Name: 親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-12T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 学ぶ 親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング法。Drosophilaのニューロン形態発生と接続性を可視化し、神経発生研究に有用な手法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

神山研究室の皆様に、原稿に関するご意見をお寄せいただき、ありがとうございます。この作品は、NIH R01 NS107558(M.I.、K.B.、およびD.K.)によってサポートされました。

1. 機器と消耗品
<ol><li>胚を収集し、卵を産むために大人を訓練するための材料<ol>
<li>50 mLのチューブを切断し、キャップに穴を開けて切断して、チューブとキャップの間に100μm(材料テーブル)の細孔を持つメッシュフィルタを設定して、濾過装置を準備します。 注:あるいは、100μm(材料表)の細孔を有する細胞ストレーナーは、胚採取の濾過工程に使用することができる。</li>
		<li>記載の指示に従って、ブドウ寒天プレミックス(材料のテーブル)で寒天プレートを作ります。簡単に、粉末混合物の1パケットを室温(RT、23°C)dH2Oに軽く攪拌し、溶存混合物を激しく沸騰させる。70−75°Cまで冷却した後、ペトリ皿(60ミリメートル)に混合物を注ぎます。寒天を固めた後、プレートを4°Cで保存します。</li>
		<li>活性乾燥酵母(材料表)と水をペーストの一貫性に混合して酵母ペーストを調製し、4°Cに保ちます。</li>
		<li>十分な空気の流れを提供する卵コレクションケージ(60ミリメートルペトリ皿、材料のテーブル)を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>解剖針と染料注入マイクロピペットの調製<ol>
<li>内径0.6mm、外径1.2mm(材料表)の同じ毛細管から染料注入マイクロピペットと解剖針を用意します。170 V の最大出力 (材料の表) から 7% のマイクロピペット プーラーによってキャピラリー チューブを引っ張り、長さ約 0.4 cm のテーパ付きの鋭い針を作成します。</li>
		<li>染料注入の場合は、計器のマニュアルに記載されているバブルベベル技術により、マイクロピペットベベラー(材料表)でマイクロピペットを調整します。<ol>
<li>要するに、水が針の先端を「ドラッグ」するのを防ぐために、湿潤剤(材料の表)で粉砕機を浸します。マイクロピペットクランプの上に針を25~30°で置き、先端をベベルサーフェスの中心から半径の3分の2に下げます。チューブ付きの注射器が針に空気を押し込む間に針を粉砕し、マイクロピペットがガラスシェービングをクリアするようにします。</li>
			<li>マイクロピペットに細かい先端のパーマネントマーカーを付けると、斜めに形成されたマイクロピペットの狭い開口部を見つけるのが難しいので、ベベル後の先端の開口部の位置を示します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 胚コレクションの準備
<ol><li>大人のハエ(20-40野生型カントン-Sまたは白いハエ)、オスとメスが若い(<7日)と理想的な卵のコレクションのための健康的な条件で維持されていることを確認してください。 注:産卵を刺激するために、ハエは、少なくとも毎日1回、酵母ペーストで縞模様の寒天プレートに卵の収集の数日前に、彼らの卵の収集ケージで訓練されています。</li>
</ol>3. 胚ステージング
<ol><li>ハエがRTで一晩(または少なくとも15時間)卵を産むことを許可し、15時間AEL、すなわちステージ1618で胚を収集し、aCCおよびRP3運動ニューロンの樹状形成を見る。朝、卵と一緒に皿を集めます。 注:15時間AELの胚は、明確な4チャンバー腸18を有する。異なる段階をイメージングするために、彼らの特定の形態学的基準および老化条件に従う。</li>
	<li>胚を収集するために、5分間50%漂白剤でプレートに産まれた卵をデコリオネートします。</li>
	<li>傷口がクリアされたら、濾過装置または細胞ストレーナーを通してプレートの内容物を注ぎ、胚を単離します。水の絞りボトルを使用して、プレートに残った漂白剤を希釈し、フィルターに混合物をデカントすることによって、できるだけ多くの胚を収集します。</li>
	<li>より多くの水で、または漂白剤の臭いが消えるまで、フィルター3-4xの胚を洗浄します。装置からフィルターを取り出し、胚を水で別のきれいなプレートに洗います。胚が置いている新しいプレートから水をデカントします。</li>
	<li>中央に2層のビニールテープで覆い、長方形を形成してガラススライドを準備します。カミソリの刃を使って、長方形のプールをテープから切り取ります。プールの上端に両面テープの細いストリップを配置すると、図1に示すように胚が配置されます。</li>
	<li>細かい鉗子を使用して、15時間AELで5−10の胚を個別に選択し、後ろ側を上に向けた両面テープに置きます。昆虫リンガーの生理線19を解剖プールに追加して、胚を乾燥から保護します(図1)。</li>
</ol>4. 解剖と染色
<ol><li>解剖顕微鏡(材料表)の下でガラス針を使用して、その表面の単一胚の中間線を後部から前端まで切断します。次に、胚をテープからガラスにビテラリン膜からドラッグします(図1をボックス化)。胚の内部組織に損傷を与えないように注意してください。</li>
	<li>中央から上皮組織を反転し、表皮エッジをガラススライドの表面に取り付けます(図1、差し込み)。</li>
	<li>約300μmの先端開口部(解剖針の薄い先端を壊すことによって調製される)の先端の開口部を有する管接続された針を使用して、吸気または吹き飛ばして、後ろ縦気管支幹ならびに残りの腸を取り外す。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩分(PBS)に4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して、RTで胚を5分間固定し、胚をPBSで3x洗浄します。</li>
	<li>シアン3色素(抗HRP Cy3)と共役した抗ホースラディッシュペルオキシダーゼ抗体1μLで胚を染色し、200μLのPBSで1時間PBSで胚を染色した後にPBS 3xで洗浄します。 注:抗HRPの色素は、注射のための選択した親油性染料に基づいて変更することができます。</li>
</ol>5. インジェクションマイクロピペットの充填
<ol><li>熱親油性染料(DiOまたはDiDの5mg/mL、材料の表)を使用前にエタノール:植物油の1:10混合物で60°Cに。</li>
	<li>注射マイクロピペット用の油溶存染料スライドを用意します。マイクロピペットをキャピラリーホルダーに入れます(図2、#1)。マイクロマニピュレータ(材料表)を使用して、ミクロピペットを色素スライド上に調整します。次いで、マイクロピペットを染料上に置くようにステージを調整する(図2、#2)。</li>
	<li>マイクロピペットを埋めるには、マイクロインジェクター(材料表)(図2、#3)を使用します。Pi(射出圧力)を200~500hPa(ヘクトパスカル)、Ti(射出時間)を0.1~0.5s~Pc(補償圧力)の間で5分間0hPaに設定して、マイクロピペット中の色素を回収します(図2、#4)。</li>
	<li>染料を回収したら、染料スライドを取り外し、サンプルを顕微鏡ステージに置きます。次に、ピレピペットをサンプルに下げる前にPcを20~60hPaの範囲に増やし、毛細血管作用によるPBSの汚染を防ぎます。</li>
</ol>6. ニューロンへの色素注入
<ol><li>10倍の対物レンズ(材料表)を用いて中央に胚を見つけ、マイクロピペットを胚に合わせます。 メモ:色素液滴のサイズは、Piまたはマイクロピペット先端の開口部のサイズを変更することによって調整することができます。液滴は10-20 μmで、これは約1筋肉の幅である必要があります。</li>
	<li>対物レンズを水浸40倍レンズ(材料表)に交換し、レンズをPBSに沈下して胚を見ます。<ol>
<li>蛍光顕微鏡を使用して、抗HRP Cy3でマークされたニューロン形態をチェックし、注射部位を決定します。</li>
		<li>注射中は、明視野顕微鏡を使用して色素液滴を確認します。胚が焦点を合わせるとき、マイクロピペットの位置を変更して、目的の軸索の先端(例えば、aCC、RP3)と穏やかに接触させる。</li>
		<li>抗HRP Cy3でマークされたニューロンを使用して、ACCまたはRP3(図3)の神経筋接合部で右腹部(A2-A6)ヘミセグメントに色素をドロップします。ハンドコントロール(マウス;図2、5)染料を離し、マイクロマニピュレータで染料を落とした後にマイクロピペットを取り外し、次の注入部位に移動する。 注:ギャップ接合を介して隣接する細胞に広がる他の染料(例えば、ルシファー黄色、カルセイン)とは異なり、親油性染料は細胞膜に関連し、近傍に移動しません。ただし、色素液滴のサイズが比較的大きいため、この手法はパートナーリング筋肉のラベリングにもなります(図3A)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>イメージングの前に、染料滴下後に1時間RTでサンプルをインキュベートします。 メモ:プロトコルは、マウントする前にここで一時停止することができ、サンプルは一晩で4 °Cに保つことができます。親油性染料は、イオントフォレーシスを用いて送達することもでき、細胞内直接結合(DC)増幅器が容易に入手可能な場合は20である。</li>
</ol>7. 共焦点顕微鏡によるイメージング
<ol><li>鉗子の助けを借りてガラススライドから両面テープとビニールテープを取り外します。</li>
	<li>四隅に少量の真空グリース(材料のテーブル)を使用してカバースリップ(22 x22 mm 2 No.1カバーガラス)を準備し、気泡を避けて慎重にサンプル上に置きます。タスクワイパーを使用して余分なPBSを削除します。</li>
	<li>カバースリップを押し下げて、対物レンズとサンプル間の作業距離を調整します。カバースリップの縁をマニキュアで完全に密封します。</li>
	<li>共焦点顕微鏡を用いた10倍及び100倍倍の倍率での画像。</li>
	<li>ImageJソフトウェアを使用して、顕微鏡から生画像を処理します(材料表)。 メモ:最適な画像を取り付けた後、10分以内に観測を開始する必要があります。それ以外の場合、RTでは、染料は、イメージングのための不要な背景を作成する注入部位に隣接する部位に広がります。染料の拡散を遅くするために、サンプルは数時間4°Cで保存することができる。</li>
</ol>

<ol><li>Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Motor axon guidance in Drosophila.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).</li>
<li>Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neuromuscular+specificity+in+Drosophila%3A+novel+mechanisms+revealed+by+new+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62(2012).</li>
<li>Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+and+organization+of+motor+neuron+dendrites+in+the+Drosophila+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva.</a> Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).</li>
<li>Manning, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+resource+for+manipulating+gene+expression+and+analyzing+cis-regulatory+modules+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS.</a> Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1347(2009).</li>
<li>Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recording+in+the+Drosophila+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recording in the Drosophila embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1348(2009).</li>
<li>Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+Patterning+in+the+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal Patterning in the Drosophila CNS.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).</li>
<li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).</li>
<li>Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarrero-Mart%C3%ADnez%2C+FA+%22The+Sticky+Synapse%3A+Cell+Adhesion+Molecules+and+Their+Role+in+Synapse+Formation+and+Maintenance%22">The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance</a>. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).</li>
<li>Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postsynaptic+filopodia+in+muscle+cells+interact+with+innervating+motoneuron+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons.</a> Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).</li>
<li>Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+induction+of+postsynaptic+molecular+assembly+by+the+cell+adhesion+molecule+Fasciclin2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2.</a> Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).</li>
<li>Kohsaka, H., Nose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+recognition+at+the+tips+of+postsynaptic+filopodia%3A+accumulation+and+function+of+Capricious%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious.</a> Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).</li>
<li>Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin%2C+location%2C+and+projections+of+the+embryonic+abdominal+motorneurons+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).</li>
<li>Kamiyama, D., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+activation+patterns+of+Cdc42+GTPase+within+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos.</a> Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).</li>
<li>Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slit+and+Robo+control+the+development+of+dendrites+in+Drosophila+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS.</a> Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).</li>
<li>Kamiyama, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+Dendritogenesis+Site+in+Drosophila+aCC+Motoneuron+by+Membrane+Enrichment+of+Pak1+through+Dscam1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1.</a> Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+embryonic+development+of+Drosophila+melanogaster%22">The embryonic development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).</li>
<li>Drosophila Ringer's solution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2007 (4), (2007).</li>
<li>Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+of+single+cells+in+the+central+nervous+system+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50150(2013).</li>
<li>Fujioka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Even-skipped%2C+acting+as+a+repressor%2C+regulates+axonal+projections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila.</a> Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).</li>
<li>Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sidestep+encodes+a+target-derived+attractant+essential+for+motor+axon+guidance+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila.</a> Cell. 105 (1), 57-67 (2001).</li>
<li>Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robo+and+Frazzled%2FDCC+mediate+dendritic+guidance+at+the+CNS+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline.</a> Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).</li>
<li>Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+a+motor+system%3A+motor+dendrites+form+a+myotopic+map+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila.</a> PLoS Biology. 1 (2), 41(2003).</li>
</ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

神経形態を研究するための色素標識の使用は、遺伝的細胞標識技術よりもいくつかの利点を有する。色素標識技術は、運動ニューロンの形態を標識およびイメージングするために必要な時間を最小限に抑えることができます。色素標識プロセスは2時間未満で、神経突起の輪郭を定義できるので非常に高速です。あるいは、aCCで酵母GAL4転写因子を発現するGAL4線を選択し、上流活性化配列(UAS)21によって制御される緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーターと交差させることにより、aCC運動ニューロンを可視化することができる。GFPラベリング技術は遺伝的クロスを必要とするため、数日余分にかかる。
色素標識のもう一つの利点は、極めて高密度で血漿膜の標識を可能にすることである。親油性染料の十分な密度は、膜のあらゆる部分に存在することができ、我々は標識された構造の細部を解決することができます。対照的に、GFP分子の密度は、多くの場合、UAS-GAL4システムが開始された後の待ち時間に依存します。たとえば、aCC は 10 時間 AEL から GFP を表現し始めます。観...

ショウジョウバチの胚性運動ニューロンシステムは、中枢神経系(CNS)1、2、3の発達の基礎となるメカニズムを分析するための強力な実験モデルを提供する。運動ニューロンシステムは、生化学的、遺伝的、イメージング、および電気生理学的技術に適しています。技術を用いて、遺伝子操作および機能解析は、単一運動ニューロン2、4、5、6のレベルで行うことができる。
神経系の初期の発達の間に, 神経芽細胞が分裂し、グリアとニューロンの多数を生成します。.神経芽細胞の剥離と遺伝子発現プロファイルとの間の時空間的関係は、以前に詳細に7、8、9で検討されている。運動ニューロン系の場合、胚神経筋接合部(NMJ)の形成は、aCC(前コーナーセル)、RP2(生エビ2)、およびRP5運動ニューロン2、10を用いて広く研究されている。例えば、RP5運動ニューロンが新生シナプス接合部を形成する場合、シナプス前およびシナプス後フィロポディアは11、12、13と混在する。このような直接的な細胞通信は、NMJ形成を開始するために不可欠である。末梢神経枝について私たちが知っていることとは対照的に、モーターデンドライトがCNS内でシナプス接続を開始する方法についての私たちの知識はまだ原始的です。
本報告では、親油性色素のマイクロピペット媒介送を用いて胚における運動ニューロンの逆行標識を可能にする技術を提示する。この技術により、産卵後15時間で30個の体壁筋肉のそれぞれを15時間でヘミセグメントにインジェインする38個の運動ニューロンをトレースすることができます(AEL)14.この技術を用いることで、当社のグループは多数の機能獲得/機能喪失アレス15、16、17を徹底的に調査しました。我々は最近、運動デンドライト接続の開始を駆動する分子機構を解明し、Dscam1-Dock-Pak相互作用がaCC運動ニューロン17における樹状突起伸の部位を定義することを実証した。一般に、この技術は、野生型または変異型株における任意の胚性運動ニューロンの表現型解析に適応可能であり、ショウジョウバエ神経系の機能設計に関する新しい洞察を提供する能力を高める。

<table><tbody><tr><td>10倍対物レンズ</td><td>ニコン</td><td></td><td>プラン</td></tr><tr><td>40倍水浸レンズ</td><td>ニコン</td><td></td><td>NIR Apo</td></tr><tr><td>毛細管</td><td>フレデリック・ヘール&Co</td><td>27-31-1</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Andor</td><td>N/A</td><td>トンボ スピニングディスク 共焦点ユニット</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>コーニング</td><td></td><td>22x22 mm スクエア #1</td></tr><tr><td>DiD</td><td>ThermoFisher</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>ThermoFisher</td><td>V22888</td><td></td></tr><tr><td>DiO</td><td>ThermoFisher</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>N/A</td><td>SMZ-U</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>スコッチ</td><td>665</td><td></td></tr><tr><td>ダウ コーニング 高真空グリース</td><td>フィッシャー Sci.</td><td>14-635-5D</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>採卵ケージ</td><td>FlyStuff</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>FemtoJet 5247</td><td>エッペンドルフ</td><td>生産終了</td><td>FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>画像処理ソフト</td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>サッター</td><td>MP-225</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットベベル</td><td>Sutter</td><td>BV-10-B</td><td></td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td>成重</td><td>PC-100</td><td></td></tr><tr><td>ニュートリフライ ブドウ寒天培地 粉末 プレミックスパケット</td><td>FlyStuff</td><td>47-102</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンネットフィルター</td><td>ミリポア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド 16% 溶液、EMグレード</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td>任意のEMグレード</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ロシュ</td><td>11666789001</td><td>sigmaaldrichで販売、箱入り 10倍溶液</td></tr><tr><td>Photo-Flo 200</td><td>コダック</td><td>146 4510</td><td>湿潤剤</td></tr><tr><td>直立蛍光顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>N/A</td><td>日食 CI LED光源付き</td></tr><tr><td>ビニール電気テープ</td><td>スコッチ</td><td>6143</td><td></td></tr><tr><td>VWR セルストレーナー</td><td>VWR</td><td>10199-659</td><td></td></tr><tr><td>酵母</td><td>FlyStuff</td><td>62-103</td><td>アクティブドライイースト (RED STAR)</td></tr></tbody></table>

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes

ショウジョウバアラにおける運動ニューロンの逆行標識の手法について説明する。油溶存親油性染料を使用し、マイクロインジェクターによる胚性フィレット製剤に小さな液滴を送出します。膜が液滴によって接触する各運動ニューロンは、その後、迅速に標識することができる。個々の運動ニューロンは連続的に標識され、細かい構造の細部を明確に視覚化することを可能にする。親油性染料は様々な色で来ることを考えると、この技術はまた、多色で標識された隣接するニューロンを得るための手段を提供する。したがって、このトレース技術は、ショウジョウバアラの運動ニューロン系における神経形態形成およびシナプス接続性を研究するのに有用である。

aCCおよびRP3運動ニューロンの代表的な画像を図3Cに示し、15時間AELにおける運動ニューロンの多色標識を示す。彼らの樹状の形態は、胚間の大部分が不変である。抗HRP抗体で得られた染色パターンを灰色で示す。DiOまたはDiDの小さな液滴をそれぞれ筋肉1または6/7のNMJに沈着させた。図4は、目的の表現型を定量的に測定する能力を示す。変異型 (例: dscam1-/-) と比較して、野生型の樹状突起チップの総数をカウントしました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60716/60716fig1a.jpg"> 図 1: 解剖プールのセットアップガラスのスライドに見える青い部屋は内部の緩衝液を保つビニー...

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレース方法について説明する。

We describe a technique for retrograde labeling of motor neurons in Drosophila. We use an oil-dissolved lipophilic dye and deliver a small droplet to an ...

このプロトコルで説明されているトレース技術は、神経形態形成を研究し、ショウジョウバエの運動ニューロン系における接続性をスナップするのに役立ちます。親油性染料は、非常に高密度の細胞膜のあらゆる部分に急速に拡散する可能性があります。このため、私たちのプロトコルは、ラベル付きニューロンの構造を見つけるために効率的に解決します。軸索末端が注射マイクロピペットでアクセス可能な場合、この技術はハエの幼虫および成体段階または他の生物の任意のニューロンに適用することができる。解剖やマイクロインジェクターを使用した経験がない場合は、試料の操作を正確に行うことは困難です。胚の解剖学を理解することは、解剖または注射を行うためのツールの適切な部分へのガイダンスに役立つ。開始するには、すべての胚収集材料を準備し、レイアウトします。50ミリリットルのチューブを切断し、キャップに穴を開けて切断して濾過装置を準備します。次に、チューブとキャップの間に100マイクロメートルの細孔を入れてメッシュフィルターをセットします。同じキャピラリーチューブから、内径1.2ミリメートルの色素注入マイクロピペットと解剖針を準備します。マイクロピペットでチューブを引っ張り、170ボルトの最大出力から7%の引き手で、長さが約0.4センチメートルのテーパーで鋭い針を作ります。染料注入マイクロピペットを調製するには、粉砕機に湿潤剤を浸し、針をマイクロピペットクランプに25~30度置きます。次に、先端をベベルサーフェスの中心から半径の3分の2に下げます。チューブを持つ注射器が空気を押し込んでいる間、針を粉砕します。マイクロピペットに細かい先端の永久マーカーを付けて、斜めで形成された狭い開口部を見つけるのが難しい場合があるため、ベベル後の先端の開口部の位置を示します。ハエが室温で一晩卵を産み、午前中に卵と一緒にパイプを集めます。胚を収集するには、5分間50%漂白剤でプレート上の卵をデクロリン化します。塩素がクリアされたら、濾過装置または細胞ストレーナーを通してプレートの内容物を注ぎ、胚を単離する。水の絞りボトルを使用してプレートに残された漂白剤を希釈し、混合物をフィルターにデカンスしてできるだけ多くの胚を集めます。漂白剤の臭いが消えるまで、胚を水で3~4回洗います。装置からフィルターを取り出し、水で別のきれいなプレートに洗います。その後、胚が置かれている新しいプレートから水をデカントします。産卵後15時間で5~10個の胚を選択し、後側を上に向けた両面テープに貼ります。脱剖プールに昆虫リンガー生理を加え、胚を乾燥から保護します。解剖顕微鏡の下でガラス針を使用して、中途半端な膜からガラスに胚を引きずり出し、胚の内部組織に損傷を与えないのに注意してください。その後、後部から前端まで表面の単一の胚の中間線を切断します。上皮組織を中央から反転させ、表皮の縁をガラススライドの表面に取り付けます。約300マイクロメートルの先端開口部を持つチューブ接続された針を使用して吸引または空気を吹き飛ばし、後部縦方向の気管幹と残りの腸を取り除きます。4%PFAとPBSを使用して、軌道シェーカーの室温で5分間胚を固定します。その後、PBSでそれらを3回洗います。シアニン3色素と共役した抗西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体1マイクロリットル、軌道シェーカーで1時間PBSの200マイクロリットルで胚を染色する。そして、PBSでのすきを繰り返します。注射マイクロピペットを充填するには、毛細管ホルダーに入れる。次に、染料スライドをステージに配置し、マイクロマニピュレータを使用してスライドの上に配置します。次に、ステージを調整して、マイクロピペットを染料の上に置きます。注入圧力を200~500ヘクトパスカル、0.1~0.5秒の射出時間、補償圧力を5分間ゼロにして、マイクロピペットに染料を回収します。染料を採取したら、色素スライドを取り出し、サンプルを顕微鏡ステージに置きます。その後、補償圧力を30〜60ヘクトパスカルの範囲に上げ、マイクロピペットをサンプルに下げます。10倍の対物レンズを使用して胚を見つけ、マイクロピペットを胚と位置合わせします。対物レンズを水浸漬40回レンズに変更します。そして、PBSにレンズを水没.蛍光顕微鏡を使用して、抗HRP Cy3によってマークされた神経形態をチェックし、注射部位を決定します。胚が焦点を合わせるとき、目的の軸索の先端と穏やかに接触するようにマイクロピペットの位置を変更する。次に、注射中に明視野顕微鏡を使用して、染料滴を見ます。diDまたはDiOのいずれかでaCCまたはRP3の神経筋接合部で右腹部のヘミセグメントに染料をドロップします。手制御を使用して染料を放出し、マイクロピペットを取り除きます。次の注射部位に移動します。イメージングの前に軌道シェーカーの室温で1時間サンプルをインキュベートします。細かい鉗子を使用して、ガラススライドからテープを取り出します。サンプルを取り付けるには、4つのコーナーに少量の真空グリースを入れてカバースリップを用意します。慎重にサンプルの上に置き、気泡を避けるようにしてください。カバースリップを押し下げて、サンプルのスペースを調整して、対物レンズとスライドの間の作業距離を調整します。タスクワイプで余分なPBSを取り除きます。カバースリップの端をマニキュアで完全に密封します。共焦点顕微鏡で10倍と100倍の倍率で画像を画像Jソフトウェアで処理し、画像を処理します。このプロトコルは、aCC運動ニューロンインナーバディング筋肉1とRP3運動ニューロンインナーバディング筋肉6と7のラベルを逆行するために使用されました。ACCおよびRP3運動ニューロンからの樹状枝は、広範な重複を示す。両方のニューロンは双極性であり、樹状突起の2つの異なる集団を確立する。この方法の定量的能力を実証するために、樹状突起先端の総数を野生型およびDscam1変異体で数えた。aCCのイプシララルデンドライトは野生型に対して示されているが、Dscam1変異体に対しては少数のイピシアラショナルデンドライトが観察された。この手順を試みる際には、約10〜20マイクロメートルの色素滴の大きさが重要であることを覚えておくことが重要です。両面テープのサイズをテストし、注射部位に適用します。この手順を用いて、DiDプローブのフォト切り替え可能な性質を利用して、プラズマ膜の超解像度画像を得ることができます。このようにして、神経筋接合部におけるシナプス膜の超構造的特徴を研究することができます。私たちはクリックをしました。変異株中のaCCデンドライトのフェロチ分析を行い、Dscam1-Dock-Pak注入がaCCにおける樹状突起の部位を定義することを発見した。

retrograde-tracing-drosophila-embryonic-motor-neurons-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、共焦点顕微鏡で蛍光染料を使用して、ライブハエの幼虫の小説インサイドアウトの組織調製物におけるグリア -...

ライブの視覚化ショウジョウバエ</em蛍光色素で>グリア - 神経筋接合部

の電気生理学的記録ショウジョウバエ胚

このプロトコルではのライブ解剖について説明...

ショウジョウバエ幼虫分節軸索内ではシナプス小胞の in vivo可視化で

このビデオは、チャネルロドプシンを発現するショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でのシナプス小胞のリサイクルを蛍光色素を使用して研究するプロトコルを示しています。青色光はチャネルロドプシンを活性化し、カルシウムの流入とシナプス小胞のエキソサイトーシスを引き起こします。この色素は神経膜に組み込まれ、エンドサイトーシス中に内在化されるため、蛍光が増強されます。さらにブルーライト刺激を受けると、エキソサイトーシスと色素の放出が誘発され、これは蛍光の減少によって示されます。...

ショウジョウバエ幼虫におけるシナプス小胞のリサイクルと蛍光色素の取り込みの解析

出典:Inal, M. A. et.al., 親油性蛍光色素を使用したショウジョウバエ胚運動ニューロンの逆行性トレース。J. Vis. Exp.

蛍光親油性色素を用いたショウジョウバエ運動ニューロンの逆行性標識

出典:Guan, W., et.al.ショウジョウバエ }}{{}}成体のキューティクルを通る脚の運動ニューロンの軸索を視覚化します。 J. Vis. Exp.(2018)...

成人ショウジョウバエ脚における蛍光標識運動ニューロンのイメージング

この研究は、後期第16段階ショウジョウバエメラノガスター胚の運動ニューロン投影を視覚化するための標準的な免疫組織化学法を詳述している。 FasII抗体で染色された固定胚のフィレット調製物は、神経発達中にモーター軸索経路探索および標的認識に必要とされる遺伝子を特徴付ける強力なツールを提供する。...

胎児運動ニューロンの軸索突起パターンの視覚化<em&gt;ショウジョウバエ</em

ここで我々 は説明の幼虫が 3...

生体内で1 分子追跡ショウジョウバエ運動神経がシナプス前ターミナルで

ここで固定、取付け、イメージング、およびイメージ作成後の手順でショウジョウバエの大人の足に蛍光タンパク質を持つ軸索ターゲットを視覚化するプロトコルについて述べる。...

大人のキューティクルをショウジョウバエ脚運動ニューロン軸索を可視化します。

初期のショウジョウバエの胚では、多くの細胞小器官は運動性である。原則として、それらは特定の蛍光プローブを介して生きたまま画像化することができるが、卵殻は胚への直接適用を妨げる。このプロトコルは、マイクロインジェクションを介してそのようなプローブを導入し、次いで粒子画像速度測定を介してバルクオルガネラ運動を分析する方法を記述している。...

ショウジョウバエ胚における脂質含有細胞小器官の細胞骨格依存性トラフィッキングの可視化

ここでは、eGFP蛍光を用いた ショウジョウバエ...

eGFPタグ付きタンパク質を用いた ショウジョウバエ 光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの研究

学ぶ 親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング法。Drosophilaのニューロン形態発生と接続性を可視化し、神経発生研究に有用な手法を解説します。

親油性蛍光色素を用いたショウジョウバエ胚性運動ニューロンの逆行トレーシング

さらに動画を探す