Name: ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: 学ぶブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズ定量化法。遺伝学的・薬理学的操作が肝臓成長に与える影響を評価し、発生生物学研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ユタ大学のマリン・ホッブスと中央集権ゼブラフィッシュ動物資源(CZAR)が、この研究の一部を行うためのゼブラフィッシュの畜産、実験室スペース、および機器を提供することを認めたい。CZARの拡張は、NIH助成金#1G20OD018369-01によって部分的にサポートされています。また、ロドニー・スチュワート、クロエ・リム、ランス・グラハム、コーディ・ジェームズ、ギャレット・ニックム、ハンツマンがん研究所(HCI)ゼブラフィッシュ・ファシリティに感謝したいと思います。R プログラミングの支援を受けてくださったケネス・コンパスに感謝します。この研究は、ハンツマンがん財団(ハンツマンがん研究所に授与された助成金P30 CA042014)(KJE)とNIH / NCI R01CA222570(KJE)からの助成金の一部によって資金提供されました。

動物研究は、ユタ大学の動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認された以下の手順を実施しています。
1. 幼虫の固定
<ol><li>受精後3~7日(dpf)で、幼虫をトリカインメタンスルホン酸で安楽死させる(0.03%)ガラスピペットとピペットポンプを使用して2 mLチューブに最大15個の幼虫を集めなさい。</li>
	<li>幼虫を1mLの冷たい(4 °C)1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を氷上で2回洗浄する。洗浄ごとに、ガラスピペットとピペットポンプでチューブからできるだけ多くの液体を取り出し、冷たいPBSをチューブに1 mL加えます。</li>
	<li>ガラスピペットとピペットポンプを用いてできるだけ多くのPBSを取り出し、1 mLの低温(4°C)4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBSに加えます。 注意:PFAは刺激性であり、発がん性物質の疑いがあります。PFAを扱う際は手袋を着用し、濃縮溶液は化学ヒュームフードで取り扱う必要があります。</li>
	<li>穏やかな揺れと4°Cで少なくとも一晩(しかし数ヶ月まで)インキュベートします。</li>
</ol>2. 肝臓を取り巻く組織を解剖する
<ol><li>1 mLの冷たい(4 °C)PBSで3倍をすすい、リンスの間に5分間揺らすことでPFAから幼虫を取り除きます。 注:4°Cで1日か2日PBSですすい幼虫を保ちてもいいです。</li>
	<li>PBSのいくつかの幼虫を9ウェルの丸底ガラス皿の1つの井戸にピペット。</li>
	<li>肝臓を取り巻く皮膚を取り除きます。<ol>
<li>細かい鉗子を使って幼虫を背中に持ち(腹を上げ)、頭の両側をできるだけ穏やかにつかみます。その後、心臓の上に皮膚をつかむために、もう一方の手で非常に細かい鉗子を使用してください。</li>
		<li>魚の尾に向かって斜めに皮を引き下げ、魚の左側または右側の皿の底に向かって、皮膚を斜めに引き下げます。反対側(右側または左側)に対して繰り返します。</li>
		<li>皮膚のフラップをつかみ、肝臓の上または近くにあるすべての皮膚とメラノフォアが取り除かれるまで、引き下がったり後退したりします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>もしあれば、黄身を取り除きます。<ol>
<li>5~6dpf幼虫の場合は、魚を背中に細かい鉗子で持ち、非常に細かい鉗子を使って黄身を優しく突き出して黄身を一枚に持ち上げます。</li>
		<li>3~4dpf幼虫の場合は、黄身を粉々に削り取ります。背中に細かい鉗子を持って魚を保持し、腹側から始めて黄身をなでるのに非常に細かい鉗子を使用します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ガラスピペットとピペットポンプを使用して、解剖された幼虫を新鮮な冷たいPBSに入れます。</li>
</ol>3. イメージング
<ol><li>幼虫を取り付けるには、きれいなプラスチックペトリ皿の蓋に3%メチルセルロースのいくつかのmLを注ぎます。</li>
	<li>ガラスピペットとピペットポンプを使用して、メチルセルロースに幼虫を加え、幼虫をできるだけ少なくPBSを加えます。</li>
	<li>低倍率の解剖顕微鏡の下で、彼らは左を向いて、彼らの右側に横たわっているように、魚の向きを細かい鉗子を使用します。 注:魚が彼らの側に完全に向かっていることを確認するか、肝臓の測定値が正確でない可能性があります。</li>
	<li>各魚の写真を撮ります。<ol>
<li>撮影する魚が、片方の目をもう一方の目の上に直接置いて、完全に整列していることを確認します。必要に応じて、魚の頭や尾を軽くタップして方向を調整するために細かい鉗子を使用してください。魚の尻尾が曲がった場合は、魚が平らに横たわるように取り除くために鉗子で強引につまんで尾を取り除きます。</li>
		<li>高倍率にズームインし、肝臓に焦点を当て,肝臓の輪郭がはっきりと見えるようにします。</li>
		<li>画像をスナップしてファイルを保存します。</li>
		<li>すべての魚について繰り返し、各画像の倍率が同じであることを確認します。</li>
		<li>同じ倍率でマイクロメータの写真を撮ります(図2Hを参照)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 画像解析
<ol><li>画像処理ソフトを使用して、各魚の肝臓の面積を測定します。<ol>
<li>潜在的な研究者の偏見を回避し、科学的な厳しさ15を促進するために、すべての肝臓の写真を盲目にします。この手順は、他のラボ メンバによって手動で実行することも、コンピュータ プログラム (補足資料) を使用して実行することもできます。ファイルの名前をランダムに変更し、元のファイル名と対応するブラインドファイル名のリストを含む「ランダム化ファイル」を作成します。</li>
		<li>ランダム化されたファイルをファイル 1 から順番に開きます。</li>
		<li>フリーハンド選択ツールを選択し、各肝臓の輪郭を描きます。</li>
		<li>Ctrl+M を押して、各肝臓の面積を測定します。</li>
		<li>正確に測定できない肝臓については、プレースホルダの測定値を挿入します (非常に小さいか、非常に大きいので、後で簡単に除外できます)。</li>
		<li>測定値をテキストファイル(「測定ファイル」)に保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>データの非ブラインドおよび分析<ol>
<li>スプレッドシートプログラムで「計測ファイル」と「ランダム化ファイル」を開きます。</li>
		<li>「計測ファイル」に新しい列を挿入し、「ランダム化ファイル」を使用して、ブラインドファイルの元のファイル名を追加します。このファイルを「ブラインドなし測定ファイル」として保存します。</li>
		<li>データを元のファイル名で並べ替えます。</li>
		<li>画像が不十分であった肝臓の測定値は必ず除外してください(図2A-Gを参照)。</li>
		<li>必要に応じて、測定値を目的のスケール(mm2など)に変換します。<ol>
<li>画像処理ソフトウェアでスケールバーを開きます。</li>
			<li>直線ツールを使用して、スケールバー上で 1 mm を測定します。画像処理ソフトウェアは、変換係数を与え、肝臓(ピクセル)と同じ単位で測定します。</li>
			<li>変換係数を使用して、「ブラインドなし測定ファイル」の測定値を変換します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>スプレッドシートプログラムを使用するか、データを科学的なグラフ化および統計ソフトウェアに貼り付け、平均と標準偏差を決定し、p値を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lin, D. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li>
<li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+hepatocellular+carcinoma%3A+Epidemiology%2C+etiology%2C+and+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1(2017).</li>
<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+%CE%B2-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
<li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras%28V12%29+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+inducible+kras%28V12%29+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li>
<li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li>
<li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18%2C+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), Cambridge, England. 3561-3572 (2005).</li>
<li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish%3A+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), London, England. 21-28 (2012).</li>
<li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ImageJ+ecosystem%3A+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Reproduction+and+Development%22%5BJournal%5D)">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li>
<li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li>
<li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae%3A+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition & Metabolism. 12, 42(2015).</li>
<li>Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li>
<li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754(2012).</li>
<li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), Cambridge, England. 1339-1348 (2011).</li>
<li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor%2C+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2%2C+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish%3A+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), Baltimore, Md. 1958-1970 (2012).</li>
</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

肝臓の発達、再生、および腫瘍形成を理解することを目的とした研究では、肝臓のサイズの定量化は重要です。ここで説明するプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズ定量のための比較的迅速かつ簡単で安価な技術です。プロトコルの特定の側面を実行しながら適切な注意を払うことは、結果の精度を高め、フラストレーションを減らすことに役立ちます。
幼虫の適切な固定は、よく保存された生物学的サンプルを取得し、その崩壊を防ぐために重要です。4%のPFA溶液の希釈は、PBSがリンス幼虫にPFAを添加する前に完全に除去されない場合に起こり得る。適切に作成された PFA ソリューションを使用し、PFA 追加前に PBS ソリューションのすべてまたは大部分をピペット化することは、この問題に対処するのに役立ちます。
速く、多くの練習の後に実行するのは簡単ですが、解剖技術は、かなりの手動の器用さを必要とします。解剖中、肝臓全体が露出するように、肝臓の上から皮膚と黄身を完全に取り除することが重要です。これを行わないと、肝臓の境界のビューが隠れた画像が生じることが...

肝細胞癌(HCC)は、肝臓1の最も一般的な原発性悪性腫瘍であり、癌関連死亡率2の第3の主要な原因である。肝癌のメカニズムを理解し、潜在的なHCC治療薬を同定するために、我々および他の人々は、β-カテニン3、4、Kras(V12)5、6、Myc7、またはYap18のような腫瘍遺伝子の肝細胞特異的発現が成人動物のHCCにつながるトランスジェニックゼブラフィッシュを開発しました。これらのゼブラフィッシュでは、肝臓の拡大は受精後6日(dpf)に早くも注目され、腫瘍遺伝子駆動の肝臓過剰増殖に対する薬物および遺伝的変化の効果をテストするためのファシリティプラットフォームを提供する。幼虫の肝臓のサイズの正確かつ正確な測定は、これらの操作の効果を決定するために不可欠です。
肝臓の大きさと形状は、CY3-SA標識9または肝細胞特異的蛍光レポーターおよび蛍光分光顕微鏡顕微鏡法を用いた生きたゼブラフィッシュ幼虫で固定ゼブラフィッシュ幼虫で半定量的に評価することができる5,6。後者の方法は比較的速く、その精度の欠如は、画像処理ソフトウェア7、10を使用して各肝臓の面積を撮影して測定することによって対処することができる。しかし、2次元の肝臓領域が肝臓の大きさを正確に表すような実験で、すべての生きた幼虫を均一に配置することは技術的に困難である可能性があります。肝臓のサイズを定量する同様の技術は、幼虫肝容積8を定量するために光シート蛍光顕微鏡を使用することを含むが、これは肝臓が異なる次元で不均一に拡大された場合のサイズの違いを検出するためのより正確であるかもしれない。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、幼虫肝臓における蛍光標識肝細胞および他の肝細胞タイプの数を数えるために使用することができる8、11。この方法では、幼虫の肝臓がプールされ、解き分け、個々の肝臓のサイズと形状に関する情報が失われます。他の肝サイズ決定方法と組み合わせて、FACSは増加した細胞数(過形成)と増加した細胞サイズ(肥大)との間の分化を可能にする。これらの方法はすべて高価な蛍光技術(顕微鏡または細胞選別器)を採用し、CY3-SA標識を除いて、蛍光レポーターによる肝細胞の標識を必要とする。
ここでは、明視野顕微鏡および画像処理ソフトウェア3、12、13、14を用いてゼブラフィッシュ幼虫の肝臓領域を定量する方法について詳細に説明する。このプロトコルは、蛍光顕微鏡を使用せずに、その場で個々の肝臓の面積を正確に定量化することができます。肝臓のサイズを分析しながら、我々は、研究者の偏見を低減し、科学的な厳しさを向上させるために画像のアイデンティティを盲目に15.

<table><tbody><tr>顕微鏡ライカを<td>解剖するためのカメラ</td><td>、例えば</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカを</td>解剖する、例えば<td></td><td></td></tr><tr><td>ファイン(デュモン#5)鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>画像解析ソフト</td><td>画像J/FIJI</td><td></td><td>ImageJ / FIJIは無料でダウンロードできます:<a href="https://imagej.net/Welcome" target ="_blank">https://imagej.net/Welcome< / a></td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>シグマ</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>さまざまなサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットポンプ</td><td>VWR53502-233</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチックペトリ皿</td><td>USA Scientific Inc</td><td>2906</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex 9 ウェル丸底ガラス皿</td><td>VWR</td><td>89090-482</td><td></td></tr><tr><td>ファイルを見失うためのソフトウェア</td><td>R プロジェクト</td><td></td><td>R は無料でダウンロードできます: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a</td></tr><tr><td>>Scientific グラフ作成および統計ソフトウェア</td><td>GraphPad プリズム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スプレッドシート プログラム</td><td>Microsoft Excel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリカイン メタンスルホン酸 (Tricaine-S)</td><td>Western Chemical</td><td>200-226</td><td></td></tr><tr><td>非常に細かい (Dumont #55) 鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr></tbody></table>

ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

肝細胞癌(HCC)のいくつかのトランスジェニックゼブラフィッシュモデルでは、肝腫は幼虫初期段階で観察することができる。ゼブラフィッシュHCCモデルにおける幼虫の肝臓のサイズを定量化することは、腫瘍遺伝子関連の表現型に対する薬物および他の操作の影響を迅速に評価する手段を提供する。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫を固定し、肝臓を取り巻く組織を解剖し、明視野顕微鏡を用いて肝臓を撮影し、肝臓面積を測定し、結果を分析する方法を示します。このプロトコルは、肝臓のサイズの迅速かつ正確な定量化を可能にします。この方法は、肝領域を測定することを含む, それは肝臓の体積の違いを過小評価可能性があります, そして、補完的な方法論は、細胞のサイズの変化と細胞数の変化を区別するために必要とされます.本明細書に記載される解剖技術は、免疫蛍光染色およびin situハイブリダイゼーションを含む無数の下流アプリケーションのための自然な位置で肝臓、腸、膵臓を視覚化するための優れたツールです。幼虫の肝臓のサイズを定量化するための説明された戦略は、肝臓の発達と再生の多くの側面に適用可能です。

肝細胞特異的活性化βカテニン(Tg(fabp10a:pt-β-cat)ゼブラフィッシュ)3および非トランスジェニック対照兄弟を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュを6dpfで安楽死させ、肝臓領域を明熱域で明熱分析し、明視野顕微鏡および画像処理ソフトウェアを用いて肝臓領域を定量した。トランスジェニックゼブラフィッシュは、非トランスジェニック兄弟(0.0004 cm2、p&lt;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001;0.0001; 図 1を参照してください。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60744/60744fig1a.jpg"> <strong...

ここでは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を実証し、肝臓の成長と発達に対する遺伝的および薬理学的操作の効果を評価する方法を提供する。

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

この方法は、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を提供する。また、肝臓の成長と開発に対する遺伝的および薬理学的操作の影響の評価を可能にします。この技術は、肝臓だけでなく、腸や膵臓を視覚化し、測定するための迅速かつ正確な方法を提供します。肝臓のサイズを定量化することに加えて、この解剖法は、その場でのハイブリダイゼーションまたは共焦点イメージングのために肝臓、腸、膵臓を調製するのに役立ちます。実験用幼虫のデスクラッキングを試みる前に、実験以外のサンプルの練習に十分な時間を費やし、有意な成功率を持っていることを確認してください。周囲の器官を乱さずに皮膚を除去するためには、ゼブラフィッシュの幼虫や鉗子の適切な向きと動きを視覚化することが重要です。受精後3~7日で、幼虫を安楽死させた後、ガラスピペットとピペットポンプを使用して、2ミリリットルチューブに最大15匹の幼虫を採取します。幼虫を氷の上で冷たい1X PBSの1ミリリットルで2回洗います。ガラスピペットとピペットポンプを使用してできるだけ多くのPBSを取り出し、PBSに冷たい4%PFAの1ミリリットルを加えます。少なくとも一晩は穏やかな揺れで摂氏4度でインキュベートします。ガラスピペットとピペットポンプを使用して、チューブからPFAを取り出し、冷たいPBSの1ミリリットルで3回リンスします。すすいの間に5分間ロックします。9ウェルラウンドボトムガラス皿の1つの井戸にPBSでいくつかの幼虫をピペット。顕微鏡下で、細かい鉗子を使って肝臓を取り巻く皮膚を取り除き、片方の幼虫を背中に保持し、頭の両側をできるだけ穏やかにつかみます。その後、ちょうど心臓の上に皮膚をつかむために、他の手で非常に細かい鉗子を使用しています。魚の左右の皿の底にある魚の尾に向かって斜めに皮膚を引き下げます。反対側についても繰り返します。皮膚のフラップをつかみ続け、肝臓の上または近くにあるすべての皮膚とメラノフォアが取り除かれるまで引き下げます。黄身が受精後5〜6日間存在する場合は、魚を背中に細かい鉗子で保持し、非常に細かい鉗子を使って黄身を穏やかに突き出して、黄身を1枚で持ち上げます。3〜4匹のDPF幼虫の場合は、魚を背中に細かい鉗子で保持し、非常に細かい鉗子を使用して腹側から始まる黄身をなでます。黄身を粉々に削り取ります。ガラスピペットとピペットポンプを使用して、解剖した幼虫を2ミリリットルチューブに新鮮で冷たいPBSに入れます。幼虫を取り付けるには、清潔でプラスチック製のペトリ皿の蓋に3%のメチルセルロースを数ミリリットル注ぎます。ガラスピペットとピペットポンプを使用してメチルセルロースに幼虫を加え、幼虫と共にPBSをできるだけ少なくします。低倍率で解剖顕微鏡の下で、彼らは左に向かって彼らの右側に横たわっているように、魚の向きを微調整するために細かい鉗子を使用しています。撮影する魚がもう一方の目の上に直接片方の目と完全に整列していることを確認します。魚の尻尾が曲がっている場合は、魚が平らに横たわるように、鉗子で強引につまんで尾を取り除きます。高倍率にズームインし、肝臓に焦点を当てます, 肝臓の輪郭がはっきりと見えるように.[イメージのキャプチャ]ボタンを押して、画像をスナップしてファイルを保存します。すべての魚に対して繰り返し、各画像の倍率が同じであることを確認します。同じ倍率を使用してマイクロメーターの写真を撮ります。潜在的な調査者の偏見を避け、科学的な厳しさを促進するために、すべての肝臓の写真を盲目にするためにプログラムRを使用するには、ランダムにファイルの名前を変更し、元のファイル名と対応するブラインドファイル名のリストを含むランダム化ファイルを作成します。ランダム化されたファイルを順に開きます(ファイル 1 から始まります)。フリーハンド選択ツールを選択し、各肝臓の概要.各肝臓の領域を測定するためにコントロールMを押します。皮膚が残っているために正確に測定できない肝臓については、黄身が焦点を合わせていないか、または無傷でない場合は、プレースホルダー測定を挿入します。テキスト ファイルに測定値を保存します。ブラインドを解除してデータを分析するには、測定ファイルとランダム化ファイルをスプレッドシートプログラムで開きます。測定ファイルに新しい列を挿入し、ランダム化ファイルを使用して、ブラインドファイルの元のファイル名を追加します。このファイルをブラインドなし測定ファイルとして保存します。データを元のファイル名で並べ替えます。写真が十分ではなかった肝臓の測定値を除外します。必要に応じて、計測値を必要なスケール(平方ミリメートル)に変換します。画像処理ソフトウェアでスケール バーを開きます。[直線] ツールを使用して、スケール バーの 1 ミリメートルを計測します。画像処理ソフトウェアは、肝臓と同じ単位で測定し、変換因子を与えます。ブラインドなし測定ファイルの測定値を変換するには、変換係数を使用します。平均と標準偏差を決定し、P値を計算します。受精後6日間で、非トランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫は、腸の上に生来の位置と肝臓の形を示した。トランスジェニックゼブラフィッシュは、彼らの非トランスジェニック兄弟と比較して大幅に肝臓のサイズを増加しています。.不十分な画像とマイクロメータの例を以下に示します。肝臓を覆う皮膚を持つ幼虫、肝臓を覆い隠す幼虫、肝臓の一部がつままれた幼虫、肝臓が脱臼して落ちる幼虫、肝臓が欠けている幼虫、識別が困難な肝臓の輪郭を持つ幼虫、不適切な位置付けの幼虫。この手順を試みる場合, 肝臓への損傷を防ぐために小さく、制御された動きを使用することが重要です..また、明視野顕微鏡に加えて、この方法で解剖した幼虫を共焦点顕微鏡、蛍光レポータータンパク質や免疫蛍光染色の可視化、および現場でのハイブリダイゼーションにも使用できます。ホルムアルデヒドまたはPFAは、刺激性および発がん性物質の疑いがある。手袋はPFAを扱うときに着用する必要があり、濃縮された溶液は化学発煙フードで扱われるべきです。

quantifying-liver-size-larval-zebrafish-using-brightfield

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここで説明するには、ゼブラフィッシュ胚における組織特異的な蛍光の半自動イメージングのためのプロトコルです。...

ゼブラフィッシュ胚における組織特異的蛍光の半自動イメージング

私たちは、明視野ベースの立体顕微鏡を使用して、ゼブラフィッシュの幼生の尾びれの再生のダイナミクスを全組織スケールで捉えるためのプロトコルを提示します。この技術により、単一細胞の分解能で再生ダイナミクスを捉えることができます。この方法は、CCDカメラとタイムラプスソフトウェアを搭載したあらゆる実体顕微鏡に適用できます。...

タイムラプス明実体顕微鏡でゼブラフィッシュ幼虫における組織修復をキャプチャ

ライトシート蛍光顕微鏡は、胚発生をイメージングするための優れたツールです。これにより、生理学的に近い状態で生きた胚の長時間のタイムラプス動画を記録できます。私たちは、広い時空間スケールでのゼブラフィッシュの眼の発達のイメージングへの応用を実証し、マルチビューデータセットの融合とデコンボリューションのパイプラインを提示します。...

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

ゼブラフィッシュは、食事の脂質処理と代謝性疾患の貴重なモデルとして浮上しています。脂質が豊富な幼虫の飼料のプロトコル、食事性蛍光脂質類似体のライブイメージング、および食物摂取量の定量化について説明します。これらの手法は、さまざまなスクリーニング、イメージング、および仮説主導の調査手法に適用できます。...

幼虫のゼブラフィッシュのためのパラダイムを摂食高脂肪：摂食、ライブイメージング、および食物摂取の定量化

ここでは、通常の発達過程を妨げずにゼブラフィッシュの胚のサイズを小さくする方法について述べる。この手法により、サイズ変更に対するパターンのスケーリングと開発の堅牢性の検討が可能になります。...

胚性パターンスケーリングの研究のためのゼブラフィッシュの外科的サイズ縮小

このプロトコルは、肝臓再生の研究を可能にするために、成体ゼブラフィッシュの肝臓の腹側葉を除去するための手順を説明します。...

成虫ゼブラフィッシュの部分肝切除術

ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。...

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

ここでは、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)関連の肝細胞癌(HCC)ゼブラフィッシュモデルを生成して、肝臓の微小環境と免疫細胞の景観に対するコレステロール余剰の影響を研究する方法を紹介します。...

ゼブラフィッシュにおける非アルコール性脂肪性肝疾患関連肝細胞癌の早期進行過程における肝微小環境の解析

光学的透明度は、ゼブラフィッシュの細胞生物学的および生理学的研究にとって大きな利点です。骨格筋および隣接組織の成長が全身の成長とどのように統合されるかについての新しい洞察を可能にする、個々の動物の細胞増殖を測定するための堅牢な方法が説明されています。...

電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

ここでは、3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ仔魚の in vivo...

インビボ 3次元蛍光顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生の全脳イメージング

このプロトコルはゼブラフィッシュの幼虫の心臓収縮機能を調査し、細胞追跡および相互分析によって心臓力学に洞察を得るのにライトシートイメージ投射を利用する。...

ゼブラフィッシュの心臓収縮の4Dライトシートイメージング

学ぶブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズ定量化法。遺伝学的・薬理学的操作が肝臓成長に与える影響を評価し、発生生物学研究に応用できます。

ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化

さらに動画を探す