ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化
February 2nd, 2020
ここでは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を実証し、肝臓の成長と発達に対する遺伝的および薬理学的操作の効果を評価する方法を提供する。
この方法は、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を提供する。また、肝臓の成長と開発に対する遺伝的および薬理学的操作の影響の評価を可能にします。この技術は、肝臓だけでなく、腸や膵臓を視覚化し、測定するための迅速かつ正確な方法を提供します。
肝臓のサイズを定量化することに加えて、この解剖法は、その場でのハイブリダイゼーションまたは共焦点イメージングのために肝臓、腸、膵臓を調製するのに役立ちます。実験用幼虫のデスクラッキングを試みる前に、実験以外のサンプルの練習に十分な時間を費やし、有意な成功率を持っていることを確認してください。周囲の器官を乱さずに皮膚を除去するためには、ゼブラフィッシュの幼虫や鉗子の適切な向きと動きを視覚化することが重要です。
受精後3~7日で、幼虫を安楽死させた後、ガラスピペットとピペットポンプを使用して、2ミリリットルチューブに最大15匹の幼虫を採取します。幼虫を氷の上で冷たい1X PBSの1ミリリットルで2回洗います。ガラスピペットとピペットポンプを使用してできるだけ多くのPBSを取り出し、PBSに冷たい4%PFAの1ミリリットルを加えます。
少なくとも一晩は穏やかな揺れで摂氏4度でインキュベートします。ガラスピペットとピペットポンプを使用して、チューブからPFAを取り出し、冷たいPBSの1ミリリットルで3回リンスします。すすいの間に5分間ロックします。
9ウェルラウンドボトムガラス皿の1つの井戸にPBSでいくつかの幼虫をピペット。顕微鏡下で、細かい鉗子を使って肝臓を取り巻く皮膚を取り除き、片方の幼虫を背中に保持し、頭の両側をできるだけ穏やかにつかみます。その後、ちょうど心臓の上に皮膚をつかむために、他の手で非常に細かい鉗子を使用しています。
魚の左右の皿の底にある魚の尾に向かって斜めに皮膚を引き下げます。反対側についても繰り返します。皮膚のフラップをつかみ続け、肝臓の上または近くにあるすべての皮膚とメラノフォアが取り除かれるまで引き下げます。
黄身が受精後5〜6日間存在する場合は、魚を背中に細かい鉗子で保持し、非常に細かい鉗子を使って黄身を穏やかに突き出して、黄身を1枚で持ち上げます。3〜4匹のDPF幼虫の場合は、魚を背中に細かい鉗子で保持し、非常に細かい鉗子を使用して腹側から始まる黄身をなでます。黄身を粉々に削り取ります。
ガラスピペットとピペットポンプを使用して、解剖した幼虫を2ミリリットルチューブに新鮮で冷たいPBSに入れます。幼虫を取り付けるには、清潔でプラスチック製のペトリ皿の蓋に3%のメチルセルロースを数ミリリットル注ぎます。ガラスピペットとピペットポンプを使用してメチルセルロースに幼虫を加え、幼虫と共にPBSをできるだけ少なくします。
低倍率で解剖顕微鏡の下で、彼らは左に向かって彼らの右側に横たわっているように、魚の向きを微調整するために細かい鉗子を使用しています。撮影する魚がもう一方の目の上に直接片方の目と完全に整列していることを確認します。魚の尻尾が曲がっている場合は、魚が平らに横たわるように、鉗子で強引につまんで尾を取り除きます。
高倍率にズームインし、肝臓に焦点を当てます, 肝臓の輪郭がはっきりと見えるように.[イメージのキャプチャ]ボタンを押して、画像をスナップしてファイルを保存します。すべての魚に対して繰り返し、各画像の倍率が同じであることを確認します。
同じ倍率を使用してマイクロメーターの写真を撮ります。潜在的な調査者の偏見を避け、科学的な厳しさを促進するために、すべての肝臓の写真を盲目にするためにプログラムRを使用するには、ランダムにファイルの名前を変更し、元のファイル名と対応するブラインドファイル名のリストを含むランダム化ファイルを作成します。ランダム化されたファイルを順に開きます(ファイル 1 から始まります)。
フリーハンド選択ツールを選択し、各肝臓の概要.各肝臓の領域を測定するためにコントロールMを押します。皮膚が残っているために正確に測定できない肝臓については、黄身が焦点を合わせていないか、または無傷でない場合は、プレースホルダー測定を挿入します。
テキスト ファイルに測定値を保存します。ブラインドを解除してデータを分析するには、測定ファイルとランダム化ファイルをスプレッドシートプログラムで開きます。測定ファイルに新しい列を挿入し、ランダム化ファイルを使用して、ブラインドファイルの元のファイル名を追加します。
このファイルをブラインドなし測定ファイルとして保存します。データを元のファイル名で並べ替えます。写真が十分ではなかった肝臓の測定値を除外します。
必要に応じて、計測値を必要なスケール(平方ミリメートル)に変換します。画像処理ソフトウェアでスケール バーを開きます。[直線] ツールを使用して、スケール バーの 1 ミリメートルを計測します。
画像処理ソフトウェアは、肝臓と同じ単位で測定し、変換因子を与えます。ブラインドなし測定ファイルの測定値を変換するには、変換係数を使用します。平均と標準偏差を決定し、P値を計算します。
受精後6日間で、非トランスジェニックゼブラフィッシュの幼虫は、腸の上に生来の位置と肝臓の形を示した。トランスジェニックゼブラフィッシュは、彼らの非トランスジェニック兄弟と比較して大幅に肝臓のサイズを増加しています。.不十分な画像とマイクロメータの例を以下に示します。
肝臓を覆う皮膚を持つ幼虫、肝臓を覆い隠す幼虫、肝臓の一部がつままれた幼虫、肝臓が脱臼して落ちる幼虫、肝臓が欠けている幼虫、識別が困難な肝臓の輪郭を持つ幼虫、不適切な位置付けの幼虫。この手順を試みる場合, 肝臓への損傷を防ぐために小さく、制御された動きを使用することが重要です..また、明視野顕微鏡に加えて、この方法で解剖した幼虫を共焦点顕微鏡、蛍光レポータータンパク質や免疫蛍光染色の可視化、および現場でのハイブリダイゼーションにも使用できます。
ホルムアルデヒドまたはPFAは、刺激性および発がん性物質の疑いがある。手袋はPFAを扱うときに着用する必要があり、濃縮された溶液は化学発煙フードで扱われるべきです。
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概要
この方法は、幼生ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する手段を提供し、肝臓の成長と発達に対する遺伝的および薬理学的操作の評価を可能にします。また、肝臓、腸、膵臓の可視化と測定を容易にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 遺伝学
背景
- 肝臓サイズの定量化は器官の発達を理解する上で重要です。
- 幼生ゼブラフィッシュは発生研究のモデル生物として役立ちます。
- 遺伝的および薬理学的操作は器官の成長に影響を与える可能性があります。
- 正しい技術は解剖と可視化の成功に不可欠です。
研究目的
- 幼生ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する手法を開発すること。
- 遺伝的および薬理学的介入が肝臓の発達に与える影響を評価すること。
- 組織を更なる分析技術（例：in situ ハイブリダイゼーション）に備えること。
使用された方法
- 幼生ゼブラフィッシュの解剖を行い、肝臓、腸、膵臓を露出させる。
- 器官サイズを測定するための可視化技術。
- 技術の習熟を確保するために非実験サンプルで練習を行う。
- 解剖中の方向性と動きの制御により、器官の損傷を避ける。
主要な結果
- この方法により、肝臓サイズの迅速かつ正確な測定が可能になります。
- 操作に対する器官の発達の研究を容易にします。
- さらなるイメージング研究の基礎を提供します。
- 実験結果における技術の重要性を示します。
結論
- この方法は、幼生ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化するのに効果的です。
- 器官成長に対する遺伝的および薬理学的効果の評価をサポートします。
- 正しい解剖技術は実験結果の成功に不可欠です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying larval liver size in zebrafish models enables rapid assessment of drug effects on oncogene-related phenotypes, supporting early-stage target validation in hepatocellular carcinoma research. This method provides predictive confidence by linking genetic or pharmacologic interventions to measurable organ growth changes, informing portfolio triage decisions. The approach supports mechanistic de-risking by offering a quantitative, reproducible readout for pathway modulation in preclinical disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring liver area changes in response to oncogene modulation.
- Operational Value: Provides a rapid, precise quantification method suitable for high-throughput screening of genetic or pharmacologic interventions.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through objective, measurable phenotypes that correlate with disease-related hepatomegaly.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Dissection protocol prepares liver, gut, and pancreas for downstream applications like immunofluorescence and in situ hybridization.
- Reproducibility: Standardized fixation, dissection, and imaging steps ensure consistent liver area measurements across experimental groups.
- Scalability: Method allows processing of up to 15 larvae per tube, supporting batch-wise analysis for compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma where hepatomegaly is an early larval phenotype.
- Translational Continuity: Enables seamless transition from discovery to preclinical validation by providing quantifiable organ size data.
- Risk-Adjusted Decisions: Liver size measurements inform go/no-go decisions based on dose-dependent or genotype-dependent growth effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a quantitative bridge between genetic manipulation and phenotypic outcome.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking oncogene expression to measurable liver area changes in larval zebrafish.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (liver area in mm²) that enable reliable comparison across treatment conditions.
- Analytics: Generates measurable data (mean, standard deviation, P-values) suitable for statistical analysis and hit confirmation.
- Translational Research: Connects early phenotypic screening to preclinical continuity through disease-relevant liver hypertrophy readouts.
- Enterprise Reuse: Dissection and imaging workflow is adaptable across multiple organ systems (liver, gut, pancreas) and compatible with multiplexed downstream assays.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing a direct, quantifiable readout of liver growth in response to pathway modulation.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through blinded image analysis and scale-bar calibration.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early phenotypic assessment, reducing investment in ineffective targets.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization by identifying compounds or genotypes that significantly alter liver size relative to controls.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish handling, dissection, and brightfield microscopy to avoid tissue damage.
- Depends on instrumentation including dissecting microscopes, glass pipettes, forceps, and image processing software (e.g., R, ImageJ).
- Necessitates cross-team standardization of dissection technique, file blinding, and measurement protocols to minimize investigator bias.
- Adaptation considerations include adjusting dissection timing based on larval age (3–7 dpf) and yolk presence.
- Practical limitation: Liver area measurement may underestimate volume changes; complementary methods needed to distinguish hypertrophy from hyperplasia.
