肝腫瘍細胞の文脈における自然キラー細胞媒介性細胞毒性と遊性の測定

がん細胞によるナチュラルキラー(NK)細胞介在の根絶の回避は、がんの開始と進行に重要です。ここでは、肝腫瘍細胞に対するNK細胞媒介性細胞毒性を評価するための非放射活性ベースの2つのプロトコルを紹介する。さらに、NK細胞の移動を分析するための第3のプロトコルが提示されます。

NK細胞機能の研究方法を示す2つのプロトコルを今日実証します。NK細胞機能には、腫瘍細胞を根絶することができ、腫瘍微小環境に移行できる2つの重要な側面があります。これら2つのプロトコルは、腫瘍細胞を根絶するNK細胞能力を実証し、腫瘍微小環境にも移行することができる。

したがって、今日実証しようとしている2つのプロトコルは簡単で、無線活動の使用を必要とせず、分子生物学と細胞培養の仕事を行う能力を持つほとんどの研究室で確立することができます。私の研究室の2人の博士研究員であるSuresh BugideとSuresh Chavaは、今日、これら2つのプロトコルを実証します。2つはLDHを用いてNK細胞媒介細胞毒性を評価し、まず、37度の摂氏および5%の二酸化炭素で100ミリメートル細胞培養ペトリ皿において70〜80%の合流度にヒト肝癌細胞株を成長させる。

実験の日に、細胞がプレート底から剥離するまで0.25%トリプシンEDTAの1ミリリットルで細胞を処理する前に、PBSの5ミリリットルで培養を洗浄します。単一細胞懸濁液が得られた場合、細胞に10ミリリットルの細胞培養培地を加え、遠心分離のために細胞を15ミリリットルの円錐管に移す。培養液濃度の5ミリリットル当たり50分の5細胞で細胞を再懸濁する前に、5ミリリットルのPBSで細胞ペレットを洗浄します。

次に、96ウェルプレートにおける治療条件毎の三重化でヒト肝癌細胞を対象の1ウェル当たり100マイクロリットルの種子とし、各標的細胞に100マイクロリットルの培地で第5ヒトNK細胞に10回10を加える。その後、細胞培養インキュベーターにプレートを3時間置きます。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって細胞をペレットし、新しい96ウェルプレートの個々のウェルに各ウェルから上澄みの100マイクロリットルを移す。

LDH基板50マイクロリットルを完全に混合して各ウェルに加え、光から保護された室温でプレートを20分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、50マイクロリットルの停止溶液で反応を阻止し、490および680ナノメートルのプレートリーダー上の吸光度を直ちに測定する。次に、式を使用してNK細胞毒性率を計算します。

ヒト肝癌細胞株細胞を70~80%合流まで成長させた後のカルセインAMを用いてNK細胞媒介細胞毒性を評価するために、血清遊離DMEMの3ミリリットルで細胞を再懸濁し、室温で30分間1.5マイクロリットルの10ミリモルカルセインAM溶液で細胞に標識した。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって細胞を採取し、洗浄ごとに5ミリリットルのPBSで細胞を2回洗浄する。培地濃度のミリリットル当たり10~5番目の細胞で細胞を1回再懸濁し、治療条件ごとに3倍のウェルプレートの96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞を加える。

次に、100マイクロリットルの培養培地中の10〜5番目のヒトNK細胞を1回の対象細胞のウェルに1回、細胞培養インキュベーターにプレートを4時間置いた。インキュベーション終了後、10倍の蛍光顕微鏡で各治療条件の複製ごとにカルセインAM陽性細胞の画像の少なくとも10の異なる分野を捕捉する。次に、式を用いて細胞毒性率を計算する。

化学チック刺激に応答してNK細胞の遊走を測定するために、70〜80%のコンフルエント培養からヒトNK細胞を収集し、血清を含まないNK細胞培地培地濃度の1ミリリットル当たり2.5倍から6番目の細胞で細胞を再懸濁する。次に、NK細胞ケモ誘引剤を含む無血清培地600マイクロリットルをウェルごとに添加し、5マイクロメートルの細孔を含む直径6.5ミリメートルの培養インサートを培地の各ウェルに1つ入れる。次に、各インサートの上部コンパートメントに100マイクロリットルのNK細胞を加え、細胞培養インキュベーターにプレートを4時間置きます。

インキュベーションの終わりに、非接着性の移行された細胞の全容を各ウェルの底部から個々の5ミリリットルFACSチューブに移し、所定の数のフローサイトメトリーカウントビーズの50マイクロリットルを各チューブに加える。次にフローサイトメーターを用いて、標準的なフローサイトメトリック解析プロトコルに従って各細胞サンプルを評価し、その式を用いて移動したNK細胞の絶対数を計算する。ATF4ノックダウンは、非特異的な短いヘアピンRNAを発現するNK細胞と比較して、NK細胞媒介性細胞毒性を有意に減少させる。

カルセインAMで染色した後、NK細胞を含まないヒト肝癌細胞と比較してヒトNK細胞との共培養後に生存可能なヒト肝癌細胞の数が減少する。予想通り、短いヘアピンRNAによるATF4ノックダウンは、これらの培養においてより多くのカルセインAM陽性細胞によって証明されるように、ヒト肝癌細胞のNK細胞媒介性の殺死を減少させる。また、ケモカインを含まない制御培地に曝露されたNK細胞に比べ、ケモカイン含有培地に応答して有意に高い量のNK細胞移動が観察される。

NK細胞毒性評価のためには、各がん細胞株の労力と目標比およびインキュベーション時間を標準化することが重要です。基準が特定され、インビトロ評価が確認されると、in vivoマウスの実験で補われ、腫瘍細胞根絶におけるその役割をさらに評価する。