Name: 標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学ぶ 抗体の発現・精製と腫瘍・組織内分布のリアルタイムモニタリング法。非特異的結合を抑制し腫瘍集積性を高める治療抗体の選択に有用で、がん以外の肺疾患や心疾患への応用も可能です。

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バージニア大学がんセンターコアイメージング施設、生体分子分析施設、先端顕微鏡施設、コアビバリウム支援施設に感謝しています。J. T-Sは卵巣癌アカデミー(OCA-DoD)の初期のキャリア研究者です。この研究は、J.T-Sに対するNCI/NIH助成金(R01CA233752)、米国DoD乳がん研究プログラム(BCRP)の画期的なレベル1賞によってJ.T-S(BC17097)および米国DoD卵巣癌研究プログラム(OCRP)がJ-T-Sに授与されました。

動物の取り扱いと腫瘍異種移植片の研究に関するすべての手順は、バージニア大学の制度動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって見直され、承認され、関連する規制基準に準拠しています。
1. 抗体の発現と精製
<ol><li>CHO細胞の維持<ol>
<li>フリースタイルCHOメディアでCHO細胞を成長させます ガラスまたは使い捨てのいずれかのデロングエルレンマイヤーフラスコを使用して5%CO2 で130 rpmで揺れる37°Cで商業的に入手可能な1xグルタミンサプリメントを補います。 注:攪拌を増加させ、揺れ状態の間にガス伝達を改善するために、ベントキャップ付きのバッフルフラスコを使用することを強くお勧めします。懸濁液培養の撹拌が限定的に起きるために、抗体収量が通常のフラスコ(非バッフル)で有意に低下した。</li>
		<li>セルの生存率が 95%の 1 ~5 x 10個のセル /mL の間でセル数を維持します。セル数が 5 x 106 セル/mL を超える場合は、セルを分割します。CHO細胞が0.2 x 106 セル/mL以下に達することを決して許しません。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CHO細胞のトランスフェクション<ol>
<li>200 mL の培地 (2 x 106 細胞/mL) のデンロン エルレンマイヤー バッフルフラスコで CHO 細胞を成長させます。 注:バッフルフラスコで栽培された懸濁液培養物は、非バッフルフラスコで栽培された場合と比べた場合に比し、常に高いタンパク質収量を生み出してきました。</li>
		<li>15 mLチューブで、5 mLのCHOフリースタイル培地を取り、50 μgのVHクローンDNAと75μgのVLクローンDNAを追加します。よく混ぜる渦。</li>
		<li>室温で5分間培養します。 注:インキュベーションが長いほど、タンパク質の収量が低下します。</li>
		<li>750 μLの 1 mg/mL ポリエチレンイミン(PEI)ストックをDNA溶液に加え、30 sの混合物を積極的に渦液にします。室温で5分の追加インキュベートを行います。 注:PEIは新鮮にする必要があります。PEIの多重凍結融解サイクルは、全体的な収率を大幅に低下させます。</li>
		<li>フラスコを手動で振りながら、細胞にDNAとPEIの混合物全体を追加します。130 rpm で37 °Cの細胞を持つデロン・エルレンマイヤー・バッフルフラスコをすぐにインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>式 注:抗体は、そのN末端端に設計された分泌シグナルペプチドを有し、抗体を培地に分泌するのに役立ちます。<ol>
<li>トランスフェクトした細胞を37°Cで成長させ、1日目に130rpmで揺れる。</li>
		<li>2日目には、100x抗凝集剤2mLと100x抗菌抗コマ剤2mLを加えます。フラスコを低温(32~34°C)にシフトし、130rpmで振ります。</li>
		<li>5日ごとに、トリプトンN1フィードの10 mL、100xグルタミンサプリメントの2 mLを加えます。</li>
		<li>トリパンブルーの染色で細胞のアリコートを染色した後、ヘモサイトメーターを使用して3日ごとに細胞を数え続けます。細胞の生存率が 80% を超えないようにしてください。</li>
		<li>10日目または11日目に、抗体精製用培地を収穫する。培養液を3000 xg、4°Cで40~60分間回転させ、0.22 μMのボトルフィルターを使用してクリアメディアをフィルターします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>浄化 注:抗体精製は、ペリスタチックポンプを使用して市販のProtein-Aカラム( 材料表を参照)を使用して行われます。<ol>
<li>2カラムの結合バッファー(pH 7.4でリン酸ナトリウム20mM)でカラムを平衡化します。</li>
		<li>フィルター処理された抗体を含む培地(ステップ1.3.5で得られる)を、1 mL/minの流量でカラムに通します。</li>
		<li>2列の結合バッファーでカラムを洗います。</li>
		<li>5 mL溶出緩衝液(pH3.4で30mM酢酸ナトリウム)を用いて、抗体を500μL分に溶出させる。</li>
		<li>分画あたり10μLの中和緩衝液(pH9で3M酢酸ナトリウム)を加えて溶出した抗体のpHを中和する。 注:フラクション番号3-6は抗体の大部分を含みます。抗体が予想よりも遅い分数で溶出した場合に備えて、すべての分画を保持することをお勧めします。</li>
		<li>IgGのデフォルトプロトコルを選択して、分光光度計を用いて精製抗体の濃度を測定します。抗体の最終濃度は、分子量と吸収係数を考慮してmg/mLで得られます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 蛍光標識
注:抗体は、タンパク質に結合し、安定した共役を形成するNHSエステル反応性基を含む赤外線色素で標識されています。この反応はpH感受性であり、pH 8.5で最もよく働く。色素で標識された蛍光コンジュゲートは、最大774nmの吸収を示し、最大789nmの発光を示します。pH 8.5は有効な結合のためのキーである。
<ol><li>1 Lの共役バッファー(pH 8.5 で 50 mM リン酸バッファー)に透析カセット(0.1~0.5 mL)を用いた抗体の透析 0.5 mL。4時間後に透析カセットを新鮮なバッファーに移し、一晩透析を行う。</li>
	<li>抗体1 mg当たり0.03mgのIRDye 800CWを500μLの反応体積に加えて共役反応をセットアップします。 注意: IRDye 800CW は 10 mg/mL の濃度で DMSO に溶解されます。</li>
	<li>20°Cで2時間標識反応を行う。 注: 2 時間を超える時間を増やしても、ラベル付けは改善されません。</li>
	<li>1x PBSに対する広範な透析によって標識コンジュゲートを精製する。</li>
	<li>780nmで色素の吸光度を測定し、280nmでタンパク質の吸光度を測定することにより、標識の程度を推定する。280 nm信号への染料寄与率は3%である。</li>
	<li>次の式を使用して、色素/タンパク質比を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ01.jpg"> ここで0.03は、280nm(780 nmでの吸光度の3.0%に等しい)で使用される色素の吸光度の補正因子であり、ε色素 とεタンパク質 は、それぞれ色素とタンパク質(抗体)のモル消毒係数です。 注:ε色素は270,000 M-1 cm-1であり、εタンパク質は203,000 M-1 cm-1(典型的なIgGの場合)PBSの1:1混合物で:メタノールである。IgG以外のタンパク質は、大臼歯の絶滅係数が大きく異なる可能性があります。D/P比を正確に決定するためには、目的タンパク質に対する正しい絶滅係数の使用が不可欠です。</li>
	<li>この式を使用して、最終的なタンパク質濃度を計算します。 <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/60727/60727equ02.jpg"> 注:in vivoの研究に進む前に、ELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)またはフローサイトメトリーを使用して、標識および標識されていない抗体の抗原結合有効性を常に確認してください。</li>
</ol>3. マウス異種移植片研究
<ol><li>注射のための腫瘍細胞の調製<ol>
<li>OVCAR-3細胞をRPMI-1640培地で増殖させ、FBSおよび1xペニシリン連鎖球菌の10%を添加する。</li>
		<li>注射の前日、完全な培地/皿の10 mLと新しい100ミリメートル培養皿にサブカルチャー細胞。セル番号は 0.5-1 x 106 個のセル/皿を使用します。</li>
		<li>培養培養は37°C温度、湿度95%、CO25%で20~24時間培養します。</li>
		<li>注射の日に、培養皿から成長培地を取り除きます。Ca2+/Mg2+ フリーのDulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞層を徹底的に洗いすき、死んだ細胞、細胞の破片、およびトリプシン作用を妨げる可能性のある血清のすべての痕跡を除去します。</li>
		<li>各皿に1.0〜1.5mLのトリプシン-EDTA溶液を加えて細胞をトリプシン化し、皿を37°Cで5〜10分間インキュベーションして溶液を広げてみてください。 メモ:逆顕微鏡で細胞を観察し、実際のトリプシンの状態を確認します。トリプシン法では、培養皿の表面からの細胞剥離の数が少なく、トリプシン化が細胞ストレスを誘発する。したがって、適切なトリプシン化が重要です。</li>
		<li>トリプシン作用を停止するために各皿に完全な成長培地の1.0-1.5 mLを追加します, その後、穏やかにピペットによって細胞を再中断. 注意:穏やかなピペットは、細胞の健康を維持するために重要です。</li>
		<li>セル懸濁液を15 mL円錐形チューブに集め、室温で5分間250 x g でスピンします。</li>
		<li>上清を除去した後に細胞ペレットを回収し、1xDPBSでペレットを再懸濁して細胞を洗浄します。</li>
		<li>低速でセルサスペンションを回転させます 250 x g 5分.</li>
		<li>DPBSを500μL加え、穏やかなピペットで細胞を再中断して単一細胞懸濁液を得る。</li>
		<li>ヘモサイトメーターまたは自動細胞カウンターを使用して細胞を数えます。 注:精度を高めるには、カウントを3回繰り返し、平均値を取ります。</li>
		<li>最終的なセル密度が 1 x 108 セル/mL になるように、このような方法でボリュームを調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウス異種移植片を発症する細胞の皮下注射 注: すべての手順は BSL2 安全キャビネットで行う必要があります。アティミックヌード Foxn1nu/Foxn1+ マウスは、現在の研究で使用されています。<ol>
<li>細胞懸濁液50μLを1.5mLチューブに取り込み、50μLの基質膜マトリックス媒体と混合します。 注:基体膜マトリックス媒体は、室温でゲル状の状態を形成する傾向があるため、細胞とマトリックス培地混合物を氷上に慎重に維持してください。チューブ、チップ、注射器を冷蔵庫に保管し、動物の注射前に氷の上で移動することをお勧めします。</li>
		<li>任意の細胞の凝集を避けるために混合物を攪拌.次に、この100μLの細胞懸濁液-マトリックス培地混合物を5 x106 細胞を含む混合物を1ccシリンジに取り込みます。</li>
		<li>動物の皮膚をそっと持ち上げて、下層の筋肉層から皮膚を分離し、26G針で皮膚の下(5 x 106 細胞)の下に細胞懸濁液(100μL)をゆっくりと注入する。ニードルを取り出す前に数秒待って、地下マトリックス培地が皮膚下の細胞と一緒に半固体ゲルのような構造を形成できるように、注射部位から混合物が出てくるのを防ぐ。 注:細胞は、免疫不全マウスに害を及ぼす可能性のある汚染について、注射前に検査する必要があります。注射中に、これは予想よりも深く腫瘍を形成する可能性があるため、皮膚に深く針を入れないでください。</li>
		<li>動物を滅菌ケージに入れておき、約20分間観察してください。</li>
		<li>マウスを2〜3週間観察し、腫瘍を500mm3サイズまで成長させる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 生体内イメージングシステムを用いた抗体の局在化
注:この実験で使用されるin vivoイメージング装置( 材料表を参照)は、生体内の細胞および遺伝子活性を非侵襲的に可視化し追跡するための高効率フィルタとスペクトル非混合アルゴリズムをリアルタイムで使用しています。システムは、蛍光と生物発光の両方のモニタリング機能を提供します。
<ol><li>尾静脈を介して25μgの色素標識抗体を注入する。<ol>
<li>2%イオブルランを用いて腫瘍を担うマウスを麻酔する。ペダル反射に対する応答の欠如を確認してください。</li>
		<li>マウスが動かなくなったら、ワーム水を加えて横方向の尾静脈を拡張する。</li>
		<li>26G針で1ccインスリン注射器を使用して標識抗体の25 μg(100 μL)を注入します。</li>
		<li>同様に、陰性対照として、癌細胞を標的としない非特異的IgG1アイソタイプ抗体を標識して注入する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>8,24,48時間等の抗体注射後の生体内ライブイメージングを行う。<ol>
<li>関連するソフトウェアで、コントロールパネルの 「初期化」 をクリックし、ステージ温度が37°Cであることを確認します。</li>
		<li>酸素供給、麻酔システム上のすべてのポンプ、麻酔室へのイソフルランガス供給をオンにし、イソフルラン気化器バルブを2%に設定します。</li>
		<li>マウスを麻酔室に移し、マウスが完全に麻酔されるまで待ちます。目の潤滑軟膏を塗布して、眼の乾燥を避けてください。</li>
		<li>コントロールパネルに移動し、イメージングウィザードオプションを使用して蛍光イメージングを設定し、773 nmの励起と792 nmの放出を選択します。 注: デフォルトの自動露出設定は、優れた蛍光画像を提供します。ただし、自動露出の設定は、ニーズに従って変更できます。</li>
		<li>麻酔したマウスをイメージングチャンバーに移し、ノーズコーンを使用してイメージングフィールドに組み立てます。イメージング段階では、一度に5匹のマウスを収容できます。 注: テストマウスと一緒にコントロールマウスを画像化して、分析中に同様の露出やその他の設定を行います。</li>
		<li>すべてが準備できたら、コントロールパネルの[ 取得 ]オプションを選択して、画像を取得します。</li>
		<li>自動露出設定では、1 分以内にイメージが生成されます。生成された画像は、光蛍光強度がカウントまたは光子の単位で表示された写真画像上の蛍光のオーバーレイ、または効率の点で表されます。</li>
		<li>画像を取得した後、マウスを画像チャンバーからケージに戻し、1〜2分間回復するのを観察します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>画像解析用のソフトウェア内で提供されるツールや機能を使用して、画像をさらに微調整します。イメージ解析ツールは、メニュー バーとツール パレットにあります。<ol>
<li>[ イメージ調整] で、明るさ、コントラスト、不透明度を調整し、カラー スケールを選択します。</li>
		<li>ROI ツールを使用して、光学画像内の対象領域(ROI)を指定し、ROI 内の信号強度を測定します。必要に応じて、定量化された信号データをスプレッドシートソフトウェアにエクスポートし、データをプロットします。</li>
		<li>フォローアップ研究では、様々な組織(例えば、肝臓、肺、心臓、腎臓、脾臓、脳など)のマウスの壊死を分析し、蛍光標識抗体の詳細な非特異的分布を解析する。 注:データは、96ウェルアッセイで抗原(この場合はFOLR1)を使用することにより、組織特異的ELISAでさらにサポートすることができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は競合する財政的利益を持っていません。

抗癌治療薬の選択的および腫瘍組織特異的送達は、所定の標的治療13の有効性および安全性を測定する鍵である。ここでは、臨床、ファレツズマブおよび非臨床BaCa抗体の詳細な組織および腫瘍分布を調査するための迅速かつ効率的なアプローチについて述べた。記載されたアプローチは、新たに生成された抗体に適用可能であり、腫瘍/臓器の分布特性に臨床的に有効な抗体(所望の資質を有する)と共に使用することができる。ほとんどの抗体標的受容体(乳癌におけるHER2など)が腫瘍細胞(組織)において高過剰発現していることを考えると、その最も最適でない発現および機能は、腫瘍細胞14以外の細胞タイプにおいても重要である。例えば、大腸癌患者における臨床抗体を標的とするEGFRのかなりの割合は、皮膚組織15に対する毒性を蓄積し、生じる、成長および分化がEGFRシグナル伝達および機能を必要とする非癌性組織である。したがって、より大きな動物のコホートにおける肝毒性および組織組織化学アッセイと組み合わせた予備的組織分布調査は、新たに生成され...

FDAはCD3を標的とする最初のモノクローナル抗体を承認しました (OKT3, ムロモナブ)1,2.それ以来、次の20年間、免疫チェックポイント阻害剤3に対する抗体の圧倒的な成功により、抗体工学の分野で急速な爆発が起こった。免疫系の間接的な活性化に加えて、抗体は、免疫エフェクター細胞を正確に関与させるために癌細胞に直接フラグを付け、死の受容体アゴニストを介して細胞毒性を引き起こし、腫瘍細胞生存シグナル伝達をブロックし、血管新生(血管の成長)を妨害し、免疫チェックポイント調節因子を制約し、放射性同位体、化学療法薬およびsiRNAを共役剤として送達することを目的としている。また、患者由来T細胞やNK細胞(CAR-TおよびCAR-NK)の表面上の様々な抗体の単鎖可変フラグメント(scFv)を研究することは、細胞ベース療法のための臨床研究の急速な成長領域である4。
抗原発現腫瘍細胞への選択性を提供する抗体系薬物の超高親和性は、それを魅力的な薬剤にする。同様に、治療用抗体(または化学薬品)の標的送達および腫瘍保持は、毒性に対する有効性のバランスをとるための鍵である。したがって、二重特異性5および三特異的抗体6を含むがこれらに限定されない多数のタンパク質工学ベースの戦略が、静脈内に(IV)注入された治療薬のアビディティ最適化腫瘍保持を有意に増強するために利用されている。ここでは、潜在的に有効な抗癌抗体の腫瘍および組織分布に対処するための単純な蛍光ベースの方法について述べた。
動物組織は可視スペクトルで励起されると自己蛍光を有するため、抗体は当初、近赤外色素(例えばIRDye 800CW)で標識された。概念実証調査では、フォールレスツズマブと呼ばれる抗体を標的とする葉酸受容体α-1(FOLR1)とその誘導体である二重特異性アンカー細胞毒性活性化剤(BaCa)7抗体を1つの組換え抗体にCOR1および死受容体-5(DR5)8を共同標的とする抗体を用いた。FOLR1は、卵巣およびTNBC癌細胞、腫瘍異種移植片および患者腫瘍9において明確に定義された過剰発現標的受容体である。特に、抗体ベースのアプローチを用いてFOLR1を臨床的に利用して、卵巣癌および乳癌に対する免疫エフェクター細胞および抗体薬物コンジュゲート(ADC)を関与させる複数の取り組みがある。
本方法論文では、CHO発現系を用いた他の対照抗体とともに、臨床抗FOLR1(farletuzumab)をクローニング、発現、精製した。IgG1アイソタイプおよびアバゴボマブ12 と呼ばれる臨床抗イディオタイプムチン-16抗体を陰性対照として使用した。タンパク質A精製後、示された抗体はIRDye 800CWで標識され、卵巣腫瘍異種移植片または安定してトランスフェクトされたヒトFOLR1を発現するヒトFOLR1マウス大腸癌異種移植片のいずれかを有するヌードマウスの尾静脈に投与された。抗体の局在化は、複数の異なる時点点7でin vivoイメージングスペクトルを用いたライブイメージングによって追跡した。この方法は、発光を可能にするために基質の遺伝子組み換えまたは注入を必要とせず、大幅に迅速かつ費用対効果が高く、効率的である。以下に記載の一般的なクローニング、発現、精製および標識プロトコルは、重鎖および軽鎖配列が利用可能な場合、任意の臨床および非臨床抗体に適用することができる。

<table><tbody><tr><td>FreeStyle CHO media</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 12651-014</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Clumping Agent</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 01-0057DG</td><td></td></tr><tr><td>BD Insulin Syringe</td><td>BD BioSciences</td><td>Cat #329420</td><td></td></tr><tr><td>Caliper IVIS Spectrum</td><td>PerkinElmer</td><td>Cat#124262</td><td></td></tr><tr><td>CHO CD EfficientFeed B</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat #A10240-01</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Corning</td><td>Cat # 10-13-CV</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500 mL RPMI 1640</td><td>Corning Cat</td><td># 10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>Cat # 709-175-149</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax-I (100X)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 35050-061</td><td></td></tr><tr><td>HiPure Plasmid Maxiprep kit</td><td>Invitrogen</td><td>Cat # K21007</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap MabSelect SuRe Column</td><td>GE Healthcare</td><td>Cat # 11-0034-93</td><td></td></tr><tr><td>Infusion</td><td>Takara BioScience</td><td>STO344</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW NHS Ester</td><td>LI-COR</td><td>Cat # 929-70020</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン、USP</td><td>Covetrus</td><td>Cat # 11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>潤滑剤 眼軟膏</td><td>リフレッシュ Lacri-Lube</td><td>猫 #4089</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>猫 #354234</td><td></td></tr><tr><td>PEI トランスフェクション試薬</td><td>Thermo Fisher</td><td>猫 # BMS1003A</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析カセット</td><td>Thermo Scientific</td><td>猫 #66333</td><td></td></tr><tr><td>ステリトップ真空フィルター</td><td>Millipore Express</td><td>Cat #S2GPT02RE</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>Cat # 15400-054</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experimental Models: Cell lines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human: OVCAR-3</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC HTB-161</td><td></td></tr><tr><td>Human: CHO-K cells</td><td>Stable私たちの研究室で変換</td>されました <td>ATCC CCL-61</td><td></td></tr><tr><td>マウス:4T1</td><td>チップ・ランデン博士からの親切な贈り物、UVA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス:MC38</td><td>UMBCのスザンヌ・オストランド・ローゼンバーグ博士からの親切な贈り物</td><td>STRプロファイリング</td><td></td>によって認証</tr><tr><td>されました マウス:MC38 hFOLR1</td><td>私たちの研究室で生成されました(この論文)</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>実験モデル:Animal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+</td><td>Envigo</td><td>Multiple Orders</td><td></td></tr><tr><td>マウス: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>Jackson Laboratory</td><td>Multiple Orders</td><td></td></tr></tbody></table>

標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

モノクローナル抗体は、がん細胞を排除する可変独立的な機構によって働く高親和性多機能薬である。過去数十年にわたり、抗体薬物コンジュゲート、二重特異性抗体、キメラ抗原受容体(CAR)および癌免疫療法の分野は、基礎および治療学的調査の最も有望な分野として浮上してきました。白血病と黒色腫の免疫チェックポイント受容体とCAR-T細胞を画期的なペースで標的とした数多くの成功したヒト試験により、抗体工学のバリエーションに由来する腫瘍学的治療のための非常にエキサイティングな時間です。残念ながら、腫瘍床における免疫エフェクター細胞の利用が限られているため、抗体およびCARベースの治療の有意に多数のヒト試験においても失望することが証明されている。重要なことに、腫瘍以外の組織における治療抗体の非特異的分布は、臨床的有効性の欠如、関連する毒性および臨床的障害にも寄与する。ヒト臨床トレイルへの前臨床試験の忠実な翻訳は、マウス腫瘍異種移植片の有効性および安全性研究に大きく依存しているので、ここでは、治療抗体の腫瘍および一般的な組織分布を試験する方法を強調する。これは、タンパク質A精製抗体を近赤外蛍光色素で標識し、続いて腫瘍を有するマウスのライブイメージングを行うことによって達成される。

記載された方法論では、まず、葉酸受容体α-1(FOLR1)を標的とする抗体を、ファレツズマブとレカツマブと共にファレツズマブおよびレカツマブからなるBaCaと呼ばれる二重特異性抗体と、アバゴボマブなどの対照抗体と共にクローニングした( 補助ファイル1に提供される配列)。DNAクローン中の代表的な可変重(VH)ドメインおよび可変光(VL)ドメイン(pVH,pVL)の詳細を 図1Aに示す。陽性クローンを確認するために、シグナルペプチドフォワード(SP For)およびCK Rev/CH3 Revプライマー( 補助ファイル1に提供される配列)を用いてコロニーPCRを実施した。コロニーPCRの代表的な結果は、軽鎖および重鎖の予想サイズを確認する(図1C)。陽性抗体クローンは、また、サンガーシーケンシングを用いて確認した。確認されたpVHおよびpVL DNAクローニングに続いて、CHO懸濁培養物を用いてトランスフェクションを行い、続いて4°Cでの抗体のタンパク質A...

ここでは、マウス腫瘍異種移植片モデルにおける抗体のin vivo局在化を研究するプロトコルを提示する。

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

このプロトコルは、腫瘍および組織における抗体分布の発現と精製および抗体分布のリアルタイムモニタリングを実証する。記載されたプロトコルを用いた抗体のスクリーニングは、限定的な非特異的組織分布を有する抗体の選択を助け、腫瘍の局在を豊かにする。記載された技術は、迅速かつ費用対効果が高い。単光子放射コンピュータ断層撮影や陽電子放出断層撮影などの他の技術は非常に高価であり、放射性および他の洗練されたトレーサーを必要とする。この技術は、がん標的抗体に限定されない。これは、体内の抗体分布の分析のために、肺や心臓病などの他の疾患に適用することができます。手順を実証すると、私の大学の獣医技術者ジェレミー・ゲイツマンになります。200ミリリットルのメディアの生のCHO細胞は、デロンで、エルレンマイヤーバッフルフラスコ。CHOフリースタイル培地5ミリリットルと可変重クローンDNA50マイクログラム、15ミリリットルチューブ内の可変光クローンDNA75マイクログラムを組み合わせます。次いで、チューブを渦に入れ。混合物を室温で5分間放置します。1ミリリットルの750マイクロリットルを1ミリリットルのポリエチレンアミンストックをDNA溶液に加え、30秒間積極的に渦液化します。さらに5分間室温で混合物を残します。フラスコを手動で振りながら、CHOセルに全体の混合物を追加します。130 RPMで振りながら、すぐに37°Cで細胞をインキュベートします。翌日、100X抗凝集剤を2ミリリットル、100X抗菌抗菌性抗菌溶液を2ミリリットルを細胞に加えます。フラスコを摂氏32~34度でインキュベートし、130RPMで揺れ動かします。10〜11日間細胞を培養し続け、トリプトンN1飼料10ミリリットル、5日ごとに100 Xグルタミンサプリメント2ミリリットルを加えます。細胞の生存率が10日または11日に80%を超えることを確実にするために、3日ごとに細胞を数え、培養物を3000倍Gで遠心し、40〜60分間摂氏4度で抗体精製用培地を収穫する。次に、0.22マイクロメートルのボトルフィルターで透明な媒体を濾過します。抗体を精製するために、結合バッファーの2列体積でプロテインAカラムを平衡化する。1 分間に 1 ミリリットルの流量で、フィルターされたメディアをカラムに通します。次に、2段の結合バッファーでカラムを洗います。溶出バッファーの 5 ミリリットルを使用して、抗体を 500 マイクロリットル分数に溶出させます。そして、分画のために中和バッファーの10マイクロリットルを添加することによって、ほのめかされた抗体のpHを中和する。IgGのデフォルトプロトコルを使用して、分光光度計で精製された抗体の濃度を測定します。1リットルの共役バッファーに透析カセットを用いた抗体の透析0.5ミリリットル。4時間後、透析カセットを新鮮なバッファーに移し、一晩透析します。共役反応を設定するには、抗体の1ミリグラムあたり0.03マイクログラムのIRR色素800 CWUを合計容量500マイクロリットルで添加します。混合物を摂氏20度で2時間インキュベートし、PBSに対する広範な透析によって標識コンジュゲートを精製する。色素780ナノメートルの吸光度を測定し、タンパク質の吸光度を280ナノメートルで測定して標識の程度を推定する。マウスの異種を開発するには、動物の皮膚をそっと持ち上げ、下層の筋肉層から分離します。26ゲージ針で皮膚の下に100マイクロリットルの細胞懸濁液をゆっくりと注入する。ニードルを取り出す前に数秒待って、地下マトリックス培地が皮膚下の細胞と一緒に半固体ゲル状の構造を知らせ、注射部位から混合物が出てくるのを防ぎます。インビボイメージングを行うために、尾静脈を介して色素標識抗体を注入する。マウスを麻酔した後、ペダル反射に対する応答の欠如を確認し、温水を適用して静脈を拡張します。26ゲージ針の1ccインスリン注射器を使用して、100マイクロリットルの体積で標識抗体の25マイクログラムを注入する。陰性対照として、癌細胞を標的としない非特異的IgGアイソタイプ抗体を標識して注入する。インビボイメージングを行う 8、24、48 抗体注射後。イメージング ソフトウェアで、[初期化] をクリックします。ステージ温度が摂氏37度であることを確認します。コントロールパネルで、イメージングウィザードを使用して蛍光イメージングを設定し、励起を773ナノメートルに設定し、放出を792ナノメートルに設定します。麻酔マウスを撮像室に移します。ノーズコーンを使用してイメージングフィールドに配置します。準備ができたら、イメージ取得用のコントロールパネルの取得をクリックし、[自動公開]をクリックします。生成された画像は、光蛍光と濃度がカウントまたは光子の単位で表示された写真画像上の蛍光のオーバーレイです。可変重および可変光ドメインを有する陽性cDNAクローンはコロニーPCRで確認された。非還元および還元SDSページでの精製されたファルレツズマブランの代表的な結果をここに示す。重鎖および軽鎖は、還元後に50キロと25キロダルトンバンドを生産した。細胞表面における天然タンパク質に対する抗体の結合も確認された。蛍光標識抗体は、尾静脈を注射し、腫瘍を発現する完全なR1で移植されたマウスに注射した。動物は、IVISを使用して複数の時点で生きた画像であった。このデータは、腫瘍に完全なR1およびBaCa抗体の選択的濃縮を打ち明ける。このプロトコルを試みるとき、CHO細胞の維持は抗体の収量にとって重要であることを覚えておいてください。そして、競合性腫瘍局在化のために同様の程度の蛍光色素結合を有することが重要である。この手順に従って、組織免疫組織化学や組織または腫瘍特異的ELISAなどの他の方法を、生きたマウスのイメージングデータを支持するように行うことができる。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

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ルシフェラーゼ形質導入ヒトT細胞を用いた二重特異性抗体誘導性T細胞輸送の追跡(英語)

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標的抗原特異的治療抗体の腫瘍と組織分布の分析

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