Name: 生体物質膜上におけるヒトおよび羊角膜内皮細胞層の増殖 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 学ぶ角膜内皮細胞の培養法。ヒトおよび羊の組織片から上皮間葉転移を防ぎながら分離・増殖し、再生医療への応用に向けた持続可能な細胞供給システムを確立する方法です。

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図7の準備中に彼女の援助のためのノエミー・ガロリーニに感謝します。この研究は、オーストラリア国民保健医療研究評議会(プロジェクト補助金1099922)によってDHに授与されたプロジェクト補助金と、クイーンズランド眼研究所財団から受け取った補助資金によって支えられました。

研究のためのドナーの同意を持つ人間の角膜は、クイーンズランド州アイバンクから取得され、メトロサウス病院と保健サービスの人間研究倫理委員会(HREC/07/QPAH/048)から倫理承認を得て使用されました。羊角膜は、組織共有契約の下でクイーンズランド大学のハーストン医学研究施設で安楽死動物から得られました。
1. 解剖ツールの準備
<ol><li>5分間70%エタノールの溶液に浸すか、オートクレーブすることによって、ナンバー4の時計製造者鉗子の2組を殺菌します。</li>
</ol>2. 培養液・組織培養プレートの調製
<ol><li>Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX-1、5%のウシ胎児血清、100 U/mLペン/ストレップを含む100 mLの培地を調製します。この培養液は、羊角膜内皮細胞培養に適しており、ヒト角膜内皮細胞培養では50μg/mLウシ下垂体抽出物、0.08%のコンドロイチン硫酸、200μg/mLカルシウム、0.3mM L-アスコルビン酸2-リン酸を添加する必要があります。培養液は、4°Cで2週間暗い場所に保存することができる。</li>
	<li>メーカーの指示に従って6ウェル組織培養プレートの井戸を取り付け係数でコーティングし、各コーティングウェルに1 mLの培養培地を加えます。角膜ごとに1つの井戸を準備します。</li>
</ol>3. 外植解・細胞培養手順
<ol><li>角膜、内皮側を上に置き、解剖顕微鏡のステージ上の無菌ペトリ皿に入れます。角膜表面が内皮層を強調するのに十分なコントラストで明るく点灯するように照明を調整します。エッジと中央角膜内皮が表示されるようにズームを調整します。</li>
	<li>殺菌された時計メーカーの鉗子を使用して、下層のストロマからデセメットの膜を静かに持ち上げて引き裂きます(図1)。膜は、すぐにカールするストリップとしてストロマから取り外されます。取り付け係数でコーティングされ、1 mLの培養液を含む6ウェル組織培養プレートの1つのウェルにストリップを置きます。組織培養プレートの蓋は、汚染のリスクを減らすために、外植物が加えられている場合を除き、常にオンにしておく必要があります。</li>
	<li>最初に内皮の極端な周辺からデセメットの膜のストリップを取り除き、次に中央領域から取り除きます。1つの角膜からすべてのストリップを6ウェルプレート内の単一の井戸に入れなさい。</li>
	<li>5%CO2および37°Cに設定した加湿細胞培養インキュベーターで外植植物をインキュベートする。外植者が落ち着いてプレート表面に付着できるように、培養を2日間妨げずにしておきます。通常、外植の最大3分の1はプレートに取り付けに失敗する。</li>
	<li>4日後に培地と未接続の外植植物を培養液から取り出し、2 mLの新鮮な培養培地を静かに加え、添付の外植植物を邪魔しないように注意してください。培地は週2回交換する必要があります。</li>
</ol>4. 連続外植物培養による角膜内皮細胞の連続生産
注:10日後に新しい組織培養プレートに取り出し、角膜内皮細胞培養を確立することができます。
<ol><li>外植培養を分剖顕微鏡のステージに置き、外植植物が見えるように照明とズームを調整します。</li>
	<li>滅菌された時計メーカーの鉗子を使用して、それぞれの外植物を培養プレートから軽く摘み取り、取り付け係数でコーティングされ、1 mLの培養培地を含む6ウェル組織培養プレートの新鮮な井戸に移します。</li>
	<li>培養液を2mLの新鮮な培地に置き換える前に、外植植物が新しいプレートの表面に4日間落ち着くようにします。週に2回変化培養培地。</li>
</ol>5. ガラス上の角膜内皮細胞の成長 は、免疫蛍光分析のための円蓋
注:免疫蛍光を用いて分析される予定の細胞培養は、染色手順に従ってガラス顕微鏡スライドに取り付けることができるガラスカバースリップ上に確立する必要があります。
<ol><li>オートクレーブで直径13mmの丸いガラスカバーリップを殺菌するか、70%エタノールに15分間浸し、続いてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に3つのすすを浸します。</li>
	<li>個々のカバーリップを24ウェルの組織培養プレートの井戸に入れ、取り付け係数でコーティングし、各ウェルに0.5mLの培養培地を加えます。</li>
	<li>滅菌された時計メーカーの鉗子を使用して、組織培養プレートから外植植物を取り除き、カバースリップを含む井戸に移します。外植植物が媒体を交換する前に4日間カバースリップに落ち着くようにします。</li>
	<li>必要な潜伏期間の後、彼らの培養井戸内のカバースリップ培養物を固定し、染色する。染色されたカバースリップをガラス顕微鏡スライドに取り付け、蛍光顕微鏡下で分析します。</li>
</ol>6. ディスパーゼIIを用いた角膜内皮細胞のサブ培養
注:大きな線維芽細胞は、この手順を使用して下塗りする前に、6ウェルプレートの外植物培養物から選択的に除去することができる。すべての細胞をサブカルチャー化する場合は、手順 6.2 ~ 6.4 を実行しないでください。この手順の目的は、細胞間接触を可能な限り維持しながら、細胞を新鮮なプレートに移すことを目的としています。セルは穏やかに処理する必要があります。完全にconfluentの井戸は1:2の比率で継がれるべきであり、サブコンフルエント・ウェルは1:1以下の比率で継がれるべきである。
<ol><li>培地を培養液から取り出し、DPBSで短時間リンスします。</li>
	<li>1 mL のヴァーセンを加えます。室温で30sのインキュベート。</li>
	<li>Versene を取り外し、トリプレの 1 mL を追加します。組織培養インキュベーター内で37°Cで3分間インキュベートする。</li>
	<li>位相コントラスト顕微鏡を用いて培養を観察する。培養液を軽くタップして、プレートから細胞を取り除きます。大きな線維芽細胞がプレートから切り離されるとすぐにそれらを除去し、1 mLピペットを使用して、TrypLE.残りの細胞から残留トリプルを洗浄するには、2 mLのDPBSで2回洗浄します。</li>
	<li>1 mg/mL ディスパーゼ II の 1 mL を培養に加え、組織培養インキュベーター内で 1 ~ 2 時間、またはすべての細胞がプレートから切り離されるまでインキュベートします。細胞は徐々に塊のプレートから離れて浮かぶ必要があります。</li>
	<li>1 mLピペットを使用して細胞を集め、50 mL遠心管で20 mLのDPBSに移します。室温で300 x gで5分間遠心分離します。</li>
	<li>上清を取り出し、1 mLの培地で1mLピペットでトリチュレーションして細胞ペレットを静かに再懸濁させます。細胞懸濁液を6ウェルプレートの1つまたは2つのウェルのいずれかに移し、それぞれ1:1または1:2の比率で通過する。</li>
	<li>各ウェルに培地を上に上げて2mLを作り、培養液を組織培養インキュベーターに入れる。週に2回、新鮮な培地を2mLに交換します。</li>
</ol>7. 生体物質膜上の角膜内皮細胞層の成長
注: 以下の手順では、セル培養用に、カスタムメイドの取り付け装置(マイクロボイデンチャンバー)にmembranous生体材料を取り付ける手順について説明します。デバイスの詳細および購入の詳細については、最近の出版物6を参照してください。
<ol><li>その中心に赤いOリングを置くことによってマイクロボイデン室の上部の部屋を組み立てます。</li>
	<li>直径18mmのトレフィンを使用して、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)まな板に生体材料シートからディスクをパンチアウトします。マイクロボイデンチャンバーの上部チャンバーの赤いOリングの上にこのディスクを置きます。</li>
	<li>上部チャンバーに下側チャンバーをねじ込み、その間に生体材料ディスクを固定します。</li>
	<li>組み立てられたマイクロボイデン室を70%エタノールに1時間浸して殺菌します。</li>
	<li>組み立てられたマイクロボイデンチャンバーを10分間滅菌HBSSに完全に浸し、エタノールを除去します。この洗浄手順を 2 回繰り返します。非添加培地で10分間の最終洗浄ステップを行います。</li>
	<li>6ウェルプレートのウェルで滅菌されたマイクロボイデンチャンバーを培養培地に移し、上部チャンバーが最上部であることを保証する。培養液のレベルを調整して、生体材料膜の下面に接触しますが、上部チャンバには流入しません。</li>
	<li>セクション6に概説された手順を使用して角膜内皮細胞の懸濁液を調製する。懸濁液中の十分な細胞密度は、マイクロボイデンチャンバ内の膜上のcm2あたり少なくとも100,000個の細胞の播種密度を可能にするために達成されるべきである。マイクロボイデンチャンバー内の培養表面積は0.5cm2で、容積は100μLです。したがって、500,000個の細胞/mLを含む懸濁液を調製する必要があります。</li>
	<li>マイクロボイデンチャンバーの膜上に100μLの細胞懸濁液(50,000個の細胞)を入れます。培地を完全に浸水させる前に、4時間の組織培養インキュベーターでインキュベートする。培養液を必要な期間インキュベートし、培地を週2回交換する。 注:角膜内皮細胞が生体材料膜の上面に付着すると、マイクロボイデンチャンバーは、下側チャンバーが最も上になるように培養内でうまく反転することができます。さらに多くの細胞をチャンバに加え、膜の他の表面で細胞培養を開始することができる。例えば、角膜間質細胞は、後角膜内に見られるように角膜細胞型の相対的な位置を模倣するように代替表面に容易に適用され得る。</li>
</ol>

<ol><li>Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Historical+Review+and+Update+of+Surgical+Treatment+for+Corneal+Endothelial+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases.</a> Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).</li>
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<li>Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+Review%3A+An+Update+on+the+Culture+of+Human+Corneal+Endothelial+Cells+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation.</a> Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).</li>
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</ol>

著者らは、彼らが競合する財政的利益を持っていないと宣言する。

ヒト角膜内皮細胞の確立と拡大に関連する重要な技術的課題は、培養中にEMTが発生するのを妨げている。EMTは、細胞間接触の喪失によって角膜内皮細胞で引き起こされ得るが、しかし、これらの細胞に対するほとんどの細胞培養プロトコルは、単一細胞の単一細胞への酵素的解離を伴う。ここでは、分離およびサブ培養段階で細胞同士の接触を最小限に抑える角膜内皮細胞の代替細胞培養プロトコルを紹介する。
角膜内皮細胞培養液を確立する方法は、細胞が膜からプレート上に一括移動することを可能にする条件下で、ドナー角膜から内皮/デセメットの膜の外植体を組織培養プレートに配置することを含む。これが成功するためには、外植植物は組織培養プレートにしっかりと付着する必要があり、培養が設定された後数日間プレートを乱さないことでこれが最も良く達成される。ヒトからの角膜内皮細胞培養の確立に成功するもう一つの重要な要因は、ドナーの年齢である。より高い成功率は、30歳未満のドナーから達成される傾向があります。
角膜内皮細胞培養を確立...

角膜は目の前に位置する透明な組織です。それは3つの主要な層で構成されている:外面上皮層、中間間質層、および角膜内皮と呼ばれる内層。角膜内皮は、デセメットの膜と呼ばれる基底膜に座っている細胞の単層であり、基礎となる水性房からストロマに入る流体の量を調節することによって角膜の透明性を維持する。間質内の体液が多すぎると、角膜腫脹、不透明性、視力低下を引き起こす。したがって、内皮は視力を維持するために不可欠である。
角膜内皮は、老化、病気、怪我を含む多くの理由で機能不全になり、現在の治療は移植手術だけです。この手術の間に、内皮およびデセメットの膜は患者の角膜から取り出され、ドナー角膜から得られた内皮およびデセメットの膜の移植片に置き換えられる。多くの内皮移植片はまた、ホスト角膜1への取り扱いと付着を助けるために間質組織の薄い層を含む。
世界的に、移植手術のための角膜ドナー組織の需要は、眼球バンク2によって供給できる量よりも大きい。したがって、この不足を緩和するために使用できる組織工学的な角膜内皮移植を開発するドライブがありました3.この根拠は、現在、個々の角膜からの内皮は単一の患者にのみ移すことができるという事実に基づいているが、角膜内皮細胞が最初に組織培養中の生体材料足場で拡大および増殖した場合、複数の患者を治療するために使用することができる。
組織工学による角膜内皮移植が外科医にとって実現可能な選択肢になる前に取り組む必要がある主な課題は次のとおりです: (1) 高品質の角膜内皮細胞を拡大し、成熟したインビトロでの機能的角膜内皮細胞層、および(2)生体材料足場上の細胞を成長させる技術を確立し、現在使用されているドナー角膜由来移植片と同等またはより優れた組織工学的移植片を産生する。
角膜内皮細胞は、生体内での増殖ポテンシャルが非常に低いが、インビトロ4で分裂するように刺激することができる。それにもかかわらず、それらは、成熟した機能的な内皮層を形成する能力を低下させるインビトロ上皮間葉移行(EMT)を受ける強い傾向を有する。角膜内皮細胞におけるEMTの既知のトリガーには、細胞間接触の特定の成長因子および細胞間接触の喪失5への曝露が含まれる。したがって、サブカルチャー中に酵素的に解離された角膜内皮細胞培養物がEMTに関連する変化を受けることはほぼ避けられない。ここでは、分離、拡張およびサブ培養段階における細胞間接触の破壊を最小限に抑え、EMTの可能性を低減するように設計されたヒトまたは羊角膜内皮細胞の細胞培養方法を提示する。さらに、ドナー角膜由来内皮/デセメットの膜/間質組織移植片に似た組織工学的移植片を、生体材料膜の両側に培養した細胞層をカスタムメイドの実装装置で作り上げ、どのように作り出すことができるかを実証する。

<table><tbody><tr><td>付着因子</td><td>Gibco</td><td>S006100</td><td>組織培養表面のコーティングに使用されるゼラチンを含む1X滅菌溶液です。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>ウシ下垂体抽出物</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td>1つのバイアルには25mgが含まれています。</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>メルク</td><td>C5670</td><td>HBSSに溶解して、1 mMのストック溶液を作ります。フィルター滅菌します。</td></tr><tr><td>遠心分離管、50 ml</td><td>Labtek</td><td>650.550.050</td><td></td></tr><tr><td>コンドロイチン硫酸</td><td>LKT Laboratories</td><td>C2960</td><td>これはウシのコンドロイチン硫酸です。HBSSに溶解して、0.08 g/mLの原液を作ります。ろ過滅菌し、アリコートで凍結します。</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>DPBSに溶解して、2 mg/mLのストック溶液を作ります。ろ過滅菌し、アリコートで凍結します。</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Labtek</td><td>EA043</td><td>100%非変性エタノールは、器具や表面を滅菌するために脱イオン水で70%に希釈する必要があります。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GEヘルスケアオーストラリアPty Ltd</td><td>SH30084.03</td><td>ウシ胎児血清のHyCloneブランドです。</td></tr><tr><td>カバーグラスNo.1、&Oslash; 13 mm</td><td>Proscitech</td><td>G401-13</td><td>滅菌したカバースリップを組織培養用の24ウェルプレートに入れます。</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>塩化カルシウムと塩化マグネシウムを含むハンクの平衡塩溶液、1X。</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸 2-リン酸</td><td>メルク</td><td>A8960</td><td>HBSSに溶解して、150 mMのストック溶液を作ります。フィルター滅菌します。</td></tr><tr><td>マイクロボイデンチャンバー</td><td>CNC Components Pty. Ltd.</td><td>上部リング:QUT-0002-0006、ベースリング:QUT-0002-0007</td><td>どちらのコンポーネントもポリテトラフルオロエセリン(PTFE)で作られています。</td></tr><tr><td>マイクロボイデンチャンバー用Oリング</td><td>ルドウィチシーリングソリューション</td><td>RSB012</td><td>シリコンゴムで構成されています。</td></tr><tr><td>Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>51985-034</td><td>グルタミンを含む還元型血清培地。</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、1X、塩化カルシウムおよび塩化マグネシウムなし。</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>10,000 Units/mL ペニシリンと 10,000 μ を含む 100X 抗生物質溶液;g / mLストレプトマイシン。.</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Sarstedt</td><td>82.14473.001</td><td>滅菌ペトリ皿、92 X 16 mm、組織解剖用。</td></tr><tr><td>組織培養プレート、24ウェル</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3524</td> 表<td>面積が2cm2の24ウェルを含むプレートです。</td></tr><tr><td>組織培養プレート、6ウェル</td><td>Corning Incorporated</td><td>Costar 3516</td><td>表面積が9cm2の6ウェルを含むプレートです。</td></tr><tr><td>TrypLE Select</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>細胞を解離するための1X酵素溶液です。</td></tr><tr><td>Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td>細胞の解離用の1X EDTA溶液。</td></tr><tr><td>時計職人用鉗子</td><td>Labtek</td><td>BWMF4</td><td>No.4 時計用鉗子は、角膜から内皮/デスメ膜のストリップを除去するのに適しています。</td></tr></tbody></table>

生体物質膜上におけるヒトおよび羊角膜内皮細胞層の増殖

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

角膜内皮細胞培養は、細胞間接触の喪失後に上皮間葉転換(EMT)を受ける傾向がある。EMTは、成熟した機能的な層を形成する能力を低下させるので、細胞にとって有害である。ここでは、ヒトおよび羊角膜内皮細胞培養物を確立し、細胞間接触の損失を最小限に抑える方法を紹介する。角膜内皮/デセメットの膜の外植植物は、ドナー角膜から採取され、細胞が一括して培養表面に移動することを可能にする条件下で組織培養に入れられる。培養が確立されると、外植は新鮮なプレートに移され、新しい文化を開始します。ディスパーゼIIは、細胞の塊を組織培養プレートから緩やかに持ち上げて、サブカル化するために使用されます。このプロトコルを使用して確立された角膜内皮細胞培養は、生体材料膜への転移に適しており、動物試験での移植のための組織操作細胞層を生成する。組織培養中に生体材料膜を支持するためのカスタムメイドの装置が記載されており、コラーゲンI型膜の両側に角膜内皮細胞の層と角膜間質細胞の層からなる組織工学的移植片の例が提示される。

ヒトまたはヒツジ角膜から角膜内皮細胞を単離および拡張する方法を図1および図2に要約する。1〜2歳の羊の角膜または30歳未満のヒトドナーに由来するほとんどの外植植物は、1週間以内に添付因子コーティングされた組織培養プレートに付着するが、外植の3分の1までがこの時間内に付着しないことは珍しいことではない。これらの「浮遊」外植は、培養物から除去することができる。30歳以上のヒトドナーからの植物は、プレートに付着する可能性が低く、細胞培養物を産生する可能性も低い。羊およびヒトの外植物から生成された角膜内皮細胞培養物の代表的な画像を図3および図4に示す。外植から出てくる細胞は、一般的にプレートに移動する間、互いに接触したままである。この種の移動は集合細胞移動として知られており、上皮細胞7の特徴である。培養の2週間までに、小さくてぎっしり詰まった細胞のパッチは、羊と...

このプロトコルは、ヒトまたは羊組織の外植植物から角膜内皮細胞培養を確立し、成長させるために必要な重要なステップを記述する。膜状生体材料上の角膜内皮細胞を下塗りする方法も提示されている。

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

この細胞培養プロトコルは、角膜内皮細胞が単離、拡張、およびサブカルチャー中に上皮から間葉間質への移行を受けることを防ぐように設計されています。細胞培養は角膜組織外植から確立され、1つのドナーからの一次細胞の継続的な供給を確実にするために再利用することができる。メーカーの指示を使用して、6ウェルの組織培養プレートのウェルに取り付け係数を塗布します。その後、コード化された各培養培地に1ミリリットルの培養培地を加えます。角膜内皮側を解剖顕微鏡のステージ上の滅菌ペトリ皿に上に置きます。角膜表面が十分に照らされて内皮層を強調できるように照明を調整し、エッジと中央角膜内皮が見えそうになるようにズームを調整します。滅菌された時計メーカーの鉗子を使用して、下層のストロマからデセメットの膜をそっと持ち上げて引き裂きます。培養プレートの準備された井戸の1つに膜ストリップを入れ、すぐにプレートの蓋を交換して汚染のリスクを減らします。最初に内皮の極端な周辺からデシェメットの膜のストリップを取り除き、後で中央領域から、1つの角膜からすべてのストリップを単一の井戸に置きます。終了したら、37°Cと5%の二酸化炭素に設定された加湿細胞培養インキュベーターで外植をインキュベートします。中央に赤いOリングを置くことによってマイクロボイデンチャンバーの上部チャンバーを組み立てます。PTFEまな板のバイオマテリアルシートからディスクをパンチアウトするには、直径18ミリメートルのトレフィンを使用します。次に、マイクロボイデンチャンバーの上部チャンバーの赤いOリングの上にディスクを置きます。下のチャンバーを上の部屋にねじ込み、その間に生物材料のディスクを固定します。そして、それを殺菌するために1時間70%エタノールに組み立てられたマイクロボイデンチャンバーを浸します。浸漬後、チャンバーを滅菌HBSSに10分間完全に浸漬し、エタノールを除去する。その後、チャンバーを培地で10分間洗浄する。そして、6ウェルプレートの井戸の中の培養培地に移し、上の部屋が上向きであることを確認する。生体材料膜の下面に接触するが、上部チャンバーに流れ込まないように、媒体のレベルを調整します。ピペット100マイクロセル懸濁液を膜上のマイクロボイデンチャンバーに、チャンバーを完全に水没させる培地を添加する前に4時間培養インキュベーターにインキュベートする。1〜2歳の羊または30歳未満のヒトドナーの角膜に由来するほとんどの外植物は、1週間以内に付着因子コード化された組織培養プレートに付着した。6週間後、多くの小さな、しっかりと詰まった細胞が外植の隣に存在した。角膜内皮細胞培養中の小さく密閉細胞は、三重で消化に強く、大きな線維芽細胞はそれに対してより敏感である。この違いは、小さな細胞を新しいプレートに移す前に、培養物から大きな細胞を選択的に除去するために利用された。膜内皮細胞培養物に対して免疫白粉分析を行い、密着結合タンパク質であるZO-1と、接着接合タンパク質であるN-カドヘリンを見つけた。同じ抗体を羊細胞とヒト細胞の両方に使用し、両方の種の細胞の形質膜で両方のタンパク質を検出した。カスタムメイドのマイクロボイデンチャンバーは、膜の両側を同時に細胞培養表面として使用することを可能にした。組織工学的細胞構築物の断面図は、一方の表面に角膜内皮細胞の単層を示し、他方に角膜間質細胞の多層培養を示す。このプロトコルを試みるとき、あなたが角膜からデセメットの膜を剥がしているときにあなたの鉗子で内皮を掻き取ることを避けることが重要です。この手順に従って、膜上の角膜内皮細胞層の完全性を、その電気抵抗を測定することによって確認することができる。

growth-human-sheep-corneal-endothelial-cell-layers-on-biomaterial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

細胞単層に機械的刺激によって誘発されるカルシウム波の伝播：ウシ角膜内皮細胞の例

私たちは、細胞の挙動を研究する中でエレクトロスピニング膜内micropocketsを製造するための技術を報告している。具体的には、マイクロ光の組み合わせを記述し、微小特徴を備えたPLGA（ポリ（ラクチド - コ - グリコリド））角膜の生体材料デバイスの製造のためのエレクトロスピニング。...

角膜再生のためのニッチを装備膜を製造するためのマイクロ光とエレクトロスピニングの組み合わせ

ヒトの糖尿病臓器培養角膜におけるアデノウイルス遺伝子治療の例が、これらの角膜における創傷治癒の遅延と上皮幹細胞マーカー発現の顕著な減少の正常化に向けて提示されています。また、幹細胞が豊富な辺縁系上皮培養におけるこのプロセスの最適化についても説明します。...

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

ウシ角膜内皮細胞の初代培養は、角膜内皮間葉移行のメカニズムを調べるために使用しました。さらに、ラット角膜内皮cryoinjuryモデルは、in vivoで角膜内皮間葉移行を示すために使用されました。...

in vitroおよびin vivoモデルで角膜内皮間葉転換を研究します

このプロトコルでは、新規三次元の in vitroモデル、角膜間質細胞と分化した神経細胞が一緒に培養試験と 2...

角膜組織工学: In Vitroのモデル人間の角膜の神経間質相互作用

人間の羊膜と動物モデルにおける組織移植のための準備の上に培養したひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞から成る網膜組織を設計する手法を提案します。...

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D...

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

ここでは、ブタ分割角膜ボタンの調製および栽培のためのステップバイステップのプロトコルが提示される。このオルガノ典型的に栽培された臓器培養モデルは、ヒトドナー角膜に匹敵する15日以内の細胞死亡率を示すので、有毒なデキストランを添加することなく非ヒト角膜の長期培養を可能にする最初のモデルを表す。...

分割角膜ボタンを用いてのブタ角膜内皮器培養モデル

ここでは、腫瘍性角質症(BK)のエクスビボ病モデルとして、ネオジム:YAG(Nd:YAG)レーザーを用いて、デセメットの膜(DM)から角膜内皮細胞(CEC)を剥離するプロトコルを提示する。...

角膜内皮細胞損失の非侵襲的レーザー支援実験モデルの開発

デスメのストリッピングのみは、フックス内皮角膜ジストロフィーに起因する中枢角膜ガッタを有する患者が、末梢細胞が内皮層を再生するためにデスメの膜を剥離する実験手順である。我々は、eFGF1(NM141)によって刺激された治癒の促進を伴うジストロフィー性ヒト角膜 エクスビボ におけるDSOをシミュレートする新規方法論を提示する。...

操作された線維芽細胞増殖因子によって刺激された加速治癒を伴うデスメのストリッピングのみのヒト角膜器官培養モデル1

ここでは、コラーゲンAとトリプシンを用いた逐次消化を通じて、マウス全角膜から高品質な単細胞懸濁液を得るプロトコルを紹介します。この方法は高いRNA完全性を持つ生存可能な単一細胞を生成し、単一細胞RNAシーケンシングやフローサイトメトリyなどの後続応用にも適合します。...

マウス角膜からの単細胞懸濁液採取プロトコル

学ぶ角膜内皮細胞の培養法。ヒトおよび羊の組織片から上皮間葉転移を防ぎながら分離・増殖し、再生医療への応用に向けた持続可能な細胞供給システムを確立する方法です。

生体物質膜上におけるヒトおよび羊角膜内皮細胞層の増殖

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