し、70 x g で3分間スピンダウンします。</li>
</ol>5. オルガノイドの光学的な除去
<ol><li>オルガノイドを破壊することなくピペッティングして、できるだけOWBを取り除く。</li>
	<li>200 μL 先端をカットオフして FUnGI (50 μL、RT 以上) を追加し、気泡の形成を防ぐために緩やかに再中断します。RTで20分間インキュベートします。 注:FUnGIによる光学的なクリアリングは、軽度の組織収縮を引き起こす可能性があります。これは、単層および多層オルガノイドの一般的な形態に影響を与えない。しかし、大きなルーメンを持つ球状の単層オルガノイドが崩壊する可能性があります。プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは4°C(少なくとも1週間)または-20°C(少なくとも6ヶ月間)に保存することができます。</li>
</ol>6. 共焦点イメージング用のスライド準備
<ol><li>シリコンシーラント(材料表)で10 mLの注射器を準備してください。200 μL の先端を取り付け、端部を切り落とし、シリンジを押した後に粘性シリコーンの穏やかな流れを可能にします。スライドの中央に1 cm x 2 cmの長方形を描くために、注射器を使用します。</li>
	<li>200 μL 先端の端部を切り取り、FUnGI のオルガノイドを長方形の中央に移します。</li>
	<li>カバースリップを上に置きます。閉じ込められた気泡を最小限に抑えるには、最初にカバースリップの左側を置き、次に、閉じ込められた空気がなくなるまでカバースリップを左から右にゆっくりと下げ、カバースリップを放します。 メモ:オルガノイドの大きさがシミリラーであるスペーサーは、損傷を防ぐために使用できます。</li>
	<li>カバースリップの全てのエッジに静かに圧力をかけ、シリコーンシーラントにしっかりと取り付けます。これで、スライドのイメージングの準備が整いました。 注:プロトコルはここで一時停止することができ、サンプルは4 °C(少なくとも1週間)または-20 °C(少なくとも6ヶ月間)に保存することができます。</li>
</ol>7. 画像の取得と処理
<ol><li>共焦点レーザー顕微鏡(材料表)を使用して、多浸25倍または油浸40倍の目的で共焦点イメージング用のスライドを画像化します。<ol>
<li>25xの目的に対して、次の取得設定を使用します:スキャンモードフレーム、フレームサイズ1024 x 1024、ボクセルサイズ332 nm x 332 nm x 1.2 μm、ピクセルドウェル時間<2 μs、双方向スキャン、平均数1、ビット深度8。光の漂白を減らすには、低レーザーパワー(一般的に5%、弱い染色に対して<10%)を使用してください。</li>
		<li>Z スタック モードを使用して下限と上限を定義し、Z ステップ サイズを最適に設定します。大きなオルガノイド構造または多臓器体を一緒にイメージングする場合は、10%のオーバーラップを持つタイリングモードを使用し、対象領域を示します。 注: これらの設定では、直径が <300 μm の典型的なオルガノイドのデータサイズは <1 GB です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>タイル スキャン データセットの場合は、イメージング ファイルを顕微鏡と一緒にソフトウェアにステッチします ([材料表] )。処理セクションで、メソッドとして [ステッチ] を選択し、パラメータの下の [新規出力] を選択して、ステッチするファイルを選択します。 [適用] を押してステッチを開始します。</li>
	<li>イメージング ソフトウェア (表) の[3D ビュー ] タブでイメージングの 3D レンダリング表現を取得し、その後、明るさ、コントラスト、3D レンダリング プロパティを最適化します。結果の RGB スナップショットを TIFF ファイルとしてエクスポートします。</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapshot%3A+Growing+Organoids+from+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Snapshot: Growing Organoids from Stem Cells.</a> Cell. 161 (7), 1700(2015).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).</li>
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<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Nanki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divergent+Routes+toward+Wnt+and+R-spondin+Niche+Independency+during+Human+Gastric+Carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Divergent Routes toward Wnt and R-spondin Niche Independency during Human Gastric Carcinogenesis.</a> Cell. 174 (4), 856-869 (2018).</li>
<li>Jamieson, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+a+robust+mouse+mammary+organoid+system+for+studying+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Derivation of a robust mouse mammary organoid system for studying tissue dynamics.</a> Development. 144 (6), 1065-1071 (2017).</li>
<li>Sachs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Living+Biobank+of+Breast+Cancer+Organoids+Captures+Disease+Heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.</a> Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).</li>
<li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li>
<li>Maimets, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+In+vitro+Expansion+of+Salivary+Gland+Stem+Cells+Driven+by+Wnt+Signals%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term In vitro Expansion of Salivary Gland Stem Cells Driven by Wnt Signals.</a> Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

ここでは、単一細胞分解能を有するインタクトオルガノイドの3Dイメージングのための詳細なプロトコルを打ち出す。このプロトコルを正常に実行するには、いくつかの重要な手順を実行する必要があります。このセクションでは、これらの手順を強調し、トラブルシューティングを提供します。
最初の重要なステップは、3D マトリックスの除去です。ほとんどのオルガノイドは、生体外の環境を模倣するマトリックスを使用して、偏光された3D構造の形成を強化することで、インビトロで伝播されます。3Dマトリックス内での固定化とその後の染色は可能ですが、抗体の浸透に不利な場合や、高いバックグラウンドシグナルを生成する可能性があります(データは示されていません)。マトリックスの効率的な除去は、マトリックスの種類、オルガノイドの量とサイズ、および長期培養の影響を受ける可能性があります。したがって、異なるカルチャ条件に対して最適化が必要になる場合があります。MatrigelまたはBMEで培養されたオルガノイドの場合、氷冷細胞回収液の30〜60分のステップは、オルガノイドを損傷することなくマトリックスを溶解するのに十分です。さらに、支持体系3Dマトリックスを除去すると、例えばオルガノイドが線維芽細胞または免疫細胞と共培養される場合など、天然の構造が失われ、他の細胞タイプとのオルガノイド接触が中断する可能性があります。さらに、最適なオルガノイド固定は、3D組織アーキテクチャ、タンパク質抗原性、自己蛍光の最小化に不可欠です。4°Cで4%PFAで45分間固定することは、通常、幅広いオルガノイドおよび抗原の標識に十分です。しかし、より長い固定ステップ(最大4時間)は、通常、蛍光レポータータンパク質を発現するオルガノイドに適していますが、異なるフルオロフォアに対する最適化が必要です。20分より短い固定時間は、ファロイジンプローブを使用してF-アクチンを適切に標識するのに不十分である。もう一つの共通の問題は、プロトコル中のオルガノイドの損失です。したがって、(i)プラスチックに付着するのを防ぐために未固定オルガノイドを取り扱う際に説明されているように、1%BSA-PBSでピペットの先端とチューブを慎重にコーティングすることが重要であり、(ii)低接着または懸濁液プレートを使用してサンプルがプレートに付着するのを回避し、(iii)オルガノイドが慎重に緩衝液を取り除く前にプレートの底に落ち着くのに十分な時間を与える。粘性FUnGIのピペッティングは、気泡を導入する可能性があります。RTでクリアされたサンプルを取り扱うことは、粘度を低下させ、使いやすさを改善し、オルガノイドの損失を最小限に抑えます。ほとんどのオルガノイドは扱いが容易ですが、拡大した内腔を持つ嚢胞性オルガノイドは、4%PFAで固定するとき、またはFUnGIでクリアすると崩壊する傾向が高い。この効果は、別の固定剤(例えば、ホルマリンまたはPFA-グルタルアルデヒド)を用いることによって、完全には防止できないが、減少させることができる。しかし、これは潜在的に自己蛍光、抗体の浸透およびエピトープの可用性に影響を与える可能性があります。嚢胞性オルガノイドがクリア後に折り畳まれているように見える場合は、光散乱によって妨げられる可能性が低いマルチフォトン顕微鏡によってクリアステップと画像をスキップすることをお勧めします。最後に、オルガノイドの3D構造全体を得る手間が困難であり、カバースリップとオルガノイド間の距離を最小限に抑える必要があります。また、オルガノイドが取付剤内で移動する余地がある場合、Z深度でデータを記録している間にXシフトとYシフトが生じる可能性があります。スライド調製時にシリコーンシーラントを少なく使用することで、カバースリップと顕微鏡スライドの間の最適でない取り付けを解決できます。しかし、シリコーンが少なすぎると、オルガノイド圧縮や本来の3D構造の損失につながる可能性があります。FUnGIは、高粘度のため、イメージング中に滑り台の取り付けとオルガノイドの安定性の取り扱いを向上させます。
このプロトコルは、細胞の内容を深く研究するための幅広いアプリケーションとインタクトオルガノイドの3Dアーキテクチャに使用できますが、特定の制限を考慮する必要があります。この方法は、スループットがかなり低く、時間がかかります。実際、3Dで大きな無傷のオルガノイドをイメージングするには、Zでタイリングとサンプルの取得の両方が必要であり、取得時間が長くなります。より速いイメージングは、共鳴または回転ディスクスキャナを含む顕微鏡資産、または光シート顕微鏡技術26を用いて達成することができる。もう一つの考慮事項は、マーカーが同じサンプルから異なるオルガノイド間で異種的に発現することができるということです。したがって、このオルガノイドの不均一性を培養においてより良く捕捉するために、複数のオルガノイドを獲得する必要がある。最後に、完全なウェットラボの手順は簡単ですが、データの後処理には、3Dの視覚化と定量化のための画像解析ソフトウェアのスキルと、データセットに存在するすべての情報をマイニングするための統計が必要です。
過去10年間で、光学的な消光剤の広い範囲の開発と顕微鏡および計算技術27、30、3130,31の改善の両方に起因する、容27積画像化の分野は、大幅に進歩している。これまで、ほとんどの研究では、臓器や関連する腫瘍の大量イメージングに焦点を当てたが、最近では、オルガノイド構造を含む、より小さく、より脆弱な組織の方法が36、37、3837,38に開発されている。36我々は最近、その後の3Dレンダリングおよび画像解析26のために、単一の細胞レベルで様々な起源、大きさおよび形状の全型オルガノイドをイメージングするための簡単で迅速な方法を発表し、ここでいくつかの改善(例えば、FUnGI、シリコーンマウント)とビデオプロトコルを伴った。この方法は、複雑な細胞形態や組織アーキテクチャを解読する従来の2次元断面ベースのイメージング(図2)に比べて優れ、共焦点顕微鏡を用いた実験室での実装が容易である。プロトコルにわずかな適応により、サンプルは超解像度共焦点、多光子、ライトシートイメージングと互換性があり、このプロトコルを広く適用可能にし、オルガノイドでモデル化できる多次元の複雑性をよりよく理解するための強力なツールをユーザーに提供します。

オルガノイド技術などの新しい培養法の進歩により、皿1の中の器官の培養が可能になった。オルガノイドは、表現型および機能的形質を維持する中で、起源の組織を再センセブルする3次元(3D)構造に成長する。オルガノイドは現在、基本的な生物学的問題2に対処するのに役立ち、がん3を含む疾患をモデル化し、パーソナライズされた治療戦略4、5、6、75,6,7を開発しています。4腸成体幹細胞8由来のオルガノイドを生成する第1のプロトコル以来、前立腺9、,15脳10、肝臓11、12、胃13、乳房14、子宮内膜11,1216、唾液腺17、味覚芽18、膵臓19、および200、腎臓を含む器官に由来する健康および癌性組織の広い範囲を含むように拡張した。
オルガノイドの開発は、3D,21、22、23、24,22で全体のマウント組織のアーキテクチャを視覚化することができる新しい容積顕微鏡技術の台頭23と24一致している。3Dイメージングは、生物学的標本の複雑な組織化を視覚化する際の従来の2D組織セクションイメージングよりも優れています。3D情報は、細胞組成、細胞形状、細胞-運命の決定、および無傷の生物学的サンプルの細胞細胞相互作用を理解するために不可欠であることが証明されています。共焦点または多光子レーザー走査顕微鏡(CLSMおよびMLSM)および光シート蛍光顕微鏡(LSFM)などの非破壊光学断面技術は、単一の生物学的標本内の細部と一般的な組織アーキテクチャの両方を組み合わせた可視化を可能にするようになりました。この強力なイメージングアプローチは、オルガノイド25でモデル化できる構造の複雑さを研究し、これらの3D構造を構成するすべての個々の細胞の空間分布、表形性同一性および細胞状態をマッピングする機会を提供する。
最近、我々は、固定およびクリアオルガノイド26の高解像度3Dイメージングのための詳細なプロトコルを公開しました。このプロトコルは、DISCO,,27、28、CUBIC2829、30、31、およびCLARITY30,3132、33などの大規模な無傷組織の29方法論とは対照的に、繊細なオルガノイド構造の処理のために特別に設計され、33最適化されています。したがって、この方法は、一般的に、起源、大きさおよび形状および細胞の含有量が異なる多種多様なオルガノイドに適用可能である。さらに、多くの場合、かなりの時間と労力を必要とする他の容積画像プロトコルと比較して、当社のプロトコルは要求が厳しくなく、3日以内に完了することができます。我々は、ヒト気道34、腎臓20、肝臓11、ヒト乳癌オルガノイド15を含む様々な組織に由来する新開発のオルガノイド系のアーキテクチャと細胞組成を可視化するために、当社の3D画像化プロトコルを適用した。多色蛍光系統トレースと組み合わせて、マウス乳腺オルガノイド14における基底細胞の生体効性を明らかにするためにもこの方法が用いられている。
ここでは、非毒性の消薬剤FUnGI35を導入してプロトコルを改良します。FUnGIの清算は単一のインキュベーションステップで達成され、その粘度のために取付け易く、貯蔵中の蛍光をよりよく保存する。また、洗浄バッファーにドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を導入し、核染色を強化するとともに、顕微鏡検査前に容易なスライド調製のためのシリコーンベースの取り付け方法を導入しています。 図 1 は、プロトコルの図表の概要 (図 1A)と 3D イメージオルガノイドの例を示しています (図 1B-D)。要するに、オルガノイドは3Dマトリックスから回収され、固定および免疫標識され、光学的にクリアされ、共焦点顕微鏡を使用して画像化され、可視化ソフトウェアで3Dレンダリングされます。

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 安全ロック遠心分離管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>2 ml 安全ロック遠心分離管</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030 120.094</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>細胞回収溶液</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM880</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡ソフトウェア ZEN</td><td>ツァイス</td><td>ZEN ブラック/ブルー</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブ 15 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>5618-8271</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス #1.5 24x60mm</td><td>Menzel-Glazer</td><td>G418-15</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス #1.5 48x60mm</td><td>ProSciTech</td><td>G425-4860</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td>希釈 1:1000</td></tr><tr><td>解剖実体顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M205 FA</td><td></td></tr><tr><td>両面粘着テープ 12.7 mm 6.35 m</td><td>スコッチ 3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>1x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15576-028</td><td></td></tr><tr><td>フォーカス クリア</td><td>セルエクスプローラー</td><td>FC-101</td><td></td></tr><tr><td>フルクトース</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ブーム</td><td>76050771.0500</td><td></td></tr><tr><td>目盛り付きトランスファーピペットSamco</td><td></td><td>222-15</td><td></td></tr><tr><td>水平シェー</td><td>カーVWR</td><td>444-2900</td><td></td></tr>塩<tr><td>酸(HCl)</td><td>Ajax Firechem。</td><td>265.2.5L-PL</td><td>10M ストック溶液、腐食性</td></tr><tr><td>Imaris ソフトウェア</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 スライド スーパーフロスト</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10143352</td><td>グランド エッジ、90 度 26 mm~76 mm</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P6148-500g</td><td>危険な</td></tr><tr><td>ファロイジン アレクサ フルオ 647</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A22287</td><td>希釈 1:100-200</td></tr><tr><td>E-カドヘリン</td><td>ThermoFisher</td><td>13-1900</td><td>希釈率 1:400</td></tr><tr><td>Ki-67</td><td>BD Biosciences</td><td>B56</td><td>希釈率 1:200</td></tr><tr><td>ケラチン 5</td><td>BioLegend</td><td>905501</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>ケラチン 8/18</td><td>DSHB (アイオワ大学)</td><td></td> <td>希釈率 1:200</td></tr><tr><td>MRP2</td><td>Abcam</td><td>ab3373</td><td>希釈率 1:50</td></tr><tr><td>二次ラット IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21208</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>二次マウス IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher</td><td>A-31570</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>二次ウサギ IgG (H+L) Alexa Fluor 555</td><td>ThermoFisher</td><td>A-31572</td><td>希釈率 1:500</td></tr><tr><td>シリコーンシーラント</td><td>Griffon</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>ThermoFisher</td><td>28312</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム(NaOH)ペレット</td><td>メルクミリポア</td><td>567530</td><td>10 Mストック溶液、腐食性</td></tr><tr><td>懸濁液 細胞培養プレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662102</td><td>24ウェル</td></tr><tr><td>トリス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11486631</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T8532</td><td>危険な</td></tr><tr><td>トゥイーン-20</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 低融点 (LMP) アガロー</td>ス <td>ThermoFisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51456</td><td></td></tr><tr><td>ワークステーション</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

オルガノイド技術は、ミニチュア組織の3D培養で、臓器の発達と機能、ならびに疾患を支配する細胞プロセスのための新しい実験ウィンドウを開いた。 蛍光顕微鏡は、細胞組成を詳細に特徴付け、それらが起源とする組織との類似性を実証する上で大きな役割を果たしてきました。本稿では、免疫蛍光標識時のオルガノイド全体の高解像度3Dイメージングに関する包括的なプロトコルを紹介する。この方法は、起源、大きさおよび形状が異なるオルガノイドのイメージングに広く適用可能である。これまで、健康なヒト組織に由来する気道、結腸、腎臓、肝オルガノイド、ならびにヒト乳房腫瘍オルガノイドおよびマウス乳腺オルガノイドにこの方法を適用してきました。我々は、マーカーの単細胞定量化の機会と全体の3Dオルガノイドの取得を可能にする光学的な清算剤、FUnGIを使用しています。オルガノイドの収穫から画像解析までの3日間のプロトコルは、共焦点顕微鏡を用いた3Dイメージングに最適化されています。

3Dでオルガノイドをイメージングすると、アーキテクチャ、細胞組成、細胞内プロセスの可視化が非常に詳細に可能になります。提示された技術は要求が厳しく、おそらく様々な器官または宿主種に由来する幅広いオルガノイド系に適用することができる。
2Dイメージングと比較した3Dイメージングの強度は、最近公表された方法14を用いて生成されたマウス乳腺オルガノイドの画像によって示される。これらのオルガノイドの中心層は、柱状のK8/K18陽性の発光細胞で構成され、外層には細長いK5ポスト基底細胞(図2A)が含まれており、生体内の乳腺の形態を再現する。この偏光組織は、同じオルガノイドの2D光学部分(図2B、中央パネル)から鑑賞することは困難です。3D情報なしで解釈することができない複雑な構造の別の例は、ヒト肝オルガノイド11 の胆汁液の収集を容易にするMRP2陽性カナリクリのネットワークである(図2B)。これは、我々の方法がオルガノイドの本質的な構造的特徴を視覚化することを可能にする方法を例示する。さらに、得られた品質と解像度は、半自動セグメンテーションと画像解析を可能にします。したがって、総細胞数およびマーカーの存在は、オルガノイド全体における特定の細胞サブタイプにおいて定量化することができる。これを示すのは、140個の細胞を含むオルガノイド全体の核をセグメント化し、そのうち3細胞がKi67細胞周期マーカーの陽性度が高い(図2C)。DAPIチャンネルはソースチャンネルとして選択され、セグメントは強度しきい値ステップと球径10μmに基づいて生成されます。接触するオブジェクトは、シードポイントから成長する領域によって分割されます。最後に、小さなノイズ誘導セグメントを除去するために10ボクセルのサイズフィルタが適用されます。核を表すセグメントごとに、Ki67 チャネルの平均強度がプロット用にエクスポートされます。
我々は最近、オルガノイドの透明性を高めるためにこのプロトコルに統合された光学的な清算剤FUnGI35を開発しました。FUnGIは、免疫蛍光染色後の単一インキュベーションステップによって容易にクリアが得られるように、使いやすい。薬剤の付加的な利点は、スライド取り付け時のサンプル処理が容易になる粘度です。FUnGIの蛍光サンプルは、−20°Cで数ヶ月間保存しても蛍光を保持します。 我々は、FUnGIがオルガノイドの深部の蛍光シグナル品質において不明確およびフルクトースグリセロールを上回ることを示し(図3A,B)、そしてFunGIクリアされたオルガノイドが不明なオルガノイドと比較して全体的に蛍光強度を増強したことを示す(図3C)。
要約すると、免疫標識されたオルガノイドの容積データを取得するための、要求の厳しくない再現性の高い3Dイメージング技術について述べています。このプロトコルは、マウスとヒトの両方の起源を含む様々なオルガノイドを、健康および疾患モデルから容易に画像化するために使用することができる。簡単なサンプル調製は、共焦点、多光子および光シート蛍光顕微鏡を容易にして、オルガノイド全体の細胞内分解能を得るように調整することができる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig1.jpg"> 図1:高解像度3Dイメージングプロトコルの概略図オルガノイドは3Dマトリックスから回収されます。固定およびブロッキングは、抗体および色素による免疫標識の前に行われる。光クリアリングは、FUnGIクリアリング剤を用いた単一ステップで達成される。画像の3Dレンダリングは、イメージングソフトウェアを使用して行うことができます。(A) 手順の概略図。(B)F-アクチンとE-cad(E-cad)に対して免疫標識されたヒト大腸オルガノイドの全実装3D共焦点像(25x油目的)をクリアした。Bスケールバー= 40 μm(C)全マウント3D共焦点画像をクリア。スケールバー= 20 μm(D)F-アクチン、E-cadin、Ki67(25x油目的)に対して免疫標識されたヒト大腸オルガノイドの拡大光学部分。Dスケールバー= 5 μmこの図は、Dekkersら26から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig2.jpg"> 図2:容積画像は複雑な3Dアーキテクチャを視覚化する。全体マウント 3D データセット(左パネル)、2D 光学断面(中央パネル)、拡大領域の 3D 領域(右パネル)を表す共焦点画像。(A) マウス乳腺の単基底細胞に由来するオルガノイドで、K8/18、K5およびF-アクチン(フルクトースグリセロール除去;25x油性)に対して、発光細胞を囲む細長い乳腺基底細胞の3D組織を示す。スケールバーは55μm(左パネル)と40μm(中央パネルと右パネル)を表します。(B) DAPI、MRP2およびF-アクチン(フルクトースグリセロールクリア;40x油目的)に標識されたMRP2陽性カナリクリの複雑な3Dネットワークを有するヒト胎児肝オルガノイド。スケールバーは25μm(左パネル)と8μm(中央パネルと右パネル)を表します。(C)DAPIとKi67(左パネル)で標識されたヒト胎児肝オルガノイドの共焦点3D全マウント画像と、イメージングソフトウェア(中央パネル)を用いたDAPIチャンネル上のセグメント化された画像。Cスケールバー= 15 μm。キ67平均強度を表すプロットされたグラフは、オルガノイド全体(140細胞)の全ての細胞(DAPIセグメント化)における強度を示す(右パネル)。この図は、Dekkersら26から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60709/60709fig3.jpg"> 図3:FUnGIを用いたオルガノイドの光学的なクリアリング(A)F-アクチン(緑色)とDAPI(灰色)で標識されたヒト大腸オルガノイドの代表的な画像は、クリアリングなしで画像化され、フルクトースグリセロールでクリアされるか、FUnGI(25x油目的)でクリアされた。A左パネル: オルガノイドの 3D レンダリング。右パネル:150μmの深さでオルガノイドの光学断面。「クリアリングなし」条件では、オルガノイドを可視化する「フルクトースグリセロール」および「FUnGI」条件と比較して画像の明るさを増加させなければならなかった。スケールバー= 50 μm(B) 異なる光学的消去法のZ深度の増加に伴うDAPI強度の減少を示す非線形回帰適合。値は、DAPIセグメンテーションによって検出された個々の細胞の強度を表し、オルガノイドの最初の50μmの平均DAPI強度に正規化されます。より深いエッジと出芽構造上の明るい細胞によって引き起こされる減衰の過小評価を避けるために、オルガノイドの中心領域のみが分析された。(C)カバースリップに向かって同様の大きさと深さの条件ごとに3つのオルガノイドを同一の顕微鏡設定を用いて画像化した。完全な 3D データセットは、比較のために DAPI 信号でセグメント化された単一セルでした。完全なセグメント化されたデータセットで異なるクリアメソッドを使用した平均 DAPI 強度を示す棒グラフ。データは SD ±平均値として示されます。= p &lt; 0.0001、 Kruskal-Wallis テストと、両側ダンの多重比較事後テスト。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60709/60709fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

オルガノイドの全体の3D構造および細胞内容、ならびに元の組織に似たその表現型は、ここで説明する単一細胞分解能3D画像化プロトコルを使用して捕捉することができる。このプロトコルは、起源、大きさおよび形状が変化するオルガノイドの広い範囲に適用することができる。

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

当社のプロトコルは、オルガノイドの構造の複雑さを可視化するために使用することができ、単一細胞解像度でこれらの3D構造における同一性、硫酸塩、分布のマッピングを可能にします。当社の迅速な3日間プロトコルは、様々な起源のオルガノイドに対して完全に最適化されており、非毒性の光学クリアリングステップとシリコンベースの取り付け方法を含む簡単なサンプル調製物を使用しています。プロトコルは簡単ですが、一部は整理された処理やスライドの準備などの重要な手順ですが、テキストを使用するよりも視覚的なデモンストレーションを通じて説明できます。24ウェルプレートの基部膜抽出物で成長した直径100~500マイクロメートルのオルガノイドを回収するには、各溶接部を洗浄して3Dマトリックスを破壊することなくPBSで収穫し、プレートを氷の上に置きます。各井戸に氷冷回収液を1ミリリットル加え、プレートを摂氏4度の水平シェーカーの上に30〜60分間置きます。PBS溶液中の1%BSAに1ミリリットルのピペットチップを浸し、ピペットを上下に2回浸し、各先端をBSAでコーティングします。次に、1%PBS BSAの5ミリリットルを条件ごとに15ミリリットルチューブに加え、溶液を廃棄する前にチューブを2〜3回反転させ、チューブの内側をコーティングします。オルガノイドを収集するには、コーティングされた先端を使用してウェル内容物を5〜10回静かに再中断し、15ミリリットルチューブで各条件からオルガノイドのすべてを引き出します。1ミリリットルの氷冷1%PBS BSAでそれぞれ十分にリンスし、オルガノイドがすべて採取されたことを確認し、適切なチューブに流し込みます。各チューブの最終容積を冷たいPBSで最大10ミリリットルにし、遠心分離によってオルガノイドを沈下し、3Dマトリックスの目に見える層のないタイトなパレットを得る。オルガノイドを固定するには、コーティングされた1ミリリットルのピペットチップを使用して、各ペレットを氷冷パラホルムアルデヒドの1ミリリットルで慎重に再中断し、45分間摂氏4度で固定します。固定時間の途中でオルガノイドを穏やかに再中断します。45分後、各チューブに10ミリリットルの氷冷PBSとトゥイーン20を加え、反転して軽く混ぜ合わせ、チューブを摂氏4度で10分間置きます。オルガノイドを遮断するには、インキュベーションの終わりに、サンプルをスピンダウンし、メッキされるウェルあたり少なくとも200マイクロリットルの氷冷オルガノイド洗浄バッファーでペレットを再中断する。その後、オルガノイドを摂氏4度で15分間インキュベーションするために、24ウェルのサスペンションプレートの個々の井戸に移します。免疫標識のために空の参照ウェルにオルガノイド洗浄バッファーの200マイクロリットルを追加し、オルガノイドがプレートの底に落ち着くようにします。オルガノイドが落ち着いたら、洗浄バッファーの最後の200マイクロリットルを除くすべてを除去できるように、プレートを45度の角度で傾けます。次に、目的の一次抗体を含むオルガノイド洗浄バッファーの200マイクロリットルを追加し、1分間に40回転で軽度の揺れと揺れで摂氏4度でプレートを一晩置きます。翌朝、オルガノイド洗浄バッファーを各ウェルに1ミリリットル加え、オルガノイドをプレートの底に3分間落ち着かせる。オルガノイドが落ち着いたら、各井戸から最後の200マイクロリットルを除いてすべてを取り除き、新鮮なオルガノイド洗浄バッファーの1ミリリットルで3回の2時間の洗浄でオルガノイドを洗浄し、洗浄ごとに軽度の揺れと揺れを行います。3回目の洗浄後、オルガノイドをプレートの底に3分間落ち着かせ、各井戸からオルガノイド洗浄バッファーの最後の200マイクロリットルを除くすべてを取り除きます。適切な二次抗体を含むオルガノイド洗浄バッファーを200マイクロリットル加え、穏やかな揺れと揺れで摂氏4度で一晩インキュベーションします。翌朝、デモンストレーションのように、1回の洗浄ごとに新鮮なオルガノイド洗浄バッファーの1ミリリットルで3回の2時間の洗浄でオルガノイドを洗浄します。最後の洗浄後、オルガノイドを井戸あたり1.5ミリリットルチューブに移し、遠心分離によってオルガノイドを採取する。オルガノイドの光学的洗浄のために、オルガノイドを破壊することなく、各チューブからできるだけ多くの洗浄バッファーを取り出し、各ペレットに少なくとも50マイクロリットルのFUnGIを加えるために、修正された200マイクロリットルのピペットチップを使用する。室温で20分間のインキュベーションの後、オルガノイドは摂氏4度で最大1週間、またはマイナス20°Cで最大6ヶ月間保存することができます。共焦点顕微鏡によるオルガノイドイメージング用のスライドを準備するには、10ミリリットルのシリンジにシリコーンシーラントを充填し、変更された200マイクロリットルのピペットチップをシリンジに取り付けます。シリンジを使用してスライドの中央に1×2センチメートルの長方形を描き、2番目の修正された200マイクロリットルピペットチップを使用して、クリアされたオルガノイドを長方形の真ん中に配置します。オルガノイドの上にカバースリップを置くために、カバーの左側を最初に下げ、カバースリップを左から右にゆっくりと下げて空気が閉じ込めなくなるまで置きます。その後、カバースリップの端すべてに静かに圧力をかけ、シリコーンシーラントにしっかりと取り付けます。オルガノイドを画像化するには、スライドを共焦点レーザー走査顕微鏡のステージに置き、共焦点イメージング用のマルチ浸漬25 X目的を選択します。顕微鏡を適切な取得設定に設定し、低レーザーパワーを選択して、写真の漂白を低減します。Z スタック モードを使用して下端の上限を定義し、Z ステップ サイズを最適に設定します。大きなオルガノイド構造、または複数のオルガノイドを一緒にイメージングする場合は、10%のオーバーラップを持つタイリングモードを使用し、対象領域を示します。すべてのパラメータが設定されたら、イメージング ソフトウェアでイメージングの 3D レンダリング表現を取得し、明るさ、コントラスト、および 3D レンダリング プロパティを最適化します。その結果の RGB スナップショットを TIFF ファイルとしてエクスポートします。2Dイメージングと比較した3Dイメージングの強度は、実証したように生成されたマウス乳腺オルガノイドのこれらの画像によって示されています。これらの代表的なオルガノイドの中心層は、柱状のK8/K18陽性の発光細胞で構成され、外層には細長いK5陽性バジル細胞が含まれ、インビボの乳腺の形態を再現する。この偏光組織は、同じオルガノイドの2D光学部分から鑑賞することは困難です。3D情報なしで解釈することができない複雑な構造の別の例は、ヒト肝オルガノイドの胆汁液の収集を容易にするMRP2陽性カナリクリのネットワークである。さらに、得られた品質と解像度は、半自動セグメンテーションと画像解析を可能にします。したがって、総細胞数およびマーカーの存在は、オルガノイド全体における特定の細胞サブタイプで定量化することができる。140個の細胞を含むオルガノイド全体の核をセグメント化することで、Ki67細胞周期マーカーに対して高い陽性を示す3つの細胞を同定することができる。光学的な清算剤FUnGIは、オルガノイドの奥深くにある蛍光シグナル品質において、不明瞭でフルクトースグリセロールクリアリングを上回る。FUnGIは、不明なオルガノイドと比較して全体的に強化された蛍光強度を示すオルガノイドをクリアしました。なお、サンプル中の残りのBMEは抗体の浸透を減らし、高いバックグラウンドシグナルを引き起こす可能性があることに注意してください。さらに、嚢胞性オルガノイドは、崩壊した場合に光学的にクリアされるべきではありません。プロトコルにわずかな適応によって、サンプルは超決断共焦点、多光子およびライトシート顕微鏡で使用することができる。

single-cell-resolution-three-dimensional-imaging-of-intact-organoids

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶ インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング手法。光学クリアリングと共焦点顕微鏡を用いて、オルガノイドの構造複雑性と細胞分布を可視化する3日間プロトコルを解説。

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

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