Name: 長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶLarvaSPA法によるショウジョウバエ幼虫の10時間以上の長期生体イメージング。PDMSキューボイドを用いた固定技術で、樹状突起の発達と退化の動態を可視化し、末梢感覚ニューロンの細胞動態を解明する。

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以前のバージョンのLarvaSPAメソッドを確立してくれたリンフェン・タンに感謝します。イメージングチャンバーの以前のプロトタイプを作るためのコーネルオリンホールマシンショップでグレンスワン。金属フレームを構築し、PDMS立方体を作るための提案を提供するためのフィリップ・イザーマン;コーネル BRC 顕微鏡へのアクセスのための施設 (NIH 助成金 S10OD018516)原稿の批判的な読書のためのマリア・サパー。この作品は、H.J.に授与されたコーネル・フェローシップによって支えられ、H.J.に授与されました。C.H.H.J.とC.H.に授与されたコーネルのスタートアップファンドとNIH助成金(R01NS099125とR21OD023824)は、プロジェクトを考案し、実験を設計しました。H.J.が実験を行った。H.JとC.H.は原稿を書いた。

1. イメージングチャンバーの作成
<ol><li>金属フレームは、典型的な機械工場のアルミニウムブロックから構築することができます。フレームの仕様を図 1A に示します。</li>
	<li>イメージングチャンバーを構築するには、長いカバースリップ(22mm×50mm)とUV接着剤(図1A)を使用して金属フレームの底部を密封します。手持ち型のUVランプを使用してUV接着剤を硬化させる。</li>
</ol>2. PDMSの立方体を作る
<ol><li>PDMS立方体の金型を準備します。<ol>
<li>長方形(80mm×55mm)のペトリ皿または丸い細胞培養板の内面に包装テープの層を取り付けます。2番目のインスター幼虫には1層(厚さ0.063mm)、3番目の星内幼虫には2層(厚さ0.126mm)、後期3番目の星幼虫には3層(0.189mm厚)を使用します(図1B)。</li>
		<li>カミソリの刃でテープを特定の幅のストリップに切ります:1層テープの場合は1.5 mm、2層または3層テープの場合は2 mmです。ストリップの幅と厚さは、最終的なPDMS立方体が保持できる幼虫の大きさを決定します。2つのストリップの間に少なくとも5つのmmのスペースを残します。スペースを覆うテープ層を取り外します (図 1B)。</li>
		<li>粘着テープを使用してプレートの内面からほこりを除去します。金型は使用できる状態です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>PDMS ミックスを準備します。<ol>
<li>PDMSベース7gと0.7gの硬化剤(10:1比)を小さな容器に完全に混ぜます。</li>
		<li>容器を真空デシケーターに少なくとも15分間入れ、混合物から空気を取り除きます。</li>
		<li>PDMS混合物を約5.5gゆっくりと金型に注ぎ、厚さ1~2mmに達します(図1B)。</li>
		<li>PDMS混合物を少なくとも15分間真空乾燥器に再び入れ、混合物から残った気泡を除去する。ピペットチップで最後のいくつかの泡を破ります。</li>
		<li>65 °Cの熱インキュベーターで平らな表面でPDMSを2時間硬化させます。</li>
		<li>カミソリの刃を使用して、金型の端に沿って硬化PDMSを緩め、金型から取り外します。PDMS を室温で 2 枚の大きな粘着テープの間に保管します。</li>
		<li>初期と後期の第3インスター幼虫の場合、PDMSを8mm x 2mm x 1mmの立方体に切り取り(図1Bの点線に沿って)、テープストリップ(ステップ2.1.2)によって作成された溝を立方体の長辺の中心に配置します(図1B,C)。2番目の星の幼虫の場合は、立方体を8mm x 1mm x 1mmに切ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 長期経過イメージングのための幼虫の取り付け
<ol><li>取り付け用の上部カバースリップを準備します。<ol>
<li>幼虫の大きさに合った溝を持つ6つのPDMS立方体を選択してください。ステップ 2.1.1、2.1.2、および 2.2.7 に基づいて、推奨される PDMS の溝とサイズに従ってください。</li>
		<li>粘着テープでPDMSの表面からほこりを取り除きます。</li>
		<li>PDMS立方体を後で固定するために、長いカバースリップ(22 mm x 50 mm)に両面テープ(12 mm x 5mm)を4枚取り付けます。両面テープの 2 つの部分の間のスペースは、PDMS 溝の幅と同じにする必要があります。</li>
		<li>各PDMS立方体の溝にUV接着剤の小さな滴(〜1.2 μL)を適用し、カバースリップの両面テープ間のスペースにUV接着剤の6つの小さな滴を追加します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>幼虫を取り付ける準備をします。<ol>
<li>一対の鉗子を使用して、幼虫を水できれいにして、体表面から食べ物を取り除きます。</li>
		<li>蓋をしない小さな(35mm)ペトリ皿に湿らせたティッシュペーパーの小片にきれいな幼虫を置きます。小さなペトリ皿を、乾燥したティッシュペーパーを入れた大きな(60mm)のペトリ皿に入れます。化学フードで、プラスチック製の移入ピペットを使用して、8~12滴のイソファフルラン(160~240 μL)をドライティッシュペーパーに塗布し、大きなペトリ皿の蓋を閉めます。</li>
		<li>幼虫を監視しながら2~3分待ちます。口のフックが動かなくなったら、大きなペトリ皿から幼虫を取り出します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>動物をマウントします。<ol>
<li>動物の後側の構造を画像化するには、カバースリップの両面テープの間のUV接着剤の上に固定された幼虫を置き、後方のキューティクルをカバースリップに向けます。</li>
		<li>各幼虫をPDMSブロックで覆い、幼虫の幹をPDMSの溝に収めます。PDMSの溝の外に幼虫の頭と尾を残します。接着剤で幼虫の尖塔をふさぐのは避けてください。</li>
		<li>PDMSブロックの端を溝に力を加えずに両面テープに押し込みます。幼虫の尾をそっと引っ張ってPDMSの下のキューティクルを平らにします。</li>
		<li>高い設定(約0.07 mW/mm2)で手持ち式のUVランプを使用して、UV接着剤を4分間硬化します。 注意: UVランプを使用している間、安全メガネで目を保護してください。</li>
		<li>カバースリップを上下逆にして、手順 3.3.4 を繰り返します。</li>
		<li>レンズ紙(15mm×30mm)を20μL~30μLの水で湿らせた。湿ったレンズ用紙を撮像室の底部に置きます(図1A,D)。</li>
		<li>幼虫がチャンバーの内側に面するように、カバースリップをチャンバーに置きます。UV接着剤(図1A、D)を使用して、カバースリップの両端を金属表面に接着します。幼虫の側側は共焦点顕微鏡下でイメージングの準備ができています (図 1E)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. イメージング
<ol><li>適切な顕微鏡による幼虫の画像。このプロトコル (図 2、図 3、 ビデオS2、ビデオ S3、ビデオ S4) に示されているすべての結果は、40 x (1.30 NA) オイルの目的を持つ共焦点システムを使用して取得されました。</li>
</ol>5. イメージングチャンバーとPDMS立方体の回収
<ol><li>画像化後、レンズ用紙を使用して上部のカバースリップのオイルを取り除きます。カバースリップとカミソリの刃で金属フレームの間のスペースに切り込んで、トップカバースリップを金属フレームから取り外します。イメージングチャンバーは再利用の準備ができています。</li>
	<li>PDMSの立方体を、上のカバースリップから鉗子で取り外します。粘着性のテープにPDMS立方体を転がして、接着剤の残留物やほこりを取り除きます。PDMSの立方体は再使用の準備ができている。</li>
</ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
<li>Schmid, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+site-specific+changes+of+glutamate+receptor+composition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent site-specific changes of glutamate receptor composition in vivo.</a> Nature Neuroscience. 11 (6), 659-666 (2008).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72 (2), 202-230 (2011).</li>
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<li>Vaadia, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Proprioceptive+System+Dynamics+in+Behaving+Drosophila+Larvae+Using+High-Speed+Volumetric+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Proprioceptive System Dynamics in Behaving Drosophila Larvae Using High-Speed Volumetric Microscopy.</a> Current Biology. 29 (6), 935-944 (2019).</li>
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<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of Drosophila larval neuromuscular junction morphology.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 490-493 (2012).</li>
<li>Andlauer, T. F., Sigrist, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+Drosophila+larval+neuromuscular+junctions+to+study+synapse+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of Drosophila larval neuromuscular junctions to study synapse assembly.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (4), 407-413 (2012).</li>
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<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nature Protocols. 2 (12), 3285-3298 (2007).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+depresses+glutamate+release+by+reducing+neuronal+excitability+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane depresses glutamate release by reducing neuronal excitability at the Drosophila neuromuscular junction.</a> The Journal of Physiology. 558, Pt 2 489-502 (2004).</li>
<li>Sandstrom, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isoflurane+reduces+excitability+of+Drosophila+larval+motoneurons+by+activating+a+hyperpolarizing+leak+conductance%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Isoflurane reduces excitability of Drosophila larval motoneurons by activating a hyperpolarizing leak conductance.</a> Anesthesiology. 108 (3), 434-446 (2008).</li>
<li>Chaudhury, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+chip+cryo-anesthesia+of+Drosophila+larvae+for+high+resolution+in+vivo+imaging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">On chip cryo-anesthesia of Drosophila larvae for high resolution in vivo imaging applications.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2303-2322 (2017).</li>
<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+regulate+repulsion-mediated+dendritic+patterning+of+drosophila+sensory+neurons+by+restricting+dendrites+in+a+2D+space%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space.</a> Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).</li>
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<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
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<li>Han, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cells+are+the+primary+phagocytes+in+the+fragmentation+and+clearance+of+degenerating+dendrites+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila.</a> Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Drosophila+sensory+neuron+axons+and+dendrites+is+regulated+by+the+Akt+pathway+involving+Pten+and+microRNA+bantam%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Development%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam.</a> Genes, Development. 26 (14), 1612-1625 (2012).</li>
<li>Stone, M. C., Albertson, R. M., Chen, L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendrite+injury+triggers+DLK-independent+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dendrite injury triggers DLK-independent regeneration.</a> Cell Reports. 6 (2), 247-253 (2014).</li>
<li>Sapar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+Externalization+Results+from+and+Causes+Neurite+Degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine Externalization Results from and Causes Neurite Degeneration in Drosophila.</a> Cell Reports. 24 (9), 2273-2286 (2018).</li>
<li>Xiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).</li>
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<li>Low, R. J., Gu, Y., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+resolution+optical+access+to+brain+regions+in+fissures%3A+imaging+medial+prefrontal+cortex+and+grid+cells+in+entorhinal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cellular resolution optical access to brain regions in fissures: imaging medial prefrontal cortex and grid cells in entorhinal cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18739-18744 (2014).</li>
</ol>

著者らは競合する利益を宣言していない。

ここでは、長期経過イメージングのために生きたショウジョウバエ幼虫を取り付ける汎用性の高い方法であるLarvaSPAについて説明します。この方法は幼虫の回復や再装着を必要とせず、中断のないイメージングを可能にする。従って、樹状変性や再生など、完了までに数時間かかる生物学的プロセスを追跡するのに理想的です。この方法は、細胞内カルシウムの動態や微小管の成長などの細胞内事象のイメージングにも使用できます。幼虫の体壁がイメージング中に安定しているので、空間的および時間的な解像度は、手元のイメージングアプリケーションに合わせて調整することができます(例えば、細胞内小胞の動きが速いを追跡したり、神経枝パターンのゆっくりとした全体的な変化を監視する)。また、この方法は、様々な発達段階で幼虫と互換性があり、特別な装置を必要としません。したがって、LarvaSPAは、多様な質問に対処するために多くのショウジョウバエラボで潜在的に使用することができます。
PDMS立方体の性質や幼虫の発達段階など、この方法の成功に影響を与える因子<br...

タイムラプスライブイメージングは、動的細胞プロセスを研究するための強力な方法です。タイムラプス映画によって提供される空間的および時間的情報は、細胞生物学の質問に答えるために重要な詳細を明らかにすることができます。ショウジョウバエ幼虫は、その透明な体壁が内部構造1、2の非侵襲的なイメージングを可能にするので、ライブイメージングを使用した調査のための人気のインビボモデルとなっています。さらに、ショウジョウバエでは解剖学的構造および高分子を蛍光標識する多数の遺伝的ツールが利用可能である。しかし、ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化は困難である。静止した初期胚や子犬とは異なり、ショウジョウバエ幼虫は絶えず動き、ライブイメージングのために固定化が必要である。生きたショウジョウバエ幼虫を固定化する有効な方法は、クロロホルム4でハロカーボン油に取り付けること、イソフルランまたはジクロルボス溶液5を用いた麻酔、およびカバースリップと顕微鏡スライド6との間の圧縮を含む。これらの方法のいくつかは顕微鏡検査に使用されてきたが、いずれも長期のライブイメージングに有効ではない。他の方法は、従来の共焦点顕微鏡または光シート顕微鏡7、8、9を用いて幼虫をクロールする際の身体壁ニューロンのイメージングのために開発された。しかし、これらの方法は、幼虫の動きによる細胞動態のモニタリングには理想的ではありません。
ショウジョウバエ幼虫の長期経過画像化を達成するための新しい方法が開発されました。ポリジメチルシロキサン(PDMS)の「幼虫チップ」を使用すると、ショウジョウバエ幼虫は麻酔なしで特殊なマイクロチャンバーで真空発生吸引を通して効果的に固定化することができる。しかし、この方法は、細胞生物学の研究のための高い時間分解能を提供していないし、それは動物のサイズ10に厳しい制限を有する。麻酔装置を用いた別の方法は、ショウジョウバエ幼虫のライブイメージングを複数の時点で達成し、神経筋接合部11、12、13、14、15、16の研究に応用されている。しかしながら、この方法は、30分を超える連続イメージングを可能にせず、デスフルランを繰り返し使用する必要があり、これは神経活動を阻害し、研究された生物学的プロセスに影響を及ぼす可能性がある17,18である。近年、微小流体装置と凍結麻酔を組み合わせた新しい方法が、短時間(分)19の間、様々なサイズの幼虫を固定化するために使用されている。しかし、この方法は、冷却システムなどの特殊なデバイスを必要とし、固定化の長い期間は、幼虫の繰り返し冷却を必要とします。
ここでは、10時間以上の時間経過画像化と互換性のあるショウジョウバエ幼虫を固定化する汎用性の高い方法を紹介します。この方法は「部分的な取り付けによる幼虫の安定化」(LarvaSPA)と呼び、幼虫のキューティクルをカスタムメイドのイメージングチャンバーでのイメージング用のカバースリップに付着することを含む。このプロトコルは、イメージングチャンバーを作る方法と、様々な発達段階で幼虫を取り付ける方法を説明します。LarvaSPA法では、UV反応性接着剤を使用して、所望のボディセグメントをカバースリップに貼り付けます。PDMS立方体はさらに幼虫に圧力をかけ、脱出を防ぐ。撮像チャンバー内の空気と水分は、イメージング中に部分的に固定化された幼虫の生存を保証します。他の技術よりもLarvaSPAの利点は次のとおりです:(1)それは高い時間的および空間的解像度で何時間も無傷のショウジョウバエ幼虫の連続的なライブイメージングを可能にする最初の方法です。(2)この方法は幼虫のサイズに対する制限が少ない。(3)イメージングチャンバーとPDMS立方体は、最小限のコストで製造することができ、再利用可能です。
幼虫の取り付け方法を説明することに加えて、ショウジョウバエ樹状樹状樹状樹状(da)ニューロンの樹状突起発生および樹状変性を研究するためのその応用例をいくつか紹介する。

<table><tbody><tr><td>6061アルミバー</td><td>マクマスター</td><td>カー9246K421</td><td></td></tr><tr><td>3M両面テープ</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>16093</td><td></td></tr><tr><td>3M スコッチ包装テープ</td><td>3M</td><td></td><td>1.88"W x 22.2 ヤード</td></tr><tr><td>DUMONT #3 鉗子</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-241-34</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>アゼルサイエンティフィ</td>ック <td>1152250</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>中西部獣医供給</td><td>193.33161.3</td><td></td></tr><tr><td>ライカ共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SP8 共振器を装備スキャナー</td><td></td></tr><tr><td>レンズ紙</td><td>バーク</td><td>シャーLN90.0406.24</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ(中)</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ(小)</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td></td></tr><tr><td>かみそりの刃</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>121-20</td><td></td></tr><tr><td>長方形ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-322</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 キット (PBMS キット)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>Transferring pipette</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1371126</td><td></td></tr><tr><td>UV glue</td><td>Norland products</td><td>#6106, NOA 61</td><td>Refractive Index 1.56</td></tr><tr><td>UV lamp (Workstar 2003)</td><td>Maxxeon</td><td></td><td></td>MXN02003</tr><tr><td>真空デシケーター</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>71232</td><td></td></tr><tr><td>ワイプ</td><td>キンバリークラーク</td><td>キワイプ</td><td></td></tr></tbody></table>

長期経過イメージング用のショウジョウバエ幼虫の取り付け方法

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

ライブイメージングは、細胞生物学の問題を調査するための貴重なアプローチです。ショウジョウバの幼虫は、幼虫の体壁とほとんどの内臓が透明であるため、生体内のライブイメージングに特に適しています。しかし、30分を超えて無傷のショウジョウバエ幼虫の連続的なライブイメージングは、幼虫を長時間非侵襲的に固定固定化することが困難であるため困難であった。ここでは、高時間的および空間的分解能を有する生きたショウジョウバエ幼虫を10時間以上連続的にイメージングできるLarvaSPAと呼ばれる幼虫取り付け方法を紹介する。この方法は、UV反応性接着剤を使用してカバースリップに幼虫を部分的に取り付け、さらにポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロックを使用して幼虫の動きを抑制することを含む。この方法は、第二のインスターから放浪第三のインスターまでの発達段階での幼虫と互換性があります。我々は、デンドライトの成長および傷害誘発性の樹状皮質変性を含むショウジョウバエ体体性体性感覚ニューロンの動的プロセスを研究する上で、この方法の応用を実証する。この方法は、幼虫の体壁の近くで起こる他の多くの細胞プロセスを研究するためにも適用することができます。

幼虫のイメージ投射室は、カスタムメイドの金属フレームと2つのカバースリップを一緒に接着することによって構築されます。金属フレームの設計は、図1Aに指定されています。チャンバー内のショウジョウバエ幼虫は、UV接着剤とPDMS立方体の助けを借りてトップカバースリップに接着されます。PDMS立方体の溝と、立方体が取り付けられた両面テープは、幼虫を保持するスペースを作り出す(図1B、C)。PDMSはまた幼虫の体壁を平らにし、物理的に幼虫の動きを制限するために穏やかな圧力を加える。最後に、湿ったレンズ紙の小片は湿気を提供するために部屋の底に置かれる。このセットアップは連続的なイメージ投射のために10時間より長くショウジョウバエの幼虫を固定化できる。動物のほとんどは10時間後に生きており、膿期に成長するために回復することができる。撮像室は、一度に9匹までの幼虫を収容することができる。図1Dは、チャンバーに搭載された6つの後期第3の星内幼虫を示す。...

このプロトコルは、ドロショウジョウバエ幼虫を取り付け、無傷の生きている動物における10時間以上の中断のないタイムラプス画像を達成する方法を記載している。この方法は、幼虫の身体壁に近い多くの生物学的プロセスを画像化するために使用することができる。

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

幼虫は、高い時間的および空間分解能で10時間以上の無傷のショウジョウバ幼虫の連続的なライブイメージングを可能にする最初の方法です。この方法は、幼虫末梢感覚ニューロンの動的な細胞プロセスを明らかにし、幼虫の体壁の近くで起こる他の多くの細胞プロセスを研究するために使用されます。この方法は使いやすく、幼虫のサイズに関する制限は少ない。6~9匹の幼虫を同時にイメージングチャンバーに取り付けることができ、実験が可能になります。PDMS立方体の撮像室は最低の費用で製造することができ、再利用可能である。この方法は、ショウジョウバ幼虫樹状承認ニューロンを用いた樹状突起発生および樹状変性のメカニズムを研究するのに特に有用である。同じニューロンを何時間も画像化できることは、樹状パターンの長期的な世界的変化が個々の分岐レベルでの短期的な行動からどのように生じるかを明らかにすることができる。幼虫の大きさに合ったPDMS立方体を使用すると、幼虫を固定化する成功率が高まります。トラブルシューティングのセクションで、より役立つテープをご覧ください。機械工場からアルミブロックを作った後、UV接着剤で長いカバースリップを使用して金属フレームの底部を密封します。30秒間、ハンドヘルドUVランプを使用してUVの手がかりを治してください。包装テープの層を、長方形のペトリ皿または丸い細胞培養プレートの内面に取り付けます。2番目の星内幼虫に1つの層、初期の3番目の星内幼虫のための2つの層、または後期3番目の星内幼虫のための3つの層を使用してください。カミソリの刃で特定の幅のトリップにテープをカットし、1層テープの場合は1.5ミリメートル、2層または3層テープの場合は2ミリメートルに切ります。2つのストリップの間に少なくとも5ミリメートルのスペースを残します。スペースをカバーするテープ・レイヤーを取り外します。粘着テープを使用してプレートの内面からほこりを取り除きます。その後、金型は使用する準備ができています。PDMSミックスを調製するには、7グラムのPDMSベースを0.7グラムの硬化剤に十分に混ぜ合わせます。容器を真空デシケーターに少なくとも15分間置き、混合物から空気を取り除きます。約5.5グラムのPDMS混合物を金型にゆっくりと注ぎ、1〜2ミリメートルの厚さに達します。PDMS混合物を真空デシケーターに再び15分間置き、残りの気泡を混合物から除去する。ピペットチップで最後のいくつかの泡を破ります。65°Cの熱インキュベーターで平らな表面にPDMSを2時間硬化させます。次に、カミソリの刃を使用して、金型の端に沿って硬化したPDMSを緩め、金型から取り外します。PDMSを室温で2枚の大きな粘着テープの間に保管します。早期および後期の3番目の星内幼虫の場合は、テープストリップによって作成された溝を立方体の長い側の中央に配置して、PDMSを8に2mmずつ切ります。2番目の星次幼虫の場合は、立方体を1ミリメートルずつ8に切ります。取り付け用の上部カバースリップを準備するには、幼虫のサイズに一致する溝を持つ6つのPDMS立方体を選択します。粘着テープでPDMSの表面からほこりを取り除きます。後でPDMS立方体を固定するために22×50ミリメートルの長いカバースリップに12×5ミリメートルのサイズで両面テープの4枚を取り付けます。両面テープの2枚の間のスペースをPDMS溝の幅と同じに調整します。各PDMS立方体の溝にUV接着剤の小さな滴を適用し、カバースリップの両面テープの間のスペースにUV接着剤の6つの小さな滴を追加します。幼虫を取り付けるための準備をするには、一対の鉗子を使用して、水中の幼虫を洗浄して体表面から食物を除去する。清潔な幼虫を湿らせたティッシュペーパーの小片に蓋をせずに小さなペトリ皿に置き、小さなペトリ皿を乾燥したティッシュペーパーを含む大きなペトリ皿に入れます。化学フードでは、プラスチックトランスファピペットを使用して、160〜240マイクロリットルのイオブルランを乾燥したティッシュペーパーに塗布し、大きなペトリ皿の蓋を閉めます。幼虫を監視しながら2〜3分待ちます。彼らの口のフックが動かなくなったら、大きなペトリ皿から幼虫を取り出します。固定化した幼虫をカバースリップの両面テープの間のUV接着剤の上に置き、後側キューティクルをカバースリップに向けます。各幼虫をPDMSブロックで覆い、幼虫の幹をPDMSの溝に収めます。PDMS溝の外に幼虫の頭部と尾部を残します。接着剤で幼虫のスパイクルをブロックしないでください。PDMSブロックの端部を溝に力を加えずに両面テープに押し込みます。幼虫の尾をそっと引っ張ってPDMSの下のキューティクルを平らにします。安全メガネを着用し、ハンドヘルドUVランプを使用して、高い設定で4分間UV接着剤を硬化させます。カバースリップを逆さまに反転し、UVランプを使用してさらに4分間UV接着剤を硬化させます。15×30ミリメートルのサイズの小さなレンズ用紙を撮像室の底に置きます。20~30マイクロリットルの水で紙を湿らせ。幼虫がチャンバーの内側に向かるように、カバースリップをチャンバーに置きます。カバースリップの両端を金属表面に接着するには、UV接着剤を使用します。幼虫の後側は共焦点顕微鏡の下でイメージ作成する準備ができている。イメージング後、レンズペーパーを使用して上部カバースリップのオイルを取り除きます。カバースリップと金属フレームの間のスペースにカミソリの刃で切り取って、金属フレームから上部カバースリップを取り外します。イメージの部屋は再利用の準備ができている。PDMS立方体を鉗子で上部カバースリップから取り外します。粘着テープにPDMS立方体を転がして、糊残りやほこりを取り除きます。PDMSの立方体は再利用の準備ができています。このプロトコルでは、ショウジョウバエ幼虫を10時間以上固定化し、連続的なイメージングを行った。この図は、チャンバーに取り付けられた6つの後期3番目の星内幼虫を示しています。幼虫の幹は、頭と尾が自由に動いている間に固定されました。ここでは、クラス4のDAニューロンをモデルとして用いた神経樹状変性と神経変性の研究におけるLarvaSPAの応用を示す。この方法で幼虫を正常に固定化するには、口のフックが動かなくなったら幼虫をイソフルランにさらし、幼虫が完全に目を覚ます前に紫外線接着剤を治すことは重要です。樹状突起変性および再生を研究するために、幼虫がイメージングチャンバーに固定化されたときにレーザー傷害を行うことができる。LarvaSPAは、肝細胞プロテオグリカンのような表皮細胞の内皮細胞に動的に成長する樹状突起がいかに不安定であるか、レーザー損傷後に変性樹状突起にホスファチジルセリンがどのように露出しているかを理解するのに役立ちました。UVランプを使用しながら、安全メガネで目を保護します。イオブルランを使用して幼虫をノックアウトすることは、ヒュームフードで行われるべきです。

larvaspa-method-for-mounting-drosophila-larva-for-long-term-time

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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