腎皮質抽出物における血管内皮増殖因子と黄体形成ホルモンとの線形関係の実証

我々のプロトコルは、牛およびブタからの腎臓抽出物の使用が、特に血管内皮成長因子と他の分析物との間の相関を調べる腎生理学の研究のための優れた経済的資源であることを観察する。臓器血管新生に不可欠な成長因子であるVEGFを他のタンパク質と相関付けるのは常に課題でした。この技術は、我々は、VEGFとホルモンなどの分析物との間の関連を調べることができます。.

これは確かにこの重要な成長要因に関する知識の基盤を進めるでしょう。この方法は、このビデオで言及されているもの以外の腎臓皮質抽出物の他の分析物を相関付けるのに有用であり得る。視覚的なデモンストレーションは、他の人がサンプリングエラーなしで再現可能な結果を得るのに役立ちます。

新鮮な組織の使用は、この技術の成功に不可欠です。動物から殺処分後すぐに新鮮な腎臓全体を得ることが重要です。常に氷の上の実験室に組織を移す。

滅菌はさみ、鉗子、ナイフ、ペトリ皿を使用して腎臓を解剖し、必要な組織部分を切除します。矢状面に沿って腎臓を半分にそっと切り、腎臓の中心にある皮質領域から組織の一部を切断する。ナイフで組織を小片にミンチし、氷冷1X RIPAリシス抽出バッファーの1ミリリットルでマイクロフュージチューブに転送します。

特定のサンプルの詳細でチューブにラベルを付け、氷の上に置きます。無菌プローブを備えたハンドヘルドホモジナイザーを使用して、チャンクが見えなくなるまで1〜2分間組織を均質化し、その後すぐにチューブを9、600倍のgで摂氏4度で5分間遠心します。遠心分離後、ELISAと全タンパク質分析のためにサンプルの別々のアリコートを調製し、複数の凍結/解凍サイクルを回避します。

アッセイを開始する前に、すべての試薬とアッセイプレートを室温に持ち込み、余分な井戸を取り除き、さらに使用するまで摂氏4度で保管してください。20倍の洗浄バッファーを200ミリリットルに希釈し、水を二重蒸留して、溶液を使わずに空の井戸を設置します。標準またはサンプルの50マイクロリットルと各ウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートの別の50マイクロリットルを追加し、すぐに各ウェルに抗体溶液の50マイクロリットルを追加し、プレートを密封します。

プレートを混ぜて摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、200マイクロリットルの洗浄バッファーで各ウェルを洗浄します。各ウェルに基板Aと基板Bの50マイクロリットルを加え、側面をタップしてプレートを穏やかに混ぜ、37°Cで15分間暗闇の中で密封してインキュベートします。

各ウェルに50マイクロリットルのストップ溶液を加えます。プレートを軽くタップし、分光光度計で450ナノメートルの吸光度を読み取ります。前に述べたように試薬と洗浄バッファーを準備し、各ウェルに標準またはサンプルの100マイクロリットルを追加し、プレートを密封し、よく混合し、37°Cで2時間インキュベートします。

各ウェル内の液体を取り出し、100マイクロリットルの検出試薬A.Sealプレートを追加し、さらに1時間インキュベートします。次に、400マイクロリットルの洗浄バッファーで各井戸を洗い、次に各ウェルに90マイクロリットルの基質溶液を加え、プレートを軽くタップし、摂氏37度でさらに1時間インキュベートします。最後のインキュベーションの後、各ウェルに50マイクロリットルのストップ溶液を加え、プレートを軽くタップし、分光光度計で450ナノメートルの吸光度を読み取ります。

標準的なBSAアッセイで牛およびブタ腎臓抽出物の総タンパク質を推定し、この推定値を使用してLHおよびVEGF-A-ELISAの結果を正常化します。LHおよびVEGFの平均および中央値レベルは、動物および男女の両方について計算された。データの正規性を検証した後、LHとVEGFの関係を調べるために線形回帰モデルを利用した。

LHは、ウシとブタの腎臓の両方でVEGFの強力かつ重要な予測値であることが判明しました。この手順を試みる際には、各組織の同一領域をサンプルすることを覚えておくことが重要です。同様の手順は、組織の任意のタイプを抽出するために使用することができます.

使用する組織の全タンパク質抽出物によって検体を正規化することを忘れないでください。