生体物質膜上におけるヒトおよび羊角膜内皮細胞層の増殖

この細胞培養プロトコルは、角膜内皮細胞が単離、拡張、およびサブカルチャー中に上皮から間葉間質への移行を受けることを防ぐように設計されています。細胞培養は角膜組織外植から確立され、1つのドナーからの一次細胞の継続的な供給を確実にするために再利用することができる。メーカーの指示を使用して、6ウェルの組織培養プレートのウェルに取り付け係数を塗布します。

その後、コード化された各培養培地に1ミリリットルの培養培地を加えます。角膜内皮側を解剖顕微鏡のステージ上の滅菌ペトリ皿に上に置きます。角膜表面が十分に照らされて内皮層を強調できるように照明を調整し、エッジと中央角膜内皮が見えそうになるようにズームを調整します。

滅菌された時計メーカーの鉗子を使用して、下層のストロマからデセメットの膜をそっと持ち上げて引き裂きます。培養プレートの準備された井戸の1つに膜ストリップを入れ、すぐにプレートの蓋を交換して汚染のリスクを減らします。最初に内皮の極端な周辺からデシェメットの膜のストリップを取り除き、後で中央領域から、1つの角膜からすべてのストリップを単一の井戸に置きます。

終了したら、37°Cと5%の二酸化炭素に設定された加湿細胞培養インキュベーターで外植をインキュベートします。中央に赤いOリングを置くことによってマイクロボイデンチャンバーの上部チャンバーを組み立てます。PTFEまな板のバイオマテリアルシートからディスクをパンチアウトするには、直径18ミリメートルのトレフィンを使用します。

次に、マイクロボイデンチャンバーの上部チャンバーの赤いOリングの上にディスクを置きます。下のチャンバーを上の部屋にねじ込み、その間に生物材料のディスクを固定します。そして、それを殺菌するために1時間70%エタノールに組み立てられたマイクロボイデンチャンバーを浸します。

浸漬後、チャンバーを滅菌HBSSに10分間完全に浸漬し、エタノールを除去する。その後、チャンバーを培地で10分間洗浄する。そして、6ウェルプレートの井戸の中の培養培地に移し、上の部屋が上向きであることを確認する。

生体材料膜の下面に接触するが、上部チャンバーに流れ込まないように、媒体のレベルを調整します。ピペット100マイクロセル懸濁液を膜上のマイクロボイデンチャンバーに、チャンバーを完全に水没させる培地を添加する前に4時間培養インキュベーターにインキュベートする。1〜2歳の羊または30歳未満のヒトドナーの角膜に由来するほとんどの外植物は、1週間以内に付着因子コード化された組織培養プレートに付着した。

6週間後、多くの小さな、しっかりと詰まった細胞が外植の隣に存在した。角膜内皮細胞培養中の小さく密閉細胞は、三重で消化に強く、大きな線維芽細胞はそれに対してより敏感である。この違いは、小さな細胞を新しいプレートに移す前に、培養物から大きな細胞を選択的に除去するために利用された。

膜内皮細胞培養物に対して免疫白粉分析を行い、密着結合タンパク質であるZO-1と、接着接合タンパク質であるN-カドヘリンを見つけた。同じ抗体を羊細胞とヒト細胞の両方に使用し、両方の種の細胞の形質膜で両方のタンパク質を検出した。カスタムメイドのマイクロボイデンチャンバーは、膜の両側を同時に細胞培養表面として使用することを可能にした。

組織工学的細胞構築物の断面図は、一方の表面に角膜内皮細胞の単層を示し、他方に角膜間質細胞の多層培養を示す。このプロトコルを試みるとき、あなたが角膜からデセメットの膜を剥がしているときにあなたの鉗子で内皮を掻き取ることを避けることが重要です。この手順に従って、膜上の角膜内皮細胞層の完全性を、その電気抵抗を測定することによって確認することができる。