Name: 微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶ微小トリプシン法による乳腺オルガノイド生成法。マウス乳腺から筋上皮細胞と管腔上皮細胞を分離し、3D培養で個々の細胞系統の役割を研究する効率的な手法を習得できます。

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カリフォルニア大学サンタクルス校(UCSC)幹細胞生物学研究所(IBSC)の技術支援とコアサポートに対して、ベン・エイブラムスに感謝します。私たちは、彼らのソラミアスピニングディスク共焦点顕微鏡の使用のためにスーザン・ストロームとビル・サクストンに感謝します。この研究は、ハワード・ヒューズ医学研究所からジェームズ・H・ギリアム・フェローシップ・フォー・アドバンスト・スタディ(S.R.)、NIH(NIH GM058903)から学生育成(H.M.)を最大化するためのイニシアチブの奨学金によって支えられた。大学院研究フェローシップ(O.C.DGE 1339067)とUCがん研究調整委員会(LH)からの助成金(A18-0370)による国立科学財団。

ここに記載されているすべての方法は、カリフォルニア大学サンタクルーズ校の施設動物のケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 1日目:乳腺消化
<ol><li>成熟した雌マウスからMGを10〜14週齢で収穫する準備をする。<ol>
<li>無菌条件下で開いたベンチで収穫を行います。</li>
		<li>手術前に20分間70%アルコールをオートクレーブして浸漬して、すべての外科用品、コルクボード、ピンを殺菌します。</li>
		<li>0.5 mLインスリン注射器で腹腔内注射を介して送達されるペントバルビタールナトリウム(2X麻酔用量0.06 mg/g体重)で動物を麻酔する。</li>
		<li>動物のつまみをつまんで反射反応を確認し、動物が完全に麻酔を受けた後にのみプロトコルを開始することによって麻酔のレベルを監視します。</li>
		<li>動物を背中に置き、付属物をコルクボードに固定し、腹部と胸部をエタノールで拭き取ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>#2、3、4、および5つのMGを1匹のマウス(すなわち、8つのMGs、図1A)から収穫するために、2つの後ろ足の間の中線を識別し、鋭いはさみで腹部の皮膚に小さな切開(1cm)を作り、次に、切り傷を首18まで伸ばす。</li>
	<li>綿棒を使用して皮膚の放出を可能にするために、脚と腕に向かって横方向に小さなカットを行うことによって従ってください。片側に固定する前に、皮膚を引き離してしっかりと伸ばします(図1B、ステップ1)18。18それらの下に切断することによって、MGsを取り除き、#4腺からリンパ節を取り除く(図1B、ステップ2、3)18。18体の反対側で手順を繰り返します。</li>
	<li>MG組織を4 °Cダルベックの修正イーグル培地(DMEM)/栄養混合物F12(F12)5%ウシ胎児血清(FBS)および1X抗生物質抗抗抗抗抗抗菌(抗抗抗)18で50 mLで収集します。</li>
	<li>35mm皿またはカミソリの刃またはティッシュチョッパーを使用してセラミックプレートで腺をみじん切りにします。ティッシュピースが1 mLのマイクロピペットチップを通して簡単に収まるまで、5つの手動チョップまたはティッシュチョッパーのすべてのラウンドごとにプレートを回転させます(〜0.1 mm/断片、図1C)。</li>
	<li>消化媒体でMGを消化する (表1を参照) 37 °Cで6十分に低い接着皿で 14 時間, 5% CO2.</li>
</ol>2. 2日目:乳腺上皮組織断片の分離
<ol><li>14時間の消化後、1mLのマイクロピペットを用いて消化組織10Xをピペット化して、残りのストロマまたは脂肪組織を分解して穏やかに混合し、気泡も過剰な機械的力も生成されないようにする。 注:14時間後に不完全な消化がある場合、これはシアDNAの蓄積に起因する可能性があります。この場合、消化培地の2mLあたり1mg/mLデオキシリボヌクレアスI(DNase I)の1 μLを加えます。37°C、5%CO2で30分間インキュベートする2。</li>
	<li>15 mLチューブに組織を収集し、Ca2+およびMg2+を含まない組織培養グレード1Xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩分(DPBS)の2〜3 mLで消化に使用されるをよくすすいだ。600 x gで 10 分間の遠心分離機。</li>
	<li>脂質層と培地を含む上清を退出し、ペレットをDPBSの5mLに再懸濁し、新しい15mLチューブに切り替えます。600 x gで 10 分間の遠心分離機。</li>
	<li>遠心分離の間に50 mLの管の70 μmナイロン細胞のストレーナーを置き、37 °C DMEM/F12の10 mLを使用してストレーナーを前湿にする。</li>
	<li>5 mLのDPBSを用いてプロトコルステップ2.4から組織断片を再懸濁し、プレウェット70μmナイロン細胞ストレーナーを介して懸濁液を通過して、間質細胞および単一細胞を除去する(図1D)。</li>
	<li>細胞のストレーナーの組織の断片を集める。37 °C DMEM/F12の10 mLで4Xをすすいする(図1D)。 注意: 不完全なすすは、非上皮細胞で汚染された培養物をもたらす。</li>
	<li>ストレーナータブを手袋をした指で保持し、60mm組織培養皿の上にストレーナーを反転させ、メンテナンス培地の1mLアリコートを通過させることで組織断片を放出する(図1Figure 1E)。</li>
	<li>肉眼で見える組織断片残骸がないかストレーナーをチェックし、いずれかの断片がまだストレーナーに付着している場合は、メンテナンスミディアムの1 mLでさらにストレーナー1倍をすすいでください。すすがった組織断片は、今では間質細胞を含まないはずです。</li>
	<li>逆顕微鏡下でプロトコルステップ2.9からMG断片を含む60mm皿を素早く調べる(4Xまたは10X目的、図1F)。8つのMGの典型的な調製物は500個の断片を生み出す。単一細胞または脂肪滴と汚染細胞があるかどうかを探します。 注:汚染細胞がある場合は、5 mLピペットを使用して60mm皿から培地と断片を収集し、新しい70 μmストレーナーを通して再び断片をフィルタリングし、プロトコルステップ2.6、2.8-2.10を繰り返して濾過ステップを繰り返します。</li>
	<li>37°Cで24時間、5%CO2でイン2キュベートし、組織断片が付着し、二重化断片を生成することを可能にする(図2A)。 注:断片が24時間までに落ち着いていない場合は、付着するまでインキュベートを続けてください。フラグメントがうまく付着しないと、細胞コンパートメントの分離が機能しません。研究者が接着を懸念している場合、組織培養プレートは断片の付着(例えば、ポリL-リジン)を促進するために処理することができる。</li>
</ol>3. 3日目:筋上皮細胞とルミナル上皮細胞の微分トリプシン化
<ol><li>MyoICをDACから分離するには、皿からメディアを空にし、1mLのDPBSで1xを洗い換え、新鮮なトリプシンEDTA(0.05%)を1 mL追加し、逆顕微鏡で消化を注意深く監視します(10Xまたは20Xの目的、図2B、C、F)。外側のMyoEC層の剥離はトリプシン-EDTA(0.05%)に応じて、3-6分を必要とする強度。 注: このプロセスを示す代表的なイメージについては、図 2を参照してください。明視野照明の下では、MyoICは丸みを帯びて表示され、中心に付着したまま暗く見えるLEDと比較して明るい外観を持っています。</li>
	<li>2 mL 10% FBS/DPBS を含む 15 mL チューブに MyoEC フラクションを収集します。60 mm皿をDPBSの2 mLでそっと洗い、DPBSを処分します(図2H-I)。 メモ:通常の MyoIC のリカバリは、MG のサイズに応じて(3.5 x 106-1.5 x 106)の範囲内です。</li>
	<li>LEC 分数を削除するには、トリプシン EDTA (0.05%)再び皿にし、7-15分をインキュベートし、消化過剰を防ぐために注意深く監視する。トリプシンEDTAをクエンチ (0.05%)10%FBS /DPBSの2 mLで皿に。LECの分数を新しい15 mLチューブに集めます。 注:通常の、ICの回復は、MGsのサイズに応じて範囲(2 x 106-4.2 x 106)以内です。Figure 2E19</li>
	<li>トリプシン-EDTA(0.05%)を除去するために300 x gで5分間の各分率を遠心分離する。250 μLのメンテナンス培地でペレットを再懸濁し、ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンターを使用して各細胞集団をカウントします。カウントしながら氷の上に細胞を置きます。 注:細胞分画の遺伝子操作が望ましい場合、プライマリ細胞は、低接着皿上で増殖し、レンチウイルス20に感染することができます。</li>
</ol>4. 3日目:細胞外マトリックスに細胞分数を組み合わせて埋め込む
注意:MyoECとLECの分数を収集してカウントしたら、それらを組み合わせることができます。一般的な MyoEC/LEC 比は 1:3 (図 3A)19です。異なる研究を行うことができます。例えば、モザイク研究を行うために、分画は野生型(WT)および突然変異体(Mut)マウスから生成され、組み合わせることができる(MyoEC/LEC:WT/WT;WT/Mut;ミュート/WT;Mut/Mut)21、または分数は、MyoIC/LECs19の異なる比率を使用して組み合わせることができます。
<ol><li>セル数に基づいて、12,000個のセル/ウェル(例えば3,000のMyoIC:9,000のLECs)のために準備する必要があるウェルの数(8ウェルチャンバー、材料表を参照)を計算します。</li>
	<li>50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, フェノールレッドなし) の 90 μL を各ウェルに加えて、3D 培養のベースレイヤーを確立します。気泡がなく、井戸が均等にコーティングされていることを確認してください。基層を固化させるために、スライドを37°C、5%CO2で302分間インキュベートする。 注:ECMはこのステップまで氷冷を維持する必要があり、そうでなければ早期に重合し、不均一なベースコーティングと重合につながります。ベースECMを使用すると、画像キャプチャを支援する単一の平面でオルガノイドの成長を高めます。これはまたより速いオルガノイドの成長を得、より少ないECM22を使用する。</li>
	<li>重合の間、細胞ミックスを調製する。5分間300 x gのMyoECとLECの分数をペレットにし、各細胞分画を10%ECM/90%成長培地で再懸濁して、各ウェルが100 μLになるようにします(成長培地の作り方については表1を参照)。 注:準備を容易にするために、同じセルミックスを使用してウェルを複製してください。これらは、1つのチューブで組み合わせて調製することができます(例えば、同じ細胞ミックスの4つのウェルは、10%ECM / 90%成長培地の400 μLで調製することができます)。</li>
	<li>各ウェルに各細胞ミックス100μLを10%ECM/90%成長培地に加え、オルガノイドが37°C、5%CO2で20分間落2ち着くようにします。</li>
	<li>細胞が落ち着いたら、各ウェルのチャンバー壁を穏やかにピペットダウンして、100 μLの成長培地を静かに加えます。スライドを37°C、5%CO2でインキュ2ベートする(図3AA各ウェルの全組成を参照)。 注:ローキナーゼ阻害剤、R-スポンディン、およびNrg1は、原発性マウス乳腺細胞およびヒト乳癌細胞13,14,14の両方から成長したオルガノイドの長期培養にとって重要であると同定された因子である。さらに、幹細胞因子B27およびN2は、オルガノイドを培養できる時間を延長する。</li>
	<li>画像細胞は24時間ごとに成長を追跡し、100 μL/wellを使用して2〜3日ごとに成長培地を静かに更新します(図3B-E)。 注: メディアを更新する際は細心の注意を払ってください。ウェルの一角で媒体を収集するためにチャンバースライドを傾けます。培地の≤100 μLを取り除き、ECM層を邪魔しないままにするように注意して補充してください。</li>
	<li>研究者が授乳/骨膜形成の調査に興味がある場合は、5日目にアルヴェオロジェネシス培地(表1参照)に切り替え、回復溶液(材料表を参照)を使用して通過することによって、10日目(図3F)まで2〜3日ごとに培地を更新し続けます(材料表を参照)。 注:この時点で、オルガノイドは4°Cの4°Cの回収液の400 μLで4°CでインキュベートすることによってECMから分離することができます(プロトコルおよび試薬情報の材料表を参照)。</li>
</ol>5. 5日目または10日目:オルガノイドの固定と免疫染色
<ol><li>メディアを軽くピペットにして慎重に培地を取り除きます(電球ピペットが最適です)。1xダルベッコのリン酸緩衝生理食塩基(DPBS、レシピを参照)の200 μLを使用して、各ウェルをリンスします。</li>
	<li>室温で10分間、コールド(4°C)4%(w/v)パラホルムアルデヒド(PFA、レシピを参照)を使用してオルガノイドを固定します。 注意: PFA は危険です。個人用保護具(ラボコート、手袋、安全眼鏡)を着用してください。このステップは、ヒュームフードの内側で実行する必要があります。 メモ: ECM は PFA 処理によって溶解されます。不完全なECM除去は、オルガノイドが免疫蛍光によって分析される際にバックグラウンド染色につながる可能性があります。</li>
	<li>4%PFAを取り出し、200 μLの0.2%(w/v)グリシン/DPBS(表1を参照)を各ウェルに加えます。ゆっくりとした設定に設定された揺れる表面に、室温で一晩30分または4°Cの間、スライドをインキュベートします。 メモ:オルガノイドは、次のステップの前に4°CでDPBSで1〜3日間保存することができます。</li>
	<li>DPBS + 0.25% トリトンX-100(PBST、表1参照)を室温で10分間使用してオルガノイドを透過させる。</li>
	<li>ロッキング表面上のDPBSで5%ロバ血清(DS)(または二次抗体の種に一致する他の血清)を使用してオルガノイドをブロックします。 注:このステップは、ロッキング面上で4°Cで一晩実行することができます。</li>
	<li>1%DS/DPBSで一次抗体を調製する。各ウェルに125-200 μLを使用してください。ロッキング表面上で一次抗体のオルガノイドを一晩4°Cでインキュベートすることにより免疫染色を行う。</li>
</ol>6. 11日目:完全な免疫蛍光
<ol><li>200 μL PBST を 200 μL PBST で 2X ずつ 5 分間洗浄し、125~200 μL を使用して 2 次抗体を 1% DS/DPBS に加えます。ロッキング面の室温で45分間インキュベートします。</li>
	<li>1ウェルあたり200μL PBSTを使用して、各ウェル2Xを洗浄します。</li>
	<li>DPBSでHoechst DNA色素(DPBSで1:2,000)を室温で5分間使用して核を染色する。</li>
	<li>真空で軽く吸引することで、ウェルに残った液体をすべて取り除きます。</li>
	<li>チャンバーとガスケットを慎重に取り外し、各ウェルとカバースリップに取り付け媒体(材料表を参照)の1滴(〜30μL)を配置し、気泡を取り除くように注意してください。スライドを暗い場所で1~2日間乾燥させます。透明なマニキュアでシールします。共焦点顕微鏡上のオルガノイドを画像化する(図3E-F)。</li>
</ol>

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<li>Koledova, Z., Lu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Fibroblast-Epithelium+Co-culture+Model+for+Understanding+Microenvironmental+Role+in+Branching+Morphogenesis+of+the+Mammary+Gland%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland.</a> Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

ここでは、研究者が原発MG細胞を用いて3Dオルガノイド培養を生成する方法を詳述する方法を提示する。これと他のプロトコルの違いは、外側の基底筋筋と内側のLEDの2つの異なるMGセルコンパートメントを分離する方法を詳述していることです。当社の方法は、2段階のトリプシン-EDTA(0.05%)を採用しています我々は、微分トリプシン化19と呼ぶ治療.この手順により、研究者は洗練されたフローサイトメトリーを使用せずにMyoICおよびLECを分離することができ、したがって、FACSに必要な十分に特徴付けられるバイオマーカーを持っていない可能性のある多種多様な哺乳類種から採取されたMGを研究するために使用することができます。2つの細胞亜集団を分離する能力により、研究者は孤立した細胞を独立して遺伝子的に改変したり、遺伝子変異や標識を持つ動物の細胞を再結合したりして、3D培養でモザイクオルガノイドを生成することができます。現在のプロトコルの制限は、間質コンパートメントが培養条件に含まれていないということです。しかし、生体内ECM23、24、25、26...

乳腺(MG)は、腺細胞の豊富なストロマの中に埋め込まれた木状の管状の上皮構造である。二層状管上皮は、収縮性の外部、基底層、筋上皮細胞(MyoIC)および内層のルミナル、分泌上皮細胞(LECs)を含み、中央内腔1を囲む。外側の筋膜が内側の肺胞のLECsからミルクを絞るために収縮する授乳中に、MGは成長因子(例えば、EGFおよびFGF)およびホルモン(例えばプロゲステロン、インスリンおよびプロラクチン)の制御下にある多数の変化を受ける。これらの変化は、授乳中にミルクを合成し、分泌する特殊な構造、Alveoliの分化を引き起こす1.乳腺上皮は、上皮組織断片、細胞、あるいは単一の基底細胞を宿主乳腺脂肪パッドに移植し、内因性乳腺核間腫を事前に取り除き、全体の機能的上皮樹を,3,4再構成するために成長させる技術を使用して実験的に操作,することができる。移植は強力な技術ですが、突然変異が移植可能な乳腺の救助を妨げる初期の胚致死性(E14以前)をもたらす場合、それは時間がかかり、不可能です。さらに、研究者はしばしば、系統制限付き前駆細胞に由来する2つの異なるコンパートメントの役割を研究したいと考えています。Cre-lox技術はMyoICとレクチの遺伝子操作を可能にしますが、これは時間と費用のかかる事業でもあります。したがって、1950年代以降、研究者は乳腺組織の構造と機能6に関する質問に比較的簡単かつ効率的な方法としてインビトロ乳腺オルガノイドを使用してきました6,7.
原発性乳腺上皮細胞の単離および培養を記述する初期のプロトコルにおいて、研究者は、血漿血栓と鶏胚抽出物で構成される基膜マトリックス(BME)が、皿6で成長したMG断片に必要であることを発見した。次の数十年の間に、細胞外マトリックス(ECM、コラーゲン、およびエンゲルブレス・ホルム-群れのマウス肉腫細胞によって分泌されるゼリー様タンパク質マトリックス)が開発され、生体内環境,7、8、9、108を模倣する3D培養を容易にした。9,107生体内の生理学的プロセスにおいてこのような微小環境により良いモデルが,,9、10、11、1210であることを複数の基準(形態、遺伝子発現、およびホルモン応答性)によって明らかにされた3Dマトリックスの細胞を培養する。1112一次マウス細胞を用いた研究では、オルガノイド13の拡張維持と分化に必要な主要な成長因子およびモルフォゲンを同定した。これらの研究は、ここで提示されるプロトコルの段階を設定し、ヒト乳房細胞の培養については、現在では現代の臨床ツールである3Dオルガノイドとして、患者サンプル14の創薬および薬物検査を可能にする。全体として、オルガノイド培養は、原発細胞の自己組織化能力と形態形成および分化への貢献を強調している。
ここで提示されるのが、乳を産生するアチーニに分化することができるマウス上皮を培養するためのプロトコルである。微分トリプシン法は、2つの異なるMGセルコンパートメントを構成するMyoICとLECを分離するために使用されます。これらの分離された細胞分画は、遺伝子操作して過剰発現またはノックダウン遺伝子機能を可能にする。系統固有の自己組織化は乳腺上皮細胞15、16、1716,の自然な15性質であるため、これらの細胞画分を組み換えて、研究者は二重層のモザイクオルガノイドを生成することができます。17脂肪組織を酵素的に消化し、その後、24時間組織培養皿上の乳腺断片をインキュベートすることから始めます(図1)。組織断片は、インビボ組織を有する二重層断片としてポリスチレン皿に沈着する:内層の明るさ層を取り巻く外筋上皮層。この細胞組織はトリプシンEDTA(0.05%)によって外側のMyoICの分離を可能にする3-6分の治療に続いてトリプシン-EDTAの第2ラウンド(0.05%)残りの内側のLEDを取り外す処理(図2)。したがって、異なるトリプシン感受性を有するこれらの細胞タイプは分離され、その後ECMで混合およびめっきすることができる(図3)。細胞は自己組織化を経て二重層球を形成し、内側のLEDを取り巻くMyoICの外層を含む。ルーメン形成は、細胞が成長因子のカクテルを含む培地で成長するにつれて起こる(成長培地のレシピを参照)13.5日後、オルボロジェネシス培地(レシピおよび図3Fを参照)に切り替えて、オルガノイドを乳産生アチーニに分化し、さらに5日間インキュベートすることができます。あるいは、オルガノイドは少なくとも10日間、成長培地で拡大し、分岐し続ける。オルガノイドは、免疫蛍光(図3D-F)を用いて分析するか、または回復溶液(材料表を参照)を用いてECMから放出し、他の方法(例えば、イムノブロット、RT-qPCR)を介して分析することができる。

<table><tbody><tr><td>15 ml High-Clarity ポリプロピレン コニカル チューブ (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>24 well 超低アタッチメント プレート (コーニング)</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3473-24EA</td><td></td></tr><tr><td>35 mm TC 処理イージー グリップ スタイル セル カルチャー ディッシュ (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 ml High-Clarity ポリプロピレン コニカル チューブ (BD Falcon)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>352098</tr><tr><td>60 mm TC処理イージーグリップスタイル細胞培養ディッシュ(BDファルコン)</td><td>Fisher Scientific</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro;M ナイロン細胞ストレーナー (コーニング)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Pen/Strep also works</td></tr><tr><td>B27 supplement without vitamin A (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>B6 ACTb-EGFP mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>003291</td><td></td></tr><tr><td>BD Insulin syringe 0.5 mL</td><td>Thermoフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-826-79</td><td></td></tr><tr><td>クラス2ディスパーゼ(ロシュ)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>クラス3コラゲナーゼ</td><td>ワージントン生化学LS004206</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コーニング細胞回復ソリューション</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>354253</td><td>使用のガイドラインに従ってください&ndash;Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix</td></tr><tr><td>Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well</td><td>Fisher Scientific</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Millipore Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12, no phenol red</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>DNase (デオキシリボヌクレアーゼI)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>ロバ反ヤギ 647</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A21447</td><td>1:500 で使用、ロット:1608641、ストック 2 mg/mL、RRID:AB_2535864</td></tr><tr><td>ロバ アンチマウス 647</td><td>ジャクソン イムノリサーチ</td><td>715-606-150</td><td>1:1000 で使用、ロット:140554、ストック 1.4 mg/mL</td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグル 媒体:栄養混合物 F-12 (DMEM/F12)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11330-057</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190-250</td><td>、Mg2 +/Ca2 +</td></tr> <tr><td>EGF</td>なし<td>、フィッシャーサイエンティフィック</td><td>AF-100-15-100ug</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>VWR97068</td><td>&ndash;085</td><td>100% 米国原産、プレミアムグレード、ロット: 059B18</td></tr><tr><td>Fluoromount-G (Southern Biotech)</td><td>Fisher Scientific</td><td>0100-01</td><td>本文では封入剤として言及</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15710064</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-WAP</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-14832</td><td>1:250で使用、ロット:J1011、ストック200&マイクロ;g/mL、RRID:AB_677601</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>AnaSpec</td><td>AS-83218</td><td>使用 1:2000、在庫は 20mM</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>ミリポア シグマ</td><td>I6634-100mg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>KRT14&ndash;CreERtam</td><td>ジャクソン研究所</td><td>5107</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子の減少 (GFR);フェノールレッドフリー;10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>CB-40230C</td><td>ロット: 8204010、ストック濃度 8.9 mg/mL</td></tr><tr><td>MillexGV フィルターユニット 0.22 & micro;m</td><td>ミリポアシグマ</td><td>SLGV033RS</td><td></td></tr><tr><td>ミリセルEZスライド 8ウェルガラス、無菌</td><td>ミリポアシグマ</td><td>PEZGS0816</td><td>これらのチャンバースライドはガスケットの取り外しに最適ですが、他のブランド(Lab Tek IIなど)でもうまく機能します。</td></tr><tr><td>マウス抗SMA</td><td>ミリポアシグマ</td><td>A2547</td><td>1:500 で使用、ロット: 128M4881V、ストック 5.2 mg/mL、RRID:AB_476701</td></tr><tr><td>N-2 サプリメント (100x)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Nrg1</td><td>R&D</td><td>5898-NR-050</td><td></td></tr><tr><td>ヒツジの下垂体プロラクチン</td><td>国立ホルモンおよびペプチドプログラム</td><td></td><td>ハーバーUCLA研究教育研究所のパーロウ博士から購入</td></tr><tr><td>パラホルムアルダヒド</td><td>ミリポアシグマ</td><td>PX0055-3</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタール</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>R26R-EYFP</td><td>ジャクソン研究所</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>Rho阻害剤 Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>R-spondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ろ過ロバ血清</td><td>Equitech-Bio Inc.</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ろ過ロバ血清</td><td>エクイテックバイオ株式会社</td><td>SD30-0500</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>ミリポアシグマ</td><td>x100-500ML</td><td>ラボグレード</td></tr><tr><td>トリプシン EDTA 0.05%</td> <td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300-062</td><td></td></tr></tbody></table>

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

オルガノイドは、料理の利便性の中で生理学的プロセスを再現する自己組織化された3次元組織構造を提供します。マウス乳腺は、外側、収縮性筋上皮コンパートメントおよび内側の分泌状の発光コンパートメントの異なる機能を提供する2つの異なる上皮細胞コンパートメントで構成されています。ここでは、これらの区画を含む細胞を単離し、結合して乳腺形態形成および分化に対する個々の系統の寄与を調べる方法を説明する。この方法は、シンプルで効率的であり、蛍光活性化細胞選別などの高度な分離技術を必要としません。代わりに、組織を収穫して酵素的に消化し、接着組織培養皿に上皮を播種し、次に微分トリプシン化を使用して、ミノエピテリアルと高精液を約90%の純度で結び付けます。その後、細胞は細胞外マトリックスにめっきされ、培養で10日後に牛乳を生産するために分化できる二重層三次元(3D)オルガノイドに組織化されます。遺伝子変異の影響をテストするために、細胞は野生型または遺伝子操作されたマウスモデルから採取することができ、または3D培養の前に遺伝子操作することができる。この技術は、特に、ルミナルまたはミオエピテリアルコンパートメントにおける遺伝子機能の調査を可能にするモザイクオルガノイドを生成するために使用することができる。

ここで提示されるプロトコルは、モザイクオルガノイドを利用して乳腺上皮細胞の特定の系統の寄与を調査するための方法を説明する。オルガノイドの原発性マウス細胞を得るには、乳腺上皮をまず周囲の豊富なジポサイトから分離する必要があります(図1)。このプロセスは、ここで簡単に説明し、また、以前に発表された研究18で説明されています。十分なセルを得るためには、#2、3、4、および 5 つの MG を除去することをお勧めします (図 1A)。上皮細胞の純粋な集団を単離するための重要なステップ鍵は、製剤を汚染する免疫細胞が豊富である#4MGsからリンパ節を除去することだ(図1A,B)。MGを細かく刻み、サイズが0.1mmの断片を生成した(図...

乳腺は二重構造であり、外筋上皮および内皮上皮細胞を含む。提示は、微分トリプシン法を用いてオルガノイドを調製するためのプロトコルである。この効率的な方法により、研究者はこれら2つの細胞タイプを別々に操作して、乳腺の形態と機能における彼らの役割に関する質問を探求することができます。

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

私たちの方法は、研究者が組織の形態と機能に対する個々の系統の寄与を調査するために異なる細胞型を分離し、操作することを可能にするので、重要である。この手法は、細胞タイプを分離するための穏やかで効率的な方法であり、その結果、細胞の完全性が3D培養のために保存されます。この技術は、十分に特徴付けられているバイオマーカーを持たない細胞を分離するために他のシステムにも適用できます。.生後10~14週齢の雌マウスから2、3、4、5個の乳腺を収穫するには、まず2つの後肢の間の正中線で1センチメートルの切開を行う。首まで切り傷を伸ばし、中線の切開部から手足に向かって小さな横切りを行います。その後、動物の両側にピンでそれを固定する前に教えられた皮膚を伸ばします。鉗子を使用して、数4腺からリンパ節を収集する。乳腺を取り除くために、鋭いはさみを使用して組織の各領域の下で切断し、5%FBSと抗生物質抗抗薬を加えた4度の50ミリリットルのDMEM-F12に組織を収穫する。すべての組織が収集されたら、必要に応じてプレートを回転させる1ミリリットルのピペットチップを通して、すべての組織が均等にミンチされるように、部分が簡単に収まるまで腺を刻みます。その後、3ミリリットルの消化培地の断片を、摂氏37度と5%の二酸化炭素で14時間、6ウェル低接着皿の単一の井戸に移します。翌朝、1ミリリットルのマイクロピペットで組織を10回軽くピペットし、組織断片を15ミリリットルのチューブに移す。遠心分離によって組織を収集し、新鮮なDPBSの5ミリリットルでペレットを再中断します。プレウェット70マイクロメートルナイロンセルストレーナーを通してサスペンションをフィルタリングし、洗浄ごとに37°CのDMEM-F12の10ミリリットルでストレーナーでチューブを4回洗い流します。組織断片を解放するには、手袋をした指でストレーナータブを保持し、60ミリメートルの組織培養皿の上にストレーナーを反転させます。ストレーナーの底を通して維持媒体の4つの1ミリリットルのアリコートを渡し、逆顕微鏡の下で単一細胞、脂肪滴、および汚染組織の皿を素早く調べる。その後、細胞培養インキュベーターにプレートを24時間置き、組織断片が皿に付着し、二重層状の断片を生成するようにします。筋上皮細胞を発光上皮細胞から分離するには、新鮮な0.5%トリプシン-EDTAを1ミリリットルの新鮮な0.5%トリプシン-EDTAを細胞に加える前に、1ミリリットルのDPBSで皿を洗いす。逆顕微鏡で消化を注意深く監視します。筋上皮細胞の外層は3〜6分以内に剥離し始める。筋上皮細胞が剥離したら、上清をDPBSで10%FBSの2ミリリットルを含む15ミリリットルのチューブに移します。明るい上皮細胞を乱すことなく、残りの細胞に新鮮なミリリットルのトリプシンEDTAを加え

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

このプロトコルは、非接着性/間葉性乳房上皮細胞からの細胞外小胞（EVs）/エキソソームの精製、定量化および特徴づけ方法、ならびにこれらを用いて乳腺上皮細胞に乳腺形成能を転移させる方法を記載する。幹様乳腺上皮細胞に由来するEV /エキソソームは、この細胞特性をEV /エキソソームを摂取する細胞に移入することができる。...

細胞外小胞/エキソソームを介した乳腺上皮細胞と乳房管腔細胞との間の乳腺形成能の伝達

体 SCs の可用性は再生医療の重要な疾患モデル作製と SC プロパティへの洞察力を得るために。再プログラムする実験的戦略の紹介、体外が単一の転写コアクチベーター...

・ デ ・ ノボヤップ/タズによる体細胞の幹細胞の生成

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高悪性度漿液性卵巣癌モデリングのための卵管上皮細胞からのマウス由来オルガノイド株の開発

本プロトコルは、制御された三次元培養システムにおいて乳腺形態形成の重要な特徴を再再現するヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルを用いた方法を記述しています。...

乳腺形態形成を再現する三次元ヒト乳房オルガノイドを生成する定義されたハイドロゲルベースの方法

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腫瘍の病因に候補協同遺伝子の機能ゲノム解析のためのモザイクゼブラフィッシュ遺伝子導入

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学ぶ微小トリプシン法による乳腺オルガノイド生成法。マウス乳腺から筋上皮細胞と管腔上皮細胞を分離し、3D培養で個々の細胞系統の役割を研究する効率的な手法を習得できます。

微小トリプシン法によるモザイク乳腺オルガノイドの生成

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