腸透過性と上皮細胞流れ性能を評価する生体内顕微鏡ベースのアプローチ
2020年12月3日
生体内顕微鏡を利用して、ここで提示される方法は、生きている動物の腸上皮細胞脱落のリアルタイム視覚化を可能にする。従って、麻酔化マウスの局所染色された腸粘膜(アクリフラビン及びローダミンB-デキストラン)は、共焦点顕微鏡を用いて単細胞分解能まで画像化される。
このプロトコルは、生体内顕微鏡を用いて、腸組織を単一細胞分解能までリアルタイムに可視化し、細胞脱落などの非常に動的なプロセスの研究を可能にします。標準的なトレーサー実験と組み合わせて、このプロトコルは、生体内の腸透過性障害とパラおよびトランス細胞透過性の区別の両方の同定を可能にする。このプロトコルは、様々な組織内の関心のある他の非常に動的な細胞プロセスを視覚化するための追加のインビタルな顕微鏡法の開発の基礎として使用することができる。
この方法の視覚的なデモンストレーションは、外科的準備ステップを理解し、腸粘膜表面上の画像取得を容易にする方法で生きている動物を配置するために不可欠である。手順を開始する前に、共焦点レーザー顕微鏡のベースとスキャナボックスをオンにし、コンピュータの電源を入れるには、スタートを押します。イメージ取得ソフトウェアを起動し、適切な構成を選択します。
適切なイメージ解像度を設定するには、構成、ハードウェア、解像度、ビット深度、および 12 を選択します。取得メニューで、画像取得モードとして [XYZT] を選択し、目的を 20 または 40X に設定します。シーク集録設定を設定するには、[シーク] をクリックして、フレーム間で追加および選択します。
シーケンス 1 を構成するには、可視のレーザー ボックスをオンにします。フォトマルチプライヤチューブを1個に設定し、発光波長を定義します。シーケンス 2 を構成するには、可視レーザー ボックスをオンにします。
フォトマルチプライヤチューブを2本オンに設定し、発光波長を定義します。次に、適切なレーザーをアクティブにします。足の指のピンチに対する応答の欠如を確認した後、綿棒を使用して麻酔をかけ、腹部の左心室領域に1センチメートルの切開を行います。
鉗子を使用して、腸の3〜5センチメートルのセグメントを外装します。腸管の上部と下部に2つの小さな切開を行い、腸管腔にガラスマイクロピペットを導入します。次に電気カエタライゼーションを使用して、抗腸間膜側に沿って縦方向に外形化された腸管セグメントを開き、粘膜を露出させます。
食前液でティッシュを短時間すすいで、便の内容を取り除きます。腸粘膜表面の染色のために、1ミリリットルのアクリフラビン溶液を1ミリリットルの1ミリリットルの液滴を露出した粘膜表面に塗布し、残りの溶液をPBSで洗い流す前に3分間染色を可能にする。次に、PBSで洗浄する前に、3分間のインキュベーションのために、液滴中の1ミリリットルローダミンデキストラン溶液あたり2ミリグラムの100マイクロリットルを粘膜に塗布する。
次に、麻酔したマウスの上に、37°Cの生理食音をすすいでチャンバーに取り付けたカバースライドに置き、必要に応じて位置を調整し、逆顕微鏡ステージに準備を置きます。マウスをステージに置いた直後に、光源をオンにして、照明軸が組織の準備に焦点を合わせるまでXY位置を調整します。視野を選択するには、適切なフィルタ キューブを選択します。
シャッターを開け、マクロとマイクロホイールを使用して腸粘膜の表面に焦点を当てます。XY 位置を調整して、ビューのフィールド内で複数の絨毛を視覚化できる領域を見つけ、フィルターキューブを変更して、ローダミンデキストラン染色がその領域にも見えることを確認します。対象領域が特定されたら、画像取得を開始し、シーケンス 1 を選択して、シーケンス 1 のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。
次に、シーケンス2を選択し、シーケンス2のレーザーパワー、ゲイン、オフセットを調整します。Z スタックの範囲を定義するには、Z スタックのドロップオフ メニューを開きます。Z-access コントロールを使用して粘膜の表面に焦点を合わせ、[開始]をクリックします。
信号がまだ検出可能な場所の下限に焦点を当てて、終了をクリックします。2 つの連続したタイム ポイントの 2 分より長いタイムラプスを避ける Z スタックの数を定義し、時間メニューを開いて最小化を選択し、停止するまで取得します。行平均を定義するには、シーク 1、行平均 2、シーク 2、および行平均 2 を選択します。
次に、画像を取得するには、フォーマットを1024 x 1024ピクセルに設定し、速度を400に設定して[開始]をクリックします。腸上皮細胞特異的GGTase欠損条件マウスは、小腸の組織学的損傷スコアの増加および腸上皮透過性の増加によって示されるように重度の腸病理を発症し、経口投与FITC-dextranを用いたインビボ実験においてトレーサーを介して検出することもできる。細胞脱落事象は、上皮単層から内腔に移動する細胞として同定することができ、上皮の天井の一時的なギャップを引き起こし、最終的に隣接する細胞間の接触によって閉じられる、いわゆるジッパー効果である。
これらのギャップは、コントロールマウスとGGTase欠損マウスの両方で観察されるが、後者ではこれらの現象の頻度が高い。興味深いことに、他の細胞もデキストランを取るように見えます。これらのいわゆる透過性細胞事象は、主に条件付きノックアウトマウスでも発生する。
目的の細胞骨格関連およびタイトな接合タンパク質の免疫染色を行い、生体内顕微鏡検査によって決定される潜在的な上皮透過性破壊に寄与する特定の標的を同定することができる。この方法は、腸内皮漏れや腸内感染の文脈における免疫上皮通信などの腸粘膜の表面上の他の現象の分析に使用することができる。
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概要
このプロトコールでは、生体内の生きた動物において、腸上皮細胞の脱落をリアルタイムで可視化するために生体内顕微鏡法を利用します。この手法により、単一細胞レベルの解像度で腸粘膜のイメージングが可能となり、動的な細胞プロセスの研究が促進されます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 顕微鏡技術
背景
- 生体内顕微鏡法は、生体組織のダイナミクスに関する知見を提供します。
- 腸管透過性の理解は、さまざまな生物学的研究において極めて重要です。
- 細胞脱落は、腸の健康と疾患における重要なプロセスです。
- リアルタイムイメージングは、細胞挙動の研究を促進します。
研究目的
- 生体内における腸管上皮細胞の脱落を可視化する。
- 腸管バリアの透過性障害を特定する。
- 傍細胞経路と細胞通過経路の透過性メカニズムを区別する。
使用した手法
- リアルタイムイメージングのための生体内顕微鏡観察。
- アクリフラビンおよびローダミンB-デキストランを用いた腸粘膜の局所染色。
- 単一細胞分解能を達成するための共焦点顕微鏡観察。
- 透過性を評価するための標準的なトレーサー実験。
主な結果
- 生存腸管組織における細胞脱落の可視化に成功。
- 腸管透過性に影響を与える動的なプロセスの特定。
- 本手法の他の組織への適用可能性を実証。
- イメージングに向けた外科的準備に関する理解の向上。
結論
- このプロトコルは、腸管ダイナミクスを研究するための有用なツールを提供します。
- リアルタイムイメージングにより、細胞プロセスに関する新たな知見が得られる可能性があります。
- 本手法は、さまざまな生物学的コンテキストにおけるさらなる研究を促進することが期待されます。
よくある質問
産業界における重要性
生体内顕微鏡観察（イントラバイタル・マイクロスコピー）により、腸管上皮のダイナミクスをリアルタイムで可視化することが可能となり、生体内におけるバリア機能や細胞脱落の直接的な観察が実現します。このアプローチは、分子レベルの摂動と機能的な透過性の結果を関連付けることで、胃腸管標的バリデーションにおけるメカニズム的なリスク低減を支援します。本手法は、上皮の完全性と修復プロセスに関する定量的かつ空間的に分解されたデータを提供し、前臨床モデルにおける予測の信頼性を向上させます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：遺伝学的または薬理学的介入を、リアルタイムの上皮剥離およびバリア漏出事象と相関させることで、治療仮説を検証します。
- 運用的価値：生体システムにおける腸管透過性障害を直接視覚化することで、機能的なターゲットバリデーションを可能にします。
- 予測的価値：パラセルラー（細胞間）透過性とトランスセルラー（細胞内）透過性のメカニズムを区別し、メカニズムに基づくリスク評価に情報を与えることで、ポートフォリオの優先順位付けを支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：疾患関連モデルにおいて、基底状態の脱落（shedding）および透過性フェノタイプを確立することで、後続のワークフローに向けた検証済み生物学的系を準備します。
- 運用的価値：トレーサーのフラックスおよび細胞脱出イベントの定量的イメージングを通じて、アッセイの標準化と再現性に対応します。
- プラットフォームとしての価値：麻酔下での調製物において動的な腸管プロセスの縦断的モニタリングを可能にすることで、スクリーニングへの適応性とスケールアップの可能性を提示します。
翻訳・前臨床研究
- 科学的価値： 生体内観察を組織学的損傷スコアおよびトレーサーを用いた透過性アッセイと結びつけることで、疾患への関連性とトランスレーショナルバイオマーカーの整合性について論じています。
- 運用上の価値： 上皮修復とバリア機能回復の縦断的評価を可能にすることで、創薬から前臨床検証に至るまでの連続性を記述しています。
- リスク調整後の進展： 透過性細胞イベントおよびジッパー様機序による回復を上皮の回復力の機能的読み取り値として特定することで、予測的なリスク低減価値に焦点を当てています。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲット仮説の検証からリード化合物の同定、そして前臨床検証に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれており、機能的バリアの結果に基づいた胃腸管ターゲットの反復的な最適化を支援します。
- 探索生物学：分子修飾と上皮の脱落およびバリア機能とのリアルタイムな相関を可能にすることで、本手法がどのように仮説検証、パスウェイの解明、または生物学的なリスク低減を支援するかを説明します。
- スクリーニング：標準化されたトレーサーの送達と、腸粘膜を通過するデキストランフラックスの共焦点イメージングを通じて、論文で裏付けられているアッセイの準備状況、再現性、または定量的なアウトプットについて記述します。
- 分析：Zスタック撮影、ライン平均化、および脱落頻度とギャップ形成のタイムラプスイメージングなど、チームが条件比較を行う際に役立つ測定値、リードアウト、または統計的アウトプットを強調します。
- トランスレーショナルリサーチ：条件付きノックアウトモデルにおいて、生体内での脱落イベントを組織学的損傷の増加およびFITC-dextran透過性と結びつけることで、出典が裏付けている場合にのみ、本手法を前臨床の連続性やバイオマーカーの整合性に結びつけます。
- 企業での再利用：腸粘膜以外の様々な組織における他の高度にダイナミックな細胞プロセスへの適用可能性を強調することで、本手法を単一の使用目的のテクニックではなく、再利用可能な能力として位置づけます。
運用およびエンタープライズへの影響
- 科学的価値： 予測精度の向上、ターゲットのバリデーション、メカニズム的な不確実性の低減。
- 運用的価値： 標準化、再現性、およびスケーラビリティ。
- 戦略的価値： Go/No-go判断の適正化、資本効率の向上、および後期的生物学的リスクの低減。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けおよび推進決定。
実施上の留意事項
- 生体内顕微鏡法、外科的処置、および共焦点イメージングに関する専門的な科学的知見が必要です。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡、適切な対物レンズ（20X/40X）、およびシーケンシャル取得機能を備えた装置および解析インフラストラクチャが必要です。
- 染色プロトコル（アクリフラビンおよびローダミンBデキストラン）、Zスタック構成、およびタイムラプスパラメータに関するチーム間での標準化が必要です。
- 細胞型特異的な解析のためのトランスジェニックリポーター系統や条件付きノックアウトモデルを含む、モデルシステム間の適応に関する検討が必要です。
- ソース資料に裏付けられた実用的な制限事項：組織の光学特性、イメージング技術、および顕微鏡の構成によって、作動距離と解像度が決定されます。
