生きた機能性マウス人工内毛細胞におけるデキストランの標識と取り込み
2020年2月8日
ここでは、機能性メカノトランスダクションチャネルを有する聴覚毛髪細胞における3kDaテキサス赤ラベルデキストランの取り込みを視覚化する方法を提示する。さらに、3〜10kDaのデキトランスは、コルチの器官の毛髪および支持細胞におけるエンドサイトーシスを研究するために使用することができる。
このプロトコルの全体的な目標は、機能的メカノトランスダクションチャネルを有する生毛細胞において、テキサスレッドで蛍光標識された規則的なデキストランの取り込みについて研究することです。この技術の主な利点は、3キロダルトンテキサスレッドデキストランが生きた毛細胞のメカノトランスダクションチャネル機能を評価するために使用できることです。内耳を収穫するには、出生後6日目のマウスの頭蓋骨をライボヴィッツのL-15培地を含む60ミリメートルの培養皿に入れ、外科用ハサミを使用して、前端から頭蓋骨の後端まで、そして外耳管を横切って表面的な切断を行う。
鼻に向かって皮膚を折り畳んで頭蓋骨を露出させ、後ろから頭蓋骨の前部とアイラインを横切って切開します。頭蓋骨を2つの半分に分け、小さなへらを使って脳を取り除く。側頭骨を観察できる場合は、小さいはさみを使ってこれらの骨の周りを切り取って組織を切除する。
新鮮なL-15培地を含む35ミリメートル皿に側頭骨を沈め、広いフィールド接眼眼と外部交流電流ハロゲン光源を備えたステレオ顕微鏡の下に皿を置きます。鉗子を使用して周囲の人工内耳組織、半円形の運河および前庭器官を取り除く。人工内耳が解剖され、新鮮なL-15メディアで新しい皿に入れられたら、外科的鉗子を使用して円形の窓に1つの穿刺傷を作り、尖体人工内耳領域で1つの穿刺を行う。
すべてのコクレアが収穫されたら、新鮮なL-15培地の200マイクロリットルを含む9ウェルガラスうつ病プレートの井戸に組織を入れます。単離組織のデキストラン標識の場合、各サンプルからの培地を、対象の蛍光共役デキストランの1ミリリットル当たり2ミリグラムを添加した新鮮なL-15培地の200マイクロリットルに置き換えます。光から保護された25度の傾いた角度で3次元シェーカーで、室温で2時間、毎分25回転のサンプルをインキュベートします。
インキュベーションの終了時に、1回、HBSSで1回、洗浄ごとに2分間、組織を洗浄します。2回目の洗浄後、室温で30分間4%パラホルムアルデヒドで試料を固定し、HBSSで2回の迅速かつ穏やかな洗浄を行います。2回目の洗浄後、細かい先端鉗子を使用して、人工内骨、螺旋靭帯、およびテクトリアル膜を除去し、HBSSでコルティの単離された器官を洗浄する。
このステップ中に毛髪細胞の組織が損傷しやすいので、透明なテクトリアル膜を除去する際には、細心の注意を払ってください。F-アクチンを標識するには、蛍光標識ファロイジンを100~200希釈してPBS中の0.5%トリトンX-100で透過して、光から保護された室温で30分間透過させます。インキュベーションの終わりに、PBSで1回の洗浄を行い、その後に示すように、洗浄ごとに新鮮なHBSSで組織を2〜3回洗浄します。
適切な取り付け媒体を使用して、コルチ組織の器官をガラス顕微鏡に取り付け、毛髪の立体層をスライドさせ、63X油浸出目的を使用して蛍光共焦点顕微鏡でサンプルを画像化します。テキサスレッドと蛍光結合した3キロダルトンデキストランによる2時間のインキュベーションの後、6匹のマウスの野生型からコルチ外植の器官は、内側と外側の両方の毛細胞の堅牢で特異的な標識を示す。毛細胞の立体および細胞体の画像化は、細胞体に3キロダルトンデキストランテキサスレッドを組み込んだ細胞だけが、ステレオシリアの蛍光標識を実証したことを明らかにした。
重要なことに、メカノトランスダクションチャネルが位置する短い立体列の先端で、高濃縮を伴うステレオシリアに沿って均一な蛍光信号が観察される。毛髪細胞の細胞体および隣接する支持細胞におけるベシクル様構造も観察され、デキストランテキサスレッドもエンドサイトーシスによって取り上げられることを示唆している。より大きな10キロダルトンデキtransはまた、毛細胞および支持細胞の細胞体に小胞様なパターンを産生した。
特に、カルシウムキレートまたはメカノトランスダクションチャネルブロッカーの存在は、毛細胞における立体標識および3キロダルトンデキストランテキサスレッドの取り込みを防ぐ。しかし、小胞様パターンはメカノトランスダクションチャネル遮断の存在下でまだ観察され、しかし、この取り込みのパターンは機能的なMETチャネルとは無関係であることを示している。皮質細胞の臓器を慎重に解剖し、画像処理のために組織を取り付ける前に毛細胞の適切な配向を確認することは非常に重要です。
生きた毛髪細胞および機能的な毛髪細胞のデキストラン標識後、固定組織の免疫染色を行い、目的のタンパク質の特定の細胞タイプを同定することができる。
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概要
本記事では、機能的な機械受容チャネルを持つ聴覚有毛細胞における3 kDa Texas Red標識デキストランの取り込みを可視化する方法を紹介します。この手法により、生存した有毛細胞における機械受容チャネルの機能を評価することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 聴覚研究
背景
- 聴覚有毛細胞におけるメカノトランスダクションの理解は、聴覚機能にとって極めて重要である。
- 異なるサイズのデキストランを利用することで、エンドサイトーシスなどの細胞プロセスを研究することができる。
- コルチ器は、聴覚に関与する蝸牛内の主要な構造である。
- 蛍光標識は、細胞内への取り込みプロセスの可視化に有用である。
研究目的
- 生存している聴覚有毛細胞におけるTexas Red標識デキストランの取り込みを可視化すること。
- これらの細胞における機械刺激受容チャネルの機能を評価すること。
- 有毛細胞および支持細胞におけるエンドサイトーシスの研究へのデキストランの利用を検討すること。
使用された手法
- 生後6日目のマウスから蝸牛を採取する。
- 外科的手法を用いて蝸牛構造を露出させる。
- 聴覚有毛細胞にTexas Red標識デキストランを適用する。
- 蛍光顕微鏡を用いて取り込みを可視化する。
主要な結果
- 生きた有毛細胞におけるデキストラン取り込みの可視化に成功した。
- 機械受容チャネルの機能性を実証した。
- コルチ器におけるエンドサイトーシス機構に関する知見を提供した。
- 聴覚細胞生物学を研究するための信頼性の高い手法を確立した。
結論
- この手法により、聴覚有毛細胞へのデキストランの取り込みを効果的に可視化できる。
- このアプローチは、聴覚における機械刺激受容の理解を深めることができる。
- 今後の研究において、本手法を基盤として関連する細胞プロセスを探索することが可能である。
よくある質問
産業界への実用的な意義
生きた聴覚有毛細胞におけるメカノトランスダクションチャネルの機能を評価することは、難聴治療薬のターゲットバリデーションにおいて極めて重要です。本手法では、蛍光デキストランの取り込みを通じてチャネル活性を直接的かつ定量的に読み取ることができ、感覚伝達に関与するターゲットのメカニズム的なリスク低減が可能になります。このアプローチは、疾患に関連する系において分子機能と細胞表現型を関連付けることで、初期探索段階における予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 生きた有毛細胞における機能的なメカノトランスダクションチャネル活性を直接測定することにより、治療仮説を検証します。
- 運用上の価値： チャネル機能に関するロバストなイメージングベースのアッセイを通じて、ターゲットの生物学的リスク低減を可能にします。
- 予測的価値： METチャネル機能を維持または調節する化合物とそうでない化合物を区別することで、ポートフォリオの選別を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：MET依存的なデキストランの取り込みを機能的バイオマーカーとして確認することにより、後続の化合物スクリーニングに向けたバリデーション済みの生物学的システムを構築します。
- 定量的な出力：チャネル活性と相関し、サンプル間で標準化可能な、立体繊毛および細胞体における測定可能な蛍光信号を生成します。
- 拡張性と再利用性：コルチ器外植片における色素取り込みキネティクスの高コンテンツ解析に向けたプラットフォームの適応をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患への関連性：出生後のマウス蝸牛管（コルチ器）外植片を、聴覚有毛細胞の機能を研究するための疾患関連システムとして使用する。
- トランスレーショナルな連続性：実験の各段階において一貫したMET活性の読み出しを提供することで、基礎研究の知見を前臨床検証へとつなげる。
- リスク調整後の進展：METチャネル遮断を介してデキストランの取り込みを阻害する化合物を特定することにより、開発継続か中止（go/no-go）かの判断根拠を提供する。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットの仮説検証からリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに適合するものであり、化合物スクリーニングおよび最適化に先立ち、メカノトランスダクションチャネルの機能的検証が行われます。
- 発見生物学：有毛細胞におけるMETチャネル依存的な細胞内取り込みを直接的に読み取ることができるため、仮説検証やパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：標準化されたデキストラン標識プロトコルにより、立体線毛および細胞体において再現性のある定量的な蛍光出力を得ることができ、アッセイの準備が可能になります。
- 分析：測定可能な従属変数（立体線毛列の蛍光強度および小胞様のパターン）を提供し、実験条件や化合物による効果の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：同じMET活性の読み取り法を用いて疾患モデルにおけるターゲットエンゲージメントを評価することで、前臨床段階への継続性を確保します。
- 企業内での再利用：聴覚研究プログラム全体で感覚伝達機能を評価するための、再利用可能な能力を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：メカノトランスダクション経路解析におけるメカニズムの曖昧さを排除することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を向上させる。
- 運用的価値：デキストラン取り込みに関するインキュベーション、洗浄、およびイメージングのパラメータを定義することにより、標準化と再現性を確保する。
- 戦略的価値：ターゲットの変調を機能的な有毛細胞のリードアウトに結びつけることで、go/no-goの意思決定を改善し、後段階における生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響：疾患関連システムにおけるMET依存的なデキストラン取り込みへの影響に基づき、化合物のリスク調整済み優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- マウス蝸牛の解剖、コルチ器の単離、および蛍光顕微鏡観察に関する専門知識が必要です。
- Texas Red 蛍光に適したレーザーおよび検出設定を備えた共焦点イメージング設備の利用が前提となります。
- ラボ間でデキストラン濃度、インキュベーション時間、およびシェーカー条件を標準化する必要があります。
- 異なる哺乳類モデルや発生段階に本手法を適用する場合、条件の適応的な調整を検討する必要があります。
- 生体組織の調製が必要であること、および解剖中の機械的・環境的ストレスに対する有毛細胞の感受性が制限要因となります。
