Name: 腎皮質抽出物における血管内皮増殖因子と黄体形成ホルモンとの線形関係の実証 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: 学ぶ腎臓生理学におけるVEGFとLHの相関関係。牛と豚の腎皮質抽出物を用いたELISA法と線形回帰分析により、血管新生に関わる成長因子とホルモンの関連性を解明する信頼性の高い手法を紹介します。

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著者らは、牛と豚の腎臓を提供したショルのスローターハウス(ブリスフィールド、MI)に感謝します。この研究には助成金は使われていた。

この研究には生きた動物や実験動物は使われなかった。
1. 組織の取り扱い
<ol><li>アバトワールからの殺処分直後にウシとブタの全腎臓を調達する。実験室への氷の上の輸送。</li>
	<li>実験室に到着すると、50 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩酸(PBS)で腎臓をすすすします。血液を完全に除去するには、この手順 2x を繰り返します。</li>
	<li>さらに抽出するまで、腎臓を氷の上に置く(または冷蔵する)。</li>
</ol>2. 腎臓の解剖
<ol><li>無菌のはさみ、鉗子、ナイフ、ペトリ皿を使用して腎臓を解剖し、必要な組織部分を切除します。</li>
	<li>腎解剖の前にRIPAリシスバッファーを準備します。5 mM NaCl、0.5 M EDTA、1 M トリス(pH = 8.0)、NP-40(ID + GEPAL CA-630)、10%デオキシコール酸ナトリウム、および10%SDSを二重蒸留水に溶解し、十分に混合します。使用しないときはRIPAリシス緩衝液を冷蔵する。</li>
	<li>腎臓をゆっくりと半分に切り(矢状面)、腎臓の中央の皮質領域(湿った重量で80〜100mgの重量)から組織(50-70 mm2)を切った。</li>
	<li>組織ブロックをナイフで細かく刻み、均質化プロセスを支援します。</li>
	<li>組織をミンチした後、1mLの氷冷1x RIPAリシス抽出バッファーを用いてマイクロフュージチューブに移す。さらに抽出するまでチューブを氷の中に置きます。</li>
</ol>3. 組織均質化
<ol><li>マイクロフュージチューブに、組織上清の収集のための特定のサンプルの詳細をラベル付けします。</li>
	<li>滅菌プローブでハンドヘルドホモジナイザーを使用し、組織の塊が見えなくなるまで、寒い条件(アイスバケツ上のサンプル)で1〜2分間組織を均質化します。</li>
	<li>冷蔵遠心分離機中の遠心分離のために組織抽出物を直ちに被験者し、4°Cで5分間9,600 x gである。</li>
	<li>遠心分離機からチューブを取り出し、アイスバケツの上に置きます。</li>
	<li>新しいラベル付きマイクロフュージチューブに上清を収集し、氷の上に保存します。ペレットを捨てます。</li>
	<li>LHおよびVEGF-A酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および総タンパク質分析のための上清の別々のアリコートをそれぞれ調製し、凍結融解サイクルを回避します。</li>
</ol>4. 牛と豚 LH ELISA アッセイ
<ol><li>市販の黄体形成ホルモン(LH)ELISAキットに含まれるすべてのELISAアッセイ成分を2~8°Cで保管してください(材料表を参照)。これには、抗体、HRP-コンジュゲート、アッセイプレート(96ウェル)、キャリブレータ、洗浄緩衝液(20x濃縮物)、基板A、基板B、および停止溶液が含まれる。製造元の指示に従ってすべての試薬を準備します。</li>
	<li>アッセイを開始する前に、すべての試薬とアッセイプレートを室温(RT)に持ち込みます。アッセイ、シール、未使用の井戸の使用に必要な数の井戸を使用し、使用するまで4°Cに保ちます。</li>
	<li>洗浄バッファー(20x濃縮物の15 mL)を二重蒸留水で300mLに希釈する</li>
	<li>解決策なしで空白の井戸を設定します。</li>
	<li>各ウェルに50μLの標準またはサンプルを加え(n =2)、さらに50μLのホースラディッシュペルオキシダーゼ(hrp)コンジュゲートを各ウェルに加えます。直ちに各ウェルにさらに50μLの抗体溶液を加えます。プレートを密封し、よく混ぜ、37°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>1x洗浄バッファー(200°L/ウェル)で井戸を洗浄し、4xを繰り返します。</li>
	<li>基板Aの50μLと基板Bの50°Lをそれぞれウェルに加え、側面のプレートを軽くタップしてよく混ぜます。プレートを密封し、暗闇の中で37°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>各ウェルに50μLのストップ溶液を加え、プレートを軽くタップし、450nm波長に設定された分光光度計を使用してプレートを読み取ります。</li>
	<li>ウシとブタのLHレベルを総タンパク質に正規化します(セクション6を参照)。</li>
</ol>5. 牛と豚 VEGF-A ELISA アッセイ
<ol><li>市販の血管内皮成長因子-A ELISAキットに含まれるすべてのELISAアッセイ成分を2〜8°Cで保管してください(材料表を参照)。これには、抗体、HRP-コンジュゲート、アッセイプレート(96ウェル)、キャリブレータ、洗浄緩衝液(20x濃縮物)、基板A、基板B、および停止溶液が含まれる。製造元の指示に従ってすべての試薬を準備します。</li>
	<li>アッセイを開始する前に、すべての試薬とアッセイプレートをRTに持ち込み、アッセイに必要な数の井戸を使用し、シールし、使用するまで未使用のウェルを4°Cに保ちます。</li>
	<li>洗浄バッファー(20x濃縮物の15 mL)を二重蒸留水で300mLに希釈する</li>
	<li>各ウェルに標準またはサンプルの100 μLを追加します(n = 2)。プレートを密封し、よく混ぜ、37°Cで2時間インキュベートします。</li>
	<li>各ウェルの液体を取り出し、検出試薬Aの100°Lを各ウェルに加え、プレートを密封し、37°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>1x洗浄バッファー(400°L/ウェル)で井戸を洗浄し、4xを繰り返します。</li>
	<li>検出試薬Bを100μLずつよく加え、側面のプレートを軽くタップしてよく混ぜます。プレートを密封し、37°Cで1時間プレートをインキュベートします。</li>
	<li>1x洗浄バッファー(400°L/ウェル)で井戸を洗浄し、4xを繰り返します。</li>
	<li>90μLの基板溶液を各ウェルに加え、プレートを軽くタップし、37°Cで1時間インキュベートします。</li>
	<li>各ウェルに50μLのストップ溶液を加え、プレートを軽くタップし、450nm波長に設定された分光光度計を使用してプレートを読み取ります。</li>
	<li>ウシとブタVEGF-Aレベルを総タンパク質に正規化する(セクション6)。</li>
</ol>6. 総タンパク質推定
<ol><li>メーカーの推奨事項に従って、市販のキット(材料表を参照)を使用して、標準ウシ血清アルブミン(BSA)アッセイによるウシおよびブタ腎臓抽出物の総タンパク質を推定します。</li>
</ol>7. 統計分析
<ol><li>各検検の平均、中央値、標準偏差を計算します。</li>
	<li>コルモゴロフ・スミルノフ検定を利用した通常のサンプル分布の発散をテストし、使用時にパラメトリックと.ノンパラメトリック統計検定。データが正規分布している場合は、パラメトリック検定を使用して統計的検定を実行します。</li>
	<li>適切な状況 (正規データ分布など) では、回帰モデルを使用して LH と VEGF-A の間の線形関係を調べます。</li>
</ol>

<ol><li>Advani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+VEGF+in+maintaining+renal+structure+and+function+under+normotensive+and+hypertensive+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).</li>
<li>Majumder, S., Advani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+and+the+diabetic+kidney%3A+More+than+too+much+of+a+good+thing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+and+its+Complications%22%5BJournal%5D)">VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing.</a> Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).</li>
<li>Liu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+vascular+endothelial+growth+factor+in+kidney+leads+to+progressive+impairment+of+glomerular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).</li>
<li>Eremina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomerular-specific+alterations+of+VEGF-A+expression+lead+to+distinct+congenital+and+acquired+renal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases.</a> Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).</li>
<li>Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+endothelial+growth+factor%3A+basic+science+and+clinical+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress.</a> Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitreous+Levels+of+Luteinizing+Hormone+and+VEGF+are+Strongly+Correlated+in+Healthy+Mammalian+Eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes.</a> Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).</li>
<li>Babitha, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luteinizing+hormone%2C+insulin+like+growth+factor-1%2C+and+epidermal+growth+factor+stimulate+vascular+endothelial+growth+factor+production+in+cultured+bubaline+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).</li>
<li>Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+the+Primate+Ovulatory+Follicle+Is+Stimulated+by+Luteinizing+Hormone+via+Prostaglandin+E2%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2.</a> Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).</li>
<li>Movsas, T. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confirmation+of+Luteinizing+Hormone+%28LH%29+in+Living+Human+Vitreous+and+the+Effect+of+LH+Receptor+Reduction+on+Murine+Electroretinogram%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram.</a> Neuroscience. 385, 1-10 (2018).</li>
<li>Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+Signaling+by+the+Luteinizing+Hormone+Receptor+Reduces+Ocular+VEGF+and+Retinal+Vascularization+during+Mouse+Eye+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development.</a> Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).</li>
<li>Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+a+luteinizing+hormone%2Fchorionic+gonadotropin+%28LH%2FCG%29+receptor+precursor+in+a+human+kidney+cell+line+stably+transfected+with+the+rat+luteal+LH%2FCG+receptor+complementary+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA.</a> Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).</li>
<li>Lei, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+luteinizing+hormone%2Fhuman+chorionic+gonadotropin+receptor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene.</a> Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).</li>
<li>Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+vascular+endothelial+growth+factor+%28VEGF%29+in+renal+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology.</a> Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).</li>
<li>Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mature+luteinizing+hormone+receptor+in+rodent+urogenital+and+adrenal+tissues+is+developmentally+regulated+at+a+posttranslational+level%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level.</a> Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).</li>
<li>Ondruschka, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-mortem+in+situ+stability+of+serum+markers+of+cerebral+damage+and+acute+phase+response%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response.</a> International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).</li>
<li>Swain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+post-mortem+interval%3A+A+comparison+between+cerebrospinal+fluid+and+vitreous+humour+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Forensic+and+Legal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry.</a> Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).</li>
<li>Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+method+for+the+detection+of+residues+of+amphenicol+antibiotics+in+bovine%2C+ovine+and+porcine+kidney+by+optical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor.</a> Talanta. 172, 120-125 (2017).</li>
<li>Konstantinou, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme-Linked+Immunosorbent+Assay+%28ELISA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).</a> Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).</li>
<li>Levesque, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+urine+vascular+endothelial+growth+factor+levels+are+associated+with+mechanical+ventilation%2C+bronchopulmonary+dysplasia+and+retinopathy+of+prematurity%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity.</a> Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).</li>
<li>Leviton, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antecedents+and+early+correlates+of+high+and+low+concentrations+of+angiogenic+proteins+in+extremely+preterm+newborns%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns.</a> Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).</li>
<li>Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+the+vitreous+fluid+analysis+in+the+translational+research+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy.</a> Mediators of Inflammation. , 872978(2012).</li>
<li>Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+molecular+and+genomic+biomarkers+of+retinal+drug+efficacy%3A+use+of+ocular+fluid+sampling+to+evaluate+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF.</a> Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).</li>
</ol>

ジエットチック研究所(ZRI)は民間(営利目的)の研究機関であり、タミー・モフサス博士(ZRIの創設者兼ディレクター)は、眼疾患の治療にゴナドトロピン拮抗薬を使用するための保留中の特許出願と検証済みの特許を持っていますそして糖尿病。ZRIの従業員(生化学者)であること以外に、A.ムトゥサミー博士は報告する他の財政的な矛盾はありません。A. アリバラガン(ZRIのサマーインターン、ミシガン大学の学部生)は、報告する他の財政的な矛盾はありません。

動物の死の直後にアバトワールから腎臓を調達することは、この方法論の成功の鍵です。これは、人間の死体の代わりに牛や豚からの臓器を利用する主な利点です。通常、死亡時からヒトの死体器官が調達されるまで、少なくとも12〜24時間の遅延がある。身体器官の化学組成は2時間後の死後15、16内で有意に変化するので、ヒト死体腎におけるVEGF研究は実際の状況を反映しない可能性がある。このプロトコルは、抽出後の氷上の動物器官の即時調達と配置の重要性を大きく強調しているが、他の研究者もこのステップを優先するかどうかは分かっていない。例えば、最近の研究の方法論セクション(抗生物質残基の検出のためにウシおよびブタ腎臓を利用する)は、動物の死と臓器17の調達/冷凍との間の時間遅延を指定しなかった。
本研究では、市販の種特異的ELISを用いて目的の測定値(VEGFおよびLH)を測定する。ELISAは非常に敏感で、アッセイを簡単に実行でき、堅牢な結...

血管内皮増殖因子A(VEGF-A)は、腎臓および他の器官1、2における血管新生および血管透過性を調節するのに役立つ(以下、VEGF−AはVEGFと呼ばれる)。腎臓のVEGFレベルは、厳格な恒静制御下にある。腎VEGFレベルが上昇または抑制されると、腎臓が機能不全を起こす可能性があります。例えば、出生後3週間以内に、VEGFに対するポドサイト特異的ヘテロ接合性を有するマウスは、子宮内皮症および無血球体(すなわち、ヒト子癇前症に見られる腎病変)を発症し、そして最終段階の腎不全は生後3ヶ月までにこれらのヘテロジゴスで起こる。ポドサイト特異的ホモ接合性ノックアウトは、生後1日以内に水腫および腎不全で死亡する3,4.
一方、腎VEGFの過剰発現は、タンパク尿および糸球体肥大3、4を引き起こす。例えば、VEGFを過剰発現するトランスジェニックウサギは、腎症の初期段階で糸球体濾過率の増加を伴う進行性タンパク尿を示し、続いて後の段階3で糸球体濾過率の低下を示す。糖尿病成人における末期腎疾患の主な原因である糖尿病性腎症は、VEGF調節不全2、5に強く関連している。病理学的条件下でVEGF発現を誘導する際の低酸素症の役割に多大な注意が払われている5.しかしながら、生理学的条件下でVEGFを支配する因子(腎臓および他の器官の両方)は、よく理解されていない2、6。生理学的および病理学的VEGF調節に関与するこれらの因子(酸素を除く)を同定することは重要な取り組みである。
前血管新生ホルモンである黄体形成ホルモン(LH)は、卵巣および精巣7、8などの生殖器官における生理学的VEGF発現を調節するのに役立つ。以前の研究は、LHはまた、目6、9、10などの非生殖器官のVEGFを調節するのに役立つという証拠を提供しています。LH受容体は、腎臓11、12の髄質および皮質に見られる。なお、腎尿細管上皮細胞は、LH受容体と同様に、VEGF11、12、13、14を発現する。これら2つの観察を一緒に取り、我々はLHが腎臓13、14のVEGF発現を調節するのにも役立つと仮定した。このLH/VEGF関係の証拠を提供するために、提示されたプロトコルは、LHレベルが腎臓のVEGFレベルを予測できることを示すことを目的としています。腎臓に関する多くの以前のVEGF関連の調査は、低次哺乳動物モデル(すなわち、げっ歯類およびウサギ)2を使用している。この研究を人体に翻訳するために、この研究は、高次哺乳動物(ここでは、ウシとブタモデル)におけるVEGFとLHの関係を調べる。この目的を遂行するために、ウシおよびブタ腎臓の皮質領域から総タンパク質リサートを調製した。

<table><tbody><tr><td>ウシLH ELISAキット</td><td>MyBiosource、カリフォルニア州サンディエゴ。</td><td></td><td></td>MBS700951</tr><tr><td>ウシ VEGF-A ELISA キット</td><td>MyBiosource、カリフォルニア州サンディエゴ</td><td></td><td></td>MBS2887434</tr><tr><td>マイクロBCAタンパク質アッセイキット</td><td>ThermoFisher Scientific Inc、オハイオ州コロンバス。</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>豚LH ELISAキット</td><td>MyBiosource、カリフォルニア州サンディエゴ。</td><td></td><td></td>MBS009739</tr><tr><td>ブタVEGF-A ELISA</td><td>Ray Biotech、ジョージア州ノークロス。</td><td>ELP-VEGFA-1</td><td></td></tr><tr><td>RIPA溶解および抽出バッファー</td><td>ThermoFisher Scientific Inc、オハイオ州コロンバス。</td><td>89901</td><td></td></tr></tbody></table>

腎皮質抽出物における血管内皮増殖因子と黄体形成ホルモンとの線形関係の実証

Demonstrating a Linear Relationship Between Vascular Endothelial Growth Factor and Luteinizing Hormone in Kidney Cortex Extracts

血管内皮増殖因子(VEGF)は、腎臓の血管新生および血管透過性を制御するのに役立つ。糖尿病性腎症などの腎疾患は、腎臓におけるVEGF調節不全と関連している。腎臓の生理学的条件下でVEGFを支配する因子はよく理解されていません。前血管新生ホルモンである黄体形成ホルモン(LH)は、生殖器官の生理学的VEGF発現を調節するのに役立ちます。LH受容体が腎臓に見つかっていることを考えると、私たちは、ジーチック研究所で、LHも腎臓のVEGF発現を調節するのに役立つと仮定しています。証拠を提供するために、我々はLHレベルが哺乳動物腎臓のVEGFレベルを予測できることを示すことを目的とした。腎臓を含むほとんどのVEGF関連の調査は、モデルとして低次哺乳動物(すなわち、げっ歯類とウサギ)を使用しています。この研究を人体に翻訳するために、高次哺乳動物(ウシとブタモデル)におけるVEGFとLHの関係を調べることにした。このプロトコルは、腎皮質からの総タンパク質リサートを使用します。この方法の成功の鍵は、死後すぐに食肉処理場の動物からの腎臓の調達だけでなく、総タンパク質による検体レベル(腎臓抽出物中)の正常化が含まれます。この研究は、ウシとブタの両方の腎臓におけるLHとVEGFの間の有意な線形関係を示すに成功した。結果は2つの異なる種で再現可能である。この研究は、牛や豚からの腎臓抽出物の使用が、特にVEGFと他のアナライトとの相関関係を調べるために、腎生理学の研究のための優れた、経済的、豊富な資源であることを支持する証拠を提供する。

動物の種類および性別によるLHおよびVEGFの平均および中央値レベルを表1に示す。コルモゴロフ・スミルノフ法線検定によるデータの正規性を検証した後、線形回帰モデルを利用してLHとVEGFの関係を調べた。LHは、牛と豚の腎臓の両方でVEGFの強力かつ有意な予測変数であることが判明しました(ウシ腎臓モデル:n =7、R2 =0.86、p = 0.002;豚腎臓モデル:n = 7;R2 = 0.66、p = 0.025)。
LH/VEGF線形関係を図1(ウシ回帰モデル)と図2(豚回帰モデル)に示す。牛の線形方程式は次のとおりです: VEGF レベル = 2.156 x LH レベル + 68.75.ブタ線形方程式は次のとおりです: VEGF レベル = 196.7...

ここで提示するプロトコルは、皮質腎臓抽出物調製および全タンパク質正常化を利用して、哺乳動物腎臓における血管内皮成長因子と黄体形成ホルモンとの相関関係を実証するためのプロトコルである。

Vascular endothelial growth factor (VEGF) helps to control angiogenesis and vascular permeability in the kidney. Renal disorders, such as diabetic ...

我々のプロトコルは、牛およびブタからの腎臓抽出物の使用が、特に血管内皮成長因子と他の分析物との間の相関を調べる腎生理学の研究のための優れた経済的資源であることを観察する。臓器血管新生に不可欠な成長因子であるVEGFを他のタンパク質と相関付けるのは常に課題でした。この技術は、我々は、VEGFとホルモンなどの分析物との間の関連を調べることができます。.これは確かにこの重要な成長要因に関する知識の基盤を進めるでしょう。この方法は、このビデオで言及されているもの以外の腎臓皮質抽出物の他の分析物を相関付けるのに有用であり得る。視覚的なデモンストレーションは、他の人がサンプリングエラーなしで再現可能な結果を得るのに役立ちます。新鮮な組織の使用は、この技術の成功に不可欠です。動物から殺処分後すぐに新鮮な腎臓全体を得ることが重要です。常に氷の上の実験室に組織を移す。滅菌はさみ、鉗子、ナイフ、ペトリ皿を使用して腎臓を解剖し、必要な組織部分を切除します。矢状面に沿って腎臓を半分にそっと切り、腎臓の中心にある皮質領域から組織の一部を切断する。ナイフで組織を小片にミンチし、氷冷1X RIPAリシス抽出バッファーの1ミリリットルでマイクロフュージチューブに転送します。特定のサンプルの詳細でチューブにラベルを付け、氷の上に置きます。無菌プローブを備えたハンドヘルドホモジナイザーを使用して、チャンクが見えなくなるまで1〜2分間組織を均質化し、その後すぐにチューブを9、600倍のgで摂氏4度で5分間遠心します。遠心分離後、ELISAと全タンパク質分析のためにサンプルの別々のアリコートを調製し、複数の凍結/解凍サイクルを回避します。アッセイを開始する前に、すべての試薬とアッセイプレートを室温に持ち込み、余分な井戸を取り除き、さらに使用するまで摂氏4度で保管してください。20倍の洗浄バッファーを200ミリリットルに希釈し、水を二重蒸留して、溶液を使わずに空の井戸を設置します。標準またはサンプルの50マイクロリットルと各ウェルにホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートの別の50マイクロリットルを追加し、すぐに各ウェルに抗体溶液の50マイクロリットルを追加し、プレートを密封します。プレートを混ぜて摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、200マイクロリットルの洗浄バッファーで各ウェルを洗浄します。各ウェルに基板Aと基板Bの50マイクロリットルを加え、側面をタップしてプレートを穏やかに混ぜ、37°Cで15分間暗闇の中で密封してインキュベートします。各ウェルに50マイクロリットルのストップ溶液を加えます。プレートを軽くタップし、分光光度計で450ナノメートルの吸光度を読み取ります。前に述べたように試薬と洗浄バッファーを準備し、各ウェルに標準またはサンプルの100マイクロリットルを追加し、プレートを密封し、よく混合し、37°Cで2時間インキュベートします。各ウェル内の液体を取り出し、100マイクロリットルの検出試薬A.Sealプレートを追加し、さらに1時間インキュベートします。次に、400マイクロリットルの洗浄バッファーで各井戸を洗い、次に各ウェルに90マイクロリットルの基質溶液を加え、プレートを軽くタップし、摂氏37度でさらに1時間インキュベートします。最後のインキュベーションの後、各ウェルに50マイクロリットルのストップ溶液を加え、プレートを軽くタップし、分光光度計で450ナノメートルの吸光度を読み取ります。標準的なBSAアッセイで牛およびブタ腎臓抽出物の総タンパク質を推定し、この推定値を使用してLHおよびVEGF-A-ELISAの結果を正常化します。LHおよびVEGFの平均および中央値レベルは、動物および男女の両方について計算された。データの正規性を検証した後、LHとVEGFの関係を調べるために線形回帰モデルを利用した。LHは、ウシとブタの腎臓の両方でVEGFの強力かつ重要な予測値であることが判明しました。この手順を試みる際には、各組織の同一領域をサンプルすることを覚えておくことが重要です。同様の手順は、組織の任意のタイプを抽出するために使用することができます.使用する組織の全タンパク質抽出物によって検体を正規化することを忘れないでください。

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生物学

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腎皮質抽出物における血管内皮増殖因子と黄体形成ホルモンとの線形関係の実証

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