ホワイトフライ組織におけるベゴモウイルスの免疫蛍光および定量PCRによる局在化と定量化
2020年2月8日
昆虫組織におけるベゴモウイルスの局在化および定量化のための免疫蛍光法および定量PCR法について述べている。免疫蛍光プロトコルは、ウイルスタンパク質とベクタータンパク質を共局化するために使用することができる。定量PCRプロトコルを拡張して、ホワイトフライ体全体やウイルス感染植物のウイルスを定量化することができます。
白飛球のウイルスの空間性と量を明らかにすることは、ベゴモウイルスと白飛の相互作用を理解し、重篤なベゴモウイルス疾患を制御するための新しい戦略の開発に役立ちます。この技術の利点は、ホワイトフライ組織を迅速に分離し、ウイルスおよびホワイトフライタンパク質を共にローカライズし、ホワイトフライ全身およびウイルス感染植物のウイルスを定量化できることです。適切な実験時点で、ウイルス取得後、氷を麻酔した雌の白身エを顕微鏡スライド上のPBSの滴に入れ、細かい鍼針を使用して、ステレオ顕微鏡下で白ホフライの腹部を開く。
注射針を使用して中腸を抽出し、中腸をPBSのコレクション皿に入れます。PSGを収集するには、頭の近くの後側から胸郭で体を分割し、胸郭を通して針でホワイトフライを固定します。2つの唾液腺が体から分離されるまでホワイトフライを振り、PBSの新しい皿に腺を移すために2番目の針を使用してください。
卵巣を採取するには、腹部を完全に開き、針を使って卵巣を他の組織から分離する。余分な組織を除去し、PBSの新しい皿に卵巣を移すためにピペットを使用してください。溶水サンプルを採取するには、10マイクロリットルのPBSを新しい顕微鏡スライドに加え、新しいホワイトフライを液滴に入れる。
細かい鍼針を使って腹部に穴を開けます。その後、腹部にわずかな圧力を加え、ヘモリンパを緩衝液に放出し、液体の8マイクロリットルのサンプルを採取する。収穫されたホワイトフライPSG、ミドグ、または卵巣組織におけるTYLCV局在化を可視化するには、15〜20個の標本をガラス3.5センチメートルのペトリ皿に移し、余分な緩衝液を吸引する。
1回の洗浄ごとに新鮮な結核の1ミリリットルでサンプルを2分間2分間慎重に洗浄する前に、室温で2時間4%パラホルムアルデヒドの1ミリリットルで組織を固定します。最後の洗浄後、1回の洗浄につき1ミリリットルのTBSTで実証したように、3回洗浄する前に30分間0.5%トリトンX-100の1ミリリットルでサンプルを透過させます。最後の洗浄後、1%ウシ血清アルブミンの1ミリリットルを室温で2時間、続いてTBSTで3回の洗浄を行い、非特異的結合をブロックします。
最後の洗浄後、細胞に一次抗体を一晩で光から保護した摂氏4度で標識します。翌朝、サンプルをTBSTで3回洗浄してから、適切な二次抗体を光から保護された室温で2時間添加します。インキュベーションの終わりに、中腸を3回洗い、標本をきれいな顕微鏡スライドに移します。
できるだけ多くのバッファーを取り出し、カバースリップで取り付け、共焦点顕微鏡で標識された組織を調べる前に、DAPIの1滴で核を染色します。TYLCV定量の場合、採取したホワイトフライ組織サンプルを新鮮なPBSで2〜3回洗浄し、25マイクロリットルの溶解溶液を含む個々のPCRチューブにPBSの5マイクロリットルで20ミドグ、20 PSG、または1つの卵巣を移します。各チューブに直径2ミリメートルのセラミックビーズを5~7個加え、ホモジナイザーでサンプルを粉砕します。
新しいPCRチューブに8マイクロリットルのヘモリンパサンプルを1つ加え、10マイクロリットルのライシスをチューブに完全に混合します。すべてのサンプルを摂氏65度で1時間インキュベートし、続いて摂氏100度で10分間のインキュベーションを行い、短い遠心分離を行います。次に、定量PCRストリップチューブのバイアルに18マイクロリットルのマスターミックスを加え、各DNAサンプルの2マイクロリットルを少なくとも3つのバイアルに加えます。
すべてのサンプルがロードされたら、チューブと遠心分離機を閉じて、各バイアルの底部に溶液を沈めます。バイアルを定量PCR用のリアルタイムサーマルサイクラーにロードし、フッ素色素としてサイバーを選択し、サンプルタイプとして不明です。次に、定量データをスプレッドシートにエクスポートして、各サンプル内のウイルスDNAの相対量を分析します。
ここでは、ホワイトフライPSG、中腸、卵巣におけるDAPI染色におけるTYLCVの代表的な画像が示されている。観察されるように、TVLCVは卵巣よりもPSGおよび中腸内でより大きな蓄積を示す。TYLCV感染トマトを24時間、48時間、72時間食べた後のホワイトフライPSG、中腸、ヘモリンフ、卵巣におけるウイルスの定量化は、取得アクセス期間の増加と直接相関して異なる白飛組織のウイルス量が増加することを示している。
死んだ昆虫は解剖の難しさを増すので、新鮮なホタルを使用するのが最善です。この手順に従って、他の分析は、ウェスタンブロッティングおよび共免疫沈降法のような、ウイルスタンパク質発現およびウイルスおよびベクタータンパク質相互作用に関する追加の質問に答えるために行うことができる。
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概要
この記事では、白いアリの媒介体におけるベゴモウイルスの局在化と定量化の方法について、免疫蛍光法と定量PCRを用いて説明しています。これらのウイルスの空間性と数量を理解することで、ベゴモウイルス性疾患の防除戦略の開発に役立ちます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- ウイルス学
- 昆虫学
- 分子生物学
背景
- ベゴモウイルスは植物に影響を与える重要な病原体です。
- アザミウマはこれらのウイルスの媒介体として機能します。
- ウイルスと媒介体との相互作用を理解することは、病害管理にとって重要です。
- これらの相互作用を研究するための現在の方法は限られています。
研究の目的
- アザミウマ組織におけるベゴモウイルスの分離と定量化の技術を開発すること。
- ウイルスと媒介体のタンパク質を共局在させること。
- 定量化の方法をアザミウマ全体とウイルス感染植物に拡張すること。
使用した方法
- タンパク質局在化のための免疫蛍光法。
- ウイルス定量のための定量PCR。
- 細い鍼を用いたアザミウマ組織の分離。
- 抽出された組織の顕微鏡観察。
主要な結果
- アザミウマ組織におけるベゴモウイルスの成功的な局在化。
- アザミウマ全体におけるウイルスの定量化。
- ウイルスとアザミウマのタンパク質の共局在の達成。
- この方法はウイルス感染植物にも適用可能。
結論
- 開発された方法は、ベゴモウイルスとアザミウマの相互作用についての理解を深めます。
- これらの技術は、ベゴモウイルス性疾患の防除戦略に情報を提供することができます。
- 将来の研究では、これらの方法を基に、より広範な応用に発展させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding virus-vector interactions is critical for developing targeted interventions against plant pathogens that threaten global crop yields. This method enables precise spatial and quantitative analysis of begomoviruses in whitefly tissues, supporting mechanistic de-risking in early-stage antiviral or vector control target validation. By providing reproducible localization and quantification data, it enhances predictive confidence in target selection and pathway interrogation for agrochemical or biologics discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of viral tissue tropism and vector protein interactions to clarify mechanistic hypotheses.
- Operational Value: Provides standardized tissue dissection and labeling workflows for consistent target engagement assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative viral load data across tissues to support assay readout standardization and reproducibility.
- Operational Value: Establishes a scalable sample preparation pipeline for high-throughput screening of antiviral compounds or vector-targeting agents.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling correlation of viral accumulation with transmission potential.
- Operational Value: Facilitates cross-functional alignment between virology, entomology, and molecular biology teams through standardized outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization by providing tissue-specific viral quantification and co-localization data that inform target selection and mechanism of action studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of viral protein function and vector interaction pathways through direct tissue localization.
- Screening: Enables assay readiness by providing quantified viral DNA inputs for compound efficacy screening in vector-based models.
- Analytics: Delivers quantitative PCR readouts that allow statistical comparison of viral burden across experimental conditions and time points.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical relevance by enabling viral load correlation with transmission efficiency in whitefly populations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable tissue processing and detection platform applicable to multiple virus-vector systems beyond begomoviruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virus-vector interaction models through direct tissue-level visualization and quantification.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized tissue isolation, fixation, and detection protocols across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in target validation by providing quantitative thresholds for viral accumulation in key tissues.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of antiviral or vector control strategies based on tissue-specific viral dynamics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, immunofluorescence microscopy, and qPCR assay design.
- Dependent on access to confocal microscopes, thermal cyclers, and tissue homogenization equipment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue collection timing and fixation procedures.
- Adaptation to other vector systems may require optimization of antibody penetration and tissue permeability steps.
- Practical limitations include tissue degradation risk with delayed processing and variability in whitefly infection efficiency.
